一種具有腫瘤主動靶向及pH敏感性細胞穿膜能力的新型多肽的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種既能主動靶向腫瘤細胞高表達的整合素受體，同時又能高效介導入胞的新型多肽。所述的新型多肽TR（c(RGDfK)- AGYLLGHINLHHLAHL(Aib)HHIL-Cys）是由特異性靶向整合素受體的環狀RGD肽（c(RGDfK)） 和非特異性的pH敏感性細胞穿膜肽TH(AGYLLGHINLHHLAHL(Aib)HHIL-Cys)通過共價鍵連接而成。將該新型多肽TR修飾于載藥系統表面，其能介導載藥系統更加高效地傳遞到腫瘤內部，從而更加有效地治療腫瘤。
【專利說明】一種具有腫瘤主動靶向及pH敏感性細胞穿膜能力的新型多肽

【技術領域】
[0001]本發明涉及藥物制劑【技術領域】。具體地說，本發明涉及一種既有主動靶向腫瘤細胞高表達的整合素受體的能力又具有pH敏感性細胞穿膜能力的新型多肽。該新型多肽經修飾于載藥系統表面用于介導載藥系統高效主動靶向高表達整合素受體的腫瘤及高效介導其入胞，達到提高腫瘤治療效果的目的。

【背景技術】
[0002]1.癌癥的發病率和死亡率近年來呈逐年上升的趨勢，已經嚴重威脅了人類健康。盡管有多種治療癌癥的手段，但目前最為常用的仍然是化療。由于化療藥物往往在正常組織和腫瘤組織間缺乏選擇性，因此其治療效果和應用范圍常受到限制。目前，納米載藥系統的發展給祀向腫瘤治療帶來新的突破。
[0003]2.相對于普通的載藥系統，特異性配體修飾的載藥系統增加了其在腫瘤部位的蓄積，同時降低了在非靶向性器官中的蓄積(如肝，脾等)。其中，整合素(integrin)是一類細胞黏附受體分子，在所有的有核細胞表面均廣泛表達，其在體內能夠介導細胞與細胞之間，以及細胞與細胞外基質的互相黏附。整合素是由α和β亞基通過非共價鍵結合形成的異二聚體，在脊椎動物體內，整合素有18種α亞基和8種β亞基，其可以組成約24種不同的異二聚體結構。其中整合素ανβ3在神經膠質瘤、黑色素瘤、卵巢癌等多種腫瘤細胞及腫瘤相關的內皮細胞表面高度表達，與腫瘤的血管發生、腫瘤轉移及腫瘤的抗放射治療密切相關。因此，整合素ανβ3常被用作腫瘤靶向的特異性靶點。已有研究證實，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)的三肽序列能夠特異性識別含α ν亞基的整合素家族。進一步的研究也已證實，具有環狀結構的R⑶能夠高度地與整合素ανβ3、ανβ5結合。然而，特異性配體(如RGD、Tf等)雖能主動靶向高表達相關受體的腫瘤細胞，但受制于優于受體的飽和效應不能高效地介導載藥系統進入腫瘤細胞。
[0004]3.另一方面，細胞穿膜肽(cell-penetrating peptides, CPPs)是一類具有很強的穿透細胞膜能力的短肽。穿膜肽在生理條件下帶有正電荷，它既可以從生物體內提取，也可以通過人工合成。目前，細胞穿膜肽已經成功地應用于蛋白、多肽、核苷酸及小分子物質的遞釋，這類載藥系統的優勢在于穿膜效率高。但因為其本身具有下述兩個特征而不能廣泛地被使用:①細胞穿膜肽帶正電荷的特性使得其在血液循環過程中容易與調理蛋白結合從而使所介導的載藥系統快速地被網狀內皮系統清除；②細胞穿膜肽在正常的組織以及腫瘤之間不具有選擇性。
[0005]4.相對于正常的細胞，腫瘤細胞是一種快速增長的細胞，在生長過程中需要消耗大量的氧氣和營養，產生過剩的乳酸，導致腫瘤部位的PH偏酸。另外，正常組織中的微血管內皮間隙致密、結構完整，載藥系統不易透過血管壁，而實體瘤組織中血管豐富、血管壁間隙較寬、結構完整性差，淋巴回流缺失，造成載藥系統具有選擇性高通透性和滯留性，這種現象被稱作實體瘤組織的高通透性和滯留效應，簡稱EPR效應。
[0006]5.為屏蔽穿膜肽的正電性，最新的研究利用組氨酸的修飾使穿膜肽獲得pH敏感性。在B1materials [34 (2013) 7980-7993]雜志上，本課題組介紹了一種腫瘤微環境敏感的TH肽修飾的脂質體在治療腫瘤方面的應用。TH肽上的組氨酸的等電點Ip約為6.5，因此TH肽修飾的脂質體在血液循環中(pH7.4)帶負電荷從而延長了 TH肽修飾的脂質體在血液中的循環時間；當通過EPR效應被動靶向蓄積到腫瘤部位時，在腫瘤的微酸環境中(pH6.2~pH6.8)TH肽中的組氨酸被質子化而帶正電荷，使得TH肽在微酸環境中恢復穿透細胞膜的能力，即轉變為激活的細胞穿膜肽。TH肽的上述特性增強了 TH肽修飾的脂質體在腫瘤部位的蓄積以及進入腫瘤深部的能力。然而，在腫瘤部位具有較強細胞穿膜能力的TH肽卻不具有在正常細胞和腫瘤細胞間的選擇性，仍然會造成一定的副作用。
[0007]6.因此，我們希望構建一種既具有主動靶向能力，又能高效介導入胞的新型多肽。本發明擬將環RGD與pH敏感的細胞穿膜肽TH通過共價鍵鏈接起來，達到既有主動靶向高表達整合素受體的腫瘤，同時又能高效介導入胞的能力。


【發明內容】

[0008]1.本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種既能主動靶向腫瘤高表達的整合素受體又有PH敏感性細胞穿膜能力的新型多肽，可修飾于載藥系統表面用于介導載藥系統主動靶向高表達整合素受體的腫瘤及高效介導其入胞。
[0009]2.具體而言，其特征在于，新型多肽TR的c (RGDfK)部分能主動靶向腫瘤高表達的整合素受體。新型多肽TR的TH部分上的組氨酸等電點Ip約為6.5，在腫瘤微酸環境中TH肽中的組氨酸被質子化而具有穿過細胞膜的能力；而在體內循環過程中，組氨酸不被質子化使得TH肽穿過細胞膜的能力被屏蔽。因此，新型多肽TR既具有受體介導入胞又具有與帶負電荷的腫瘤細胞靜電吸附高效介導入胞的雙重功效，經其修飾的載藥系統能高效地進入腫瘤細胞，達到治療腫瘤的目的。
[0010]3.本發明中，新型多肽TR的氨基酸序列為C (RGDfK) -AGYLLGHINLHHLAHL (Aib)HHIL-Cys。
[0011]本發明的突出優點是，新型多肽TR在腫瘤微酸環境中，既可以通過高表達的整合素受體介導入胞，同時又可以通過靜電吸附作用入胞，這兩種作用同時發揮協同效應。將新型多肽TR修飾于載藥系統表面后用于介導載藥系統主動祀向腫瘤的高表達的整合素受體及高效介導其入胞。
[0012]為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本發明的新型多肽TR修飾的載藥系統進行詳細的描述。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中:
1.圖1為本發明的結構示意圖。
[0014]2.TR肽修飾的載藥系統的表征，圖2 (A) TR修飾的脂質體(TR-Lip)在微酸環境中穿膜能力轉換的示意圖；(B) TR修飾的納米粒(TR-NPs)的粒徑分布；(C) TR修飾的膠束(TR-micellar)在不同pH條件下的電位分布；(D) TR修飾的脂質納米粒復合物(TR-L-NPs)與整合素ανβ3的結合能力。
[0015]3.圖3為TR修飾的脂質體(TR-Lip)在B16F10細胞(高表達整合素α ν β 3)上的攝取能力。
[0016]4.圖4 (A)包載DiR的經TR肽修飾的納米粒(DiR-TR-NPs)在荷瘤小鼠體內的分布。(B)載DiD的經TR肽修飾的脂質納米粒復合物(DiD-TR-L-NPs)穿透腫瘤的深度。
具體實施例
[0017]實施例1
TR肽修飾的脂質體(TR-Lip)的制備以及表征
采用薄膜分散法制備脂質體。分別稱取1.2 mg大豆磷脂、0.4 mg膽固醇、0.05 mg單甲氧基修飾的聚乙二醇和I mg TR肽修飾的聚乙二醇，將其全部溶于氯仿/甲醇混合液中，旋轉，蒸發，形成薄膜層，置于真空干燥器中過夜，使得有機溶劑充分揮發干凈。加入Iml !fepes緩沖液(pH 7.4)，置于搖床(180 rpmX30 min，37 °C )震搖后，用超聲儀超聲(5次X5 sX15 s)后，得到粒徑均一的TR-Lip。取100 μ I TR-Lip稀釋10倍，采用Zetanano粒徑儀測其粒徑分布以及電荷分布。TR-Lip的粒徑在150 nm左右。在pH 7.4條件下，TR-Lip的Zeta電位在-7 mV左右；在pH 6.5條件下，TR-Lip的Zeta電位在+5 mV左右。用表面等離子共振儀(SPR)測定不同多肽修飾的脂質體與整合素的結合力，結果證明TR-Lip與整合素的結合能力最強。
[0018]實施例2
TR肽修飾的納米粒(TR-NPs)的制備以及表征
采用W/0/W型乳化-溶劑蒸發法制備TR肽修飾的納米粒。將一定量的PLA-PLL-TR溶于二氯甲烷中構成有機相，以純水為水相，按一定比例混合有機相與水相，超聲形成初乳。將初乳傾入含泊洛沙姆F-18乳化劑的外水相中，繼續超聲得到復乳后置燒杯中，攪拌揮盡有機溶劑得到納米粒膠體分散體系。采用Zetanano粒徑儀測其粒徑分布以及電荷分布；用SPR儀測定其與整合素的結合力。TR-NPs的粒徑為90 nm左右。在pH 7.4條件下，TR-NPs的Zeta電位為-7.5 mV左右；在pH 6.5條件下，TR-NPs的Zeta電位為+6 mV左右。用表面等離子共振儀(SPR)測定不同多肽修飾的納米粒與整合素的結合力，，TR-NPs與整合素的結合能力最強。
[0019]實施例3
TR肽修飾的膠束(TR-micelle)的制備以及表征
分別取10 mg DSPE-PEG-TR與20 mg DSPE-PEG-OMe溶于無水氯仿，旋轉蒸發成膜后減壓干燥過夜，加入20 mM Ifepes緩沖液(pH 7.4)5 ml, 37 1:水浴振蕩20 1^11，用0.22μ m微孔濾膜過濾,得到TR肽修飾的聚合物膠束(TR-micelle)。采用Zetanano粒徑儀測其粒徑分布以及電荷分布；用SPR儀測定其與整合素的結合力。TR-micelle的粒徑為112nm左右。在pH 7.4條件下，TR-micelle的Zeta電位為_8 mV左右；在pH 6.5條件下，TR-micelle的Zeta電位為+4 mV左右。用表面等離子共振儀(SPR)測定不同多肽修飾的膠束與整合素的結合力，TR-micelle與整合素的結合能力最強。
[0020]實施例4
TR肽修飾的脂質納米粒(TR-L-NPs)的制備及表征
將卵磷脂和DSPE-PEG-TR溶于4 %的乙醇溶液中，加熱到65 °C。將含20%的PLGA乙腈溶液逐滴加入到上述預熱的脂質溶液中，輕輕的振蕩，然后渦旋3 min0繼續攪拌2 h，使得納米粒充分地完成自主裝，然后在37 °C下減壓蒸發除去有機溶劑。用純水重懸TR-L-NPs，使得最終濃度是I mg/ml。采用Zetanano粒徑儀測其粒徑分布以及電荷分布；用SPR儀測定其與整合素的結合力。TR-L-NPs的粒徑為100 nm左右。在pH 7.4條件下，TR-L-NPs的Zeta電位為-6.5 mV左右；在pH 6.5條件下，TR-L-NPs的Zeta電位為+5.5 mV左右。用表面等離子共振儀(SPR)測定不同多肽修飾的脂質納米粒與整合素的結合力，TR-L-NPs與整合素的結合能力最強。
[0021]實施例5
TR修飾的脂質體(TR-Lip)在B16F10細胞(高表達整合素ανβ3)上的攝取將B16F10按密度5 X 15個/孔細胞接于6孔板中，在孵箱中孵育24 h后，將載CFPE的四種脂質體在不同的PffipH 7.4和pH 6.5)條件下孵育2 h，棄培養液，用冷PBS洗兩次，2%的胰酶消化得到單個細胞后，培養基終止消化。加入0.5 ml的PBS使成單個懸浮的細胞，用細胞流式儀檢測細胞攝取量。如圖3所示，載CFPE的TR肽修飾的脂質體(CFPE-TR-Lip)在pH 6.5條件下進入高表達整合素受體的細胞的能力最強。
[0022]實施例6
載DiR的TR肽修飾的納米粒(DiR-TR-NPs)在荷瘤小鼠體內的分布以及載DiD的TR肽修飾的脂質納米粒復合物(DiD-TR-L-NPs)穿透腫瘤的能力
將每只C57/BL6的左背部接種2父105個則6?10細胞，一周后即可看到70 mm 3的腫瘤，待用。將載DiR染料的長循環納米粒(PEG-NPs)、RGD修飾的納米粒(RGD-NPs)、TH修飾的納米粒(TH-NPs)和TR-NPs經過尾靜脈注射到荷瘤小鼠內，24 h后，活體成像儀檢測不同載體在荷瘤小鼠的腫瘤部位的蓄積量。如圖4 (A)所示，相對于其他三組的納米粒，DiR-TR-NPs在荷高表達整合素的B16F10腫瘤的C57小鼠的腫瘤部位的蓄積能力最強。
[0023]按如上方式建荷瘤小鼠模型，將載DiD染料的長循環脂質納米粒復合物(PEG-L-NPs), RGD修飾的脂質納米粒復合物(RGD-L-NPs)、TH修飾的脂質納米粒復合物(TH-L-NPs)和TR修飾的脂質納米粒復合物(TR-L-NPs)經過尾靜脈注射到荷瘤小鼠內，24h后，將小鼠處死，取出腫瘤，做成切片，觀察不同載體穿透腫瘤的能力。如圖4 (B)所示，DiD-TR-L-NPs穿透腫瘤的能力最強。
【權利要求】
1.新型多肽TR，具有這樣的特征:新型多肽TR由特異性靶向整合素受體的環狀RGD肽(c (RGDfK))和非特異性的pH敏感性細胞穿膜肽TH(AGYLLGHINLHHLAHL(Aib)HHIL-Cys)通過共價鍵連接而成，其氨基酸序列為c (RGDfK) -AGYLLGHINLHHLAHL (Aib) HHIL-Cys。
2.根據權利要求1所述的新型多肽TR，其特征在于，新型多肽TR既可以由c(RGDfK)肽與TH(AGYLLGHINLHHLAHL(Aib)HHIL-Cys)肽通過肽腱相連，也可以通過氨基、羧基、巰基等橋鍵相連。
3.一種基于權利要求1所述的新型多肽TR修飾的載藥系統，其特征在于，TR肽通過聚乙二醇連接后修飾于載藥系統的表面。
4.根據權利要求3所述的載藥系統，其特征在于，所述的載藥系統包括但不限于脂質體，納米粒，膠束或脂質納米粒復合物。
【文檔編號】A61P35/00GK104497149SQ201510001268
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2015年1月5日 優先權日:2015年1月5日
【發明者】何勤, 石凱榮, 高會樂 申請人:四川大學