專利名稱：胃泌素釋放肽導向融合蛋白的制作方法
技術領域：
目前治療癌癥有許多手段，其中包括手術、放療和化療等，手術是非常有效的一種手段，但受到病種和病程的限制，很多情況下都無法應用，放化療是治療癌癥最常見的手段，但其副作用很大，效果不盡如人意，所以人們試圖找出一種副作用小并且高效的生物治療方法來替代放化療法。本發明涉及到一種融合蛋白，以胃泌素釋放肽為融合蛋白導向部分，能夠特異性地與過量表達胃泌素釋放肽受體的腫瘤細胞相結合，以假單胞桿菌外毒素A的缺失體 PE40,并且其C末端5個氨基酸突變為Lys-Asp-Glu-Leu，即為PE40KDEL作為融合蛋白效應部分，特異性地殺死腫瘤細胞。
二.
背景技術：
1.本項目融合蛋白的導向部分胃泌素釋放肽(GRP)胃泌素釋放肽(gastrin releasing peptide, GRP)是蛙皮素樣肽的同系物.，是一種胃腸道激素的有效的促分泌素或調節肽，是正常人腦、胃的神經纖維以及胎兒肺的神經內分泌組織中存在的激素，許多小細胞肺癌細胞株和腫瘤組織中也分泌GRP，且富含GRP 受體(GRPR)。(胃泌素釋放肽前體融合蛋白的制備及其在腫瘤研究中的應用。中國藥物與臨床，2007 年 11 期，828-831)目前的研究表明，胃泌素釋放肽受體在許多人類腫瘤細胞中產生高表達，如肺癌、 消化道癌和婦科癌中，胃泌素釋放肽受體屬于G蛋白藕聯受體，其在腫瘤組織中過量表達， 對腫瘤組織具有重要的生長效應，并且其在腫瘤的發生、發展和浸潤等方面發揮了重要作用。(胃泌素釋放肽受體在婦科腫瘤中的研究進展。國際生殖健康/計劃生育雜志，2010， V29(l) :828-831)2.本項目融合蛋白的毒素部分PE40KDEL假單胞桿菌外毒素A (PEA)是一種多肽毒素，它通過和靶細胞表面的PEA受體結合進入細胞，催化延長因子2 (EF-2)的ADP核糖基化，阻止蛋白質合成，而導致細胞死亡。PEA 分子由3個部分組成，包括受體結合結構域、轉位(跨膜)結構域和活性結構域。為了消除PEA與細胞的非特異性結合，我們將PEA分子的受體結構域去除，即去除PEA分子N末端 1-252位氨基酸后，得到了 PE40分子，然后我們將PE40分子的C末端5個氨基酸進行突變， 突變為Lys-Asp-Glu-Leu，得到了活性更高的毒素部分，PE40KDEL。3.導向部分與毒素部分的連接通過5肽(-His-Met-Ala-Glu-Glu-)將兩部分通過肽鍵連接起來，順序為導向部分(GRP)-5肽-毒素部分(PE40KDEL)，融合蛋白序列見SEQ ID NOl。4.本發明融合蛋白的特點基于前面所述，胃泌素釋放肽受體在許多人類腫瘤細胞中產生高表達，如肺癌、 消化道癌和婦科癌中，其在腫瘤組織中過量表達，對腫瘤組織具有重要的生長效應，并且其在腫瘤的發生、發展和浸潤等方面發揮了重要作用。所以目前有很多報道是針對胃泌素受體進行腫瘤治療的，包括使用GRP的類似物與紫杉醇藕聯，GRP與單鏈抗體相連，(胃泌素釋放肽受體在腫瘤治療中的研究進展。世界華人消化雜志，2009年，V17(l) :63-67) GRP與光標記或者金屬螯合劑藕聯(改進的胃泌素釋放肽化合物。中國專利，申請號 200710188657. 5)。這些技術在針對腫瘤治療存在了一定的局限性，比如，GRP與紫杉醇等化療藥相藕聯，由于其藕聯方式的問題，化療藥容易脫落，造成藥物失效，并且化療藥由于不具有選擇性，在整體藥物到達腫瘤部位之前容易侵害正常細胞；其次，GRP與單鏈抗體相連，由于單鏈抗體的作用沒有全抗體的作用強，所以其僅僅起到抑制腫瘤細胞的作用，而由于腫瘤細胞增殖的快速性，無法起到有效控制腫瘤的目的；GRP與光標記或者金屬螯合劑藕聯，目前主要是作為診斷來使用，作為治療手段無法高效地殺死腫瘤細胞。通過本發明有效地解決了上述各種方法的缺點，本發明是使用GRP作為導向， PE40KDEL作為毒素部分，能夠高效地殺死腫瘤細胞。由于二者是通過5肽肽鍵進行相連，所以不會有藥物脫落的問題；并且毒素部分只有在進入腫瘤細胞后，才能夠發揮殺死細胞的作用，而正常細胞表面沒有GRP受體或含量極低，所以其對于正常細胞的毒性非常小，而是特異性殺死腫瘤細胞，并且由于PE40KDEL殺死腫瘤細胞的高效率，作為治療手段能夠控制腫瘤的發展。本專利發明了一類新型導向藥物，是選擇GRP以及細胞毒素的小功能片段組成的融合蛋白導向藥物，其具有分子量小，用量少和特異性強等特點。
三.

發明內容
本專利中的藥物導向部分包括GRP，針對效應部分我們將PEA分子的受體結構域去除，即去除PEA分子N末端1-252位氨基酸后，得到了 PE40分子，然后我們將PE40分子的C末端5個氨基酸進行突變，突變為Lys-Asp-Glu-Leu，得到了活性更高的毒素部分， PE40KDEL。通過5肽(-His-Met-Ala-Glu-Glu-)將兩部分通過肽鍵連接起來，順序為導向部分(GRP)-5肽-毒素部分(PE40-KDEL)，融合蛋白氨基酸序列見SEQ ID NOl。作為本發明中的融合蛋白，是一類自然界沒有的人工蛋白，其特征為GRP和 PE40KDEL組成的融合蛋白，可以使用一種具有序列表中SEQ ID NOl的序列，也可以使用對序列表SEQID NOl中融合蛋白的氨基酸序列加以修飾，如插入，缺失，突變某個或某些氨基酸而得到的序列，只要基本保持原分子的生物活性即可。換句話說，也可以使用采用其氨基酸序列大體上與序列表SEQ ID NOl中融合蛋白氨基酸序列相同的蛋白，即使用氨基酸序列具有大于等于90%序列同一性的變體或其功能性片段。本發明的另一方面，涉及一種藥物組合物，其含有本發明所述的融合蛋白，以及任選的藥物上可接受的載體。在本發明知，術語“藥物上可接受的”意味著制藥領域公認的可用于動物，更特別的是可用于人的。術語“載體”指稀釋劑、佐劑(例如(完全或不完全)弗氏佐劑)、賦形劑、或用于容納或施用治療劑的介質。這些藥用載體可以是無菌液體，諸如水和油，包括源自石油、動物、植物、或合成的油，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油、諸如此類。靜脈內施用藥用組合物時，水是優選的載體。鹽水溶液以及水性右旋糖和甘油溶液也可用作液態載體，特別是用于可注射溶液。合適的藥用賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油、滑石、氯化鈉、奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇、諸如此類。如果需要， 組合物還可以包含較少數量的潤濕或乳化劑如透明質酸鈉，或是PH緩沖劑。這些組合物可以采取溶液、懸浮液、乳狀液、片劑、丸劑、膠囊粉劑、緩釋配方、諸如此類的形式。在本發明的一個實施方案中，所述藥物組合物為凍干注射劑形式，其中含有 0. 01% -0. 2%的融合蛋白，以及5%的甘露醇，以及藥物上可接受的載體。本領域普通技術人員知曉，所述融合蛋白可以通過基因重組表達的方法或者化學合成的方法制備。在本發明中，所述融合蛋白是通過基因工程重組表達的方法獲得的。實例一重組融合蛋白質粒的構建和工程菌的獲得以設計好的SEQ ID NOl氨基酸序列為模板，根據中心法則，選擇大腸桿菌偏好的密碼子，得到融合蛋白的所對應的核酸序列，再使用全基因合成技術得到上述目的基因片段。通過本領域普通技術人員知曉的重組技術獲得重組基因載體PUC-GRP2，對插入載體的基因片段進行序列測定。驗證其基因序列的正確性后，擴增保存，從該載體上切取下目的基因片段，插入表達載體中，重組質粒命名為PGRP2。然后用CaC12法轉化大腸桿菌BL21DE3， 涂布在含有抗生素的篩選平板培養基表面，挑選陽性菌落在液體培養基中培養至0D600為 0. 6-0. 8時加入IPTG 1. OmM誘導3-4小時離心收集菌體，8M尿素破菌后12% SDS-PAGE電泳時出現一條明顯的蛋白表達帶，表達量為40%。經天然型PE的單克隆抗體免疫印跡檢定， 顯示陽性反應，再把重組表達載體導入表達宿主菌中，經培養表達，疏水層析和離子交換層析得到目的蛋白GRP-PE40KDEL，用MTT細胞測活法測定GRP-PE40KDEL的殺傷腫瘤細胞的活性，所獲得的高效表達融合蛋白的工程菌命名為PGRP2/BL21DE3。實例二目的蛋白的表達1)搖瓶表達將如上述制備的基因工程菌PGRP2/BL21DE3，在LB培養基中搖瓶過夜培養(37°C，200rpm)，再按體積比1 30接種至LB培養基中，37°C培養3小時后，加入 0. ImMIPTG誘導4小時。收集菌體經SDS-PAGE電泳分析，發現融合蛋白(43KD)以可溶性表達為主，表達量占菌體總蛋白的40%。2)大規模發酵表達a.培養基組成a)種子液培養基(LB)胰蛋白胨10克/升、酵母粉5克/升、氯化鈉10克/升。b)上罐培養基(15升)磷酸氫二鈉250克、磷酸二氫鉀110克、氯化鈉13.克、氯化銨30克、胰蛋白胨120克。以上成分一起在罐中滅菌；下面的成分單獨滅菌后加入發酵罐。硫酸鎂30克、葡萄糖450克、補料(500克/升)葡萄糖。發酵及誘導表達i)種子培養從已鑒定的平皿上劃取菌種，接種到50毫升Q50毫升的三角瓶)LB中，36°C、200 轉/分、8小時后將這50毫升種子液轉接到700毫升LB中，36°C、200轉/分，培養過夜。ii)發酵及誘導表達過程
將培養好的種子液(0D600 = 5-8)加入罐中，調好各參數，36 °C、150轉、溶氧 100%,開始發酵；5小時后開始以2. 5速流加2小時，約加入800毫升補料，加入0. 5克IPTG 誘導(五小時)。實例三目的蛋白純化(1)疏水層析采用疏水層析介質(Octyl Sepharose 4Fast Flow)，平衡液A采用25mM Tris-HCl，pH8，IM硫酸銨，平衡后，裂菌的離心上清上樣(補硫酸銨至1M)，用A平衡5個柱體積后，線性梯度洗脫，0-20個柱體積，1-0. IM硫酸銨，收集融合蛋白峰。(2)陰離子交換層析采用Source 30Q陰離子交換層析介質，平衡液A為25mM Tris-HCl，pH8，平衡，上一步得到的樣品用水稀釋4倍上樣，平衡，線性梯度洗脫，0-20個柱體積，0-0. 5M NaCl，收集目的融合蛋白峰。(3)陰離子交換層析采用 Q Sepharose High Performance 層析介質，平衡液為 20mM PB, pH7. 4，上一步得到的樣品用水稀釋3倍進行上樣，平衡后采用20mM PB，pH7.4，0-lM NaCl，0_10個柱體積的梯度洗脫，收集目的蛋白洗脫峰。實例四活性測定(MTT法)用MTT比色法測定細胞增殖中活細胞的數目，以此確定融合蛋白殺傷各種腫瘤細胞的活力，所選的腫瘤細胞包括SPC (人肺腺癌細胞)、MGC (人胃癌細胞)、PC-3(人前列腺癌細胞)和A549(人肺癌細胞)。取96孔細胞培養板3塊，每孔接種細胞數為IX 104、每塊培養板每種細胞重復接種20個孔，37°C、5% C02條件下培養，然后分別加入等比稀釋的融合蛋白樣品，繼續培養對，48及7 后，每孔加5g/L MTT 20 μ 1再培養4h，然后去上清液加入二甲亞砜200 μ 1，將培養板放在微量振蕩器上振蕩lOmin，待MTT被細胞還原形成甲顆粒完全溶解后，立即用酶標儀、波長570nm測定其吸光度，然后通過標準計算公式計算出目的蛋白活性。上述實驗重復3次，計算其平均IC50值。結果見表1，表1.實例中的融合蛋白細胞活性
權利要求
1.一種基因工程融合蛋白，具有SEQ ID NOl所示的氨基酸序列。
2.一種多核苷酸序列，其編碼如權利要求1所述的融合蛋白。
3.權利要求1中的融合蛋白為主要成分的藥物組合物，主要攻擊胃泌素釋放肽受體異常表達的各類腫瘤細胞。
4.權利要求3中的重組載體的宿主細胞包括細菌、酵母和哺乳動物細胞。
5.權利要求1中的融合蛋白，是使用基因工程重組表達載體經過轉化、發酵和純化而得到。
全文摘要
本發明涉及一種可以定向殺死腫瘤細胞的融合蛋白，是由胃泌素釋放肽(GRP)組成的導向部分和由細胞毒素組成的效應部分構成，具有定向到達并殺死過量表達GRP受體的腫瘤細胞的特性。
文檔編號A61K47/48GK102250252SQ20101017337
公開日2011年11月23日 申請日期2010年5月17日 優先權日2010年5月17日
發明者李詠梅, 李樹民, 莘旭妮 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所