專利名稱：醌類化合物及其制備方法與抗腫瘤應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及藥物化合物領域，具體涉及一類源于真菌的具有抗腫瘤活性的醌類化合物及其制備方法，以及它們在制備抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
自從1929年從真菌中發現青霉素以來，真菌的代謝產物成為了藥物的豐富來源，絕大多數臨床應用的抗生素都來源于真菌和細菌，真菌的代謝產物還有其他的藥用價值，如抗腫瘤，治療心血管疾病，免疫調節劑等。由于海洋環境的特殊性，海洋微生物種類繁多，來源廣泛，篩選獲得率高，根據John教授在2005年《Natural Product Reports》的報道，2003年發現海洋天然產物新化合物中，海洋微生物是主要來源之一(另外包括海綿和腔腸動物)。海洋真菌能提供陸生真菌無法提供的代謝產物。
植物內生真菌(Endophytic fungi)生活在高等植物的組織中，是植物微生態系統中的天然組成成分，在進化過程中與宿主建立了和諧的共生關系，據保守的估計內生真菌的種類繁多，大約有1.5×106種，由于數量龐大，而且與其他生物之間緊密的生態關系，使這類真菌成為潛在的具有產生豐富的次級代謝產物的來源。

發明內容
本發明的目的在于提供一類新的來源于海洋真菌的具有潛在藥用價值的醌類化合物。
本發明的另一個目的是提供上述醌類化合物的制備方法。
本發明的進一步目的是提供上述醌類化合物在制備抗腫瘤藥物中的應用。
發明人由南海海洋真菌Halorosellinia sp.1403(以下簡稱真菌1403)的發酵培養物中提取分離得到三種結構相似的化合物，該三種化合物的結構分別如下列式E、式F、式G和所示(以下分別簡稱為化合物E、F和G)
本發明所用的真菌1403已保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC，中國武漢大學校內)，保藏號為CCTCC NOM201018，保藏日為2001年4月23日。
本發明化合物E、F和G可從真菌1403的發酵培養液中提取分離得到，制備方法的具體步驟如下a.真菌Halorosellinia sp.1403 CCTCC NOM 201018的種子培養培養基按重量比為葡萄糖0.5～1.5，酵母提取物0.05～0.15，蛋白胨0.1～0.3，瓊脂1～1.5，氯化鈉3～5，水100，制成試管斜面，挑取菌株接入斜面，30～35℃培養5～7天；b.真菌Halorosellinia sp.1403CCTCC NOM 201018的發酵培養發酵培養基按重量比為葡萄糖5-15，酵母提取物1～4，蛋白胨0.5～4，氯化鈉3～5，水100，將斜面中培養好的菌株挑入發酵培養基，于室溫25～35℃靜置1～2個月；
c.將上述培養好的發酵液過濾除去菌體；d.真菌#1403培養液過濾，菌體和培養液分別收集，培養液濃縮，將發酵液加熱濃縮至原液體積的1/10～1/5，用乙酸乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯萃取液，在硅膠柱中進行色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇為洗脫劑梯度洗脫；e.培養液浸膏經過柱層析后，收集20％～100％的乙酸乙酯/石油醚洗脫液，30％的乙酸乙酯/石油醚為洗脫液經過多次柱層析并重結晶，濃縮得紅色物質，即為E；再用50％的乙酸乙酯/石油醚為洗脫液，經薄層層析和硅膠柱層析多次分離，重結晶，即得到F。收集100％的乙酸乙酯洗脫液反復薄層層析和柱層析，不斷重結晶得到化合物G。
本發明經試驗證明，化合物E、F和G均能有效抑制腫瘤細胞株的生長，可用于制備抗腫瘤藥物，可以是藥物上可接受的任意一種劑型。
與現有抗腫瘤藥物相比，本發明具有如下有益效果本發明的醌類化合物來源于海洋真菌，海洋真菌種類繁多、數量龐大，從真菌提取的方法簡單，使得醌類化合物來源豐富、成本低廉；醌類化合物抗腫瘤活性高，應用前景廣闊。
具體實施例方式
實施例1 化合物E、F與G的分離制備方法a.真菌Halorosellinia sp.1403CCTCC NOM 201018的種子培養培養基按重量比為葡萄糖0.5～1.5，酵母提取物0.05～0.15，蛋白胨0.1～0.3，瓊脂1～1.5，氯化鈉3～5，水100，制成試管斜面，挑取菌株接入斜面，30～35℃培養5～7天；b.真菌Halorosellinia sp.1403CCTCC NOM 201018的發酵培養發酵培養基按重量比為葡萄糖5～15，酵母提取物1～4，蛋白胨0.5～4，氯化鈉3～5，水100，將斜面中培養好的菌株挑入發酵培養基，在室溫25～35℃靜置1～2個月；c.將上述培養好的發酵液過濾除去菌體；d.真菌#1403培養液過濾，菌體和培養液分別收集，培養液濃縮，將發酵液加熱濃縮至原液體積的1/10～1/5，用乙酸乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯萃取液，在硅膠柱中進行色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇為洗脫劑梯度洗脫。
e.培養液浸膏經過柱層析后，收集20％～100％的乙酸乙酯/石油醚洗脫液，30％的乙酸乙酯/石油醚為洗脫液經過多次柱層析并重結晶，濃縮得紅色物質，即為E；再用50％的乙酸乙酯/石油醚為洗脫液，經薄層層析和硅膠柱層析多次分離，重結晶，即得到E、F與G。浸泡的菌體得到的浸膏經過柱層析；收集100％的乙酸乙酯洗脫液反復薄層層析和柱層析，不斷重結晶得到化合物H。
化合物E的試驗數據紅色粒狀晶體，mp 222-225℃。FABMS m/z 321[M+1]+。1H NMR(DMSO-d6，500MHz)dH13.20(1H，s)，12.67(1H，s)，6.43(1H，s)，4.71(1H，dd，2.5，5.0)，4.38(1H，d，2.5)，3.92(3H，s)，3.62(1H，m)，1.19(3H，s)；13C NMR(DMSO-d6，125MHz)dc 184.3(C)，183.0(C)，175.9(C)，161.7(C)，160.3(C)，138.8(C)，136.4(C)，109.4(CH)，109.0(C)，106.8(C)，70.1(CH)，68.8(C)，56.8(CH3)，35.5(CH2)，29.9(CH2)，25.2(CH3)。
化合物F的試驗數據橙紅色固體，mp 249-253℃，FABMS m/z 301[M+1]+。1H NMR(DMSO-d6，500MHz)dH13.39(1H，s)，13.37(1H，s)，11.01(1H，s)，7.87(1H，s)，7.48(1H，s)，6.76(1H，s)，3.92(3H，s)，2.20(3H，s)；13C NMR(DMSO-d6，125MHz)dc185.8(C)，184.0(C)，162.0(C)，159.9(C)，157.5(C)，149.2(C)，133.6(C)，131.8(C)，129.5(CH)，124.4(C)，111.6(C)，110.9(CH)，106.4(CH)，105.5(C)，56.1(CH3)，16.1(CH3)。
化合物G的試驗數據灰色粉末.mp235-237℃.1H NMR(DMSO，300MHz)dH12.351(s，1H，5-OH)，8.448(S，1H，8-OH)，6.486，(S，1H，6-CH)，5.000(d，1H，J＝5.7Hz，9-OH)，4.73(brd，1H，J＝5.7，12.0Hz，9-CH)，4.002(s，1H，2-OH)，3.87(s，3H，15-CH3)，3.82(Brd，j＝2.1，8.4，10Hz，4-CH)，3.0(dd，1H，J＝8.4，5.7Hz，3-CH)，2.74(1H，dd，J＝12，10Hz，14-CH)，2.11，(brd，J＝12，12Hz，13-CH)，1.70(1H，t，J＝13.0Hz，1-CHa)，1.53(1H，dd，J＝13.0，3.6Hz，1-CHb)，1.17(S，3H，16-CH3)；13C NMR(DMSO，300MHz)dc205.80(C-10)，157.85(C-5)，155.85(C-12)，135.69(C-7)，129.29(C-12)，107.40C-11)，98.86(C-6)，78.10(C-3)，70.57(C-4)，70.39(C-2)，61.77(C-9)，55.98(C-15)，47.13(C-14)，37.05(C-1)，27.100(C-16)。
化合物E的試驗數據
實施例2 MTT還原法檢測化合物E、F和G抗腫瘤活性試驗1.材料1.1四脞鹽(MTT)用0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解MTT(3-(4，5-dimethythiazol-z-yl)2，5-diphenyltetrazolium bromide，SIGMA)終濃度5mg/mL，過濾除菌，分裝后4℃避光保存。
1.2靶細胞的制備HepG2細胞的復蘇與培養a.從液氮罐中取出人肝癌細胞株HepG2細胞的凍存管，迅速置入37℃水浴中，不停搖動使之迅速溶化，無菌操作移入離心管中；b.加全培養液至10mL，1000rmp離心5s，棄上清；c.重復以上操作一次；d.以全培養液吹打使細胞混勻后移入培養瓶中，5％CO2，37℃培養；e.觀察細胞生長情況，及時更換培養液，分瓶。
1.3細胞計數a.選取對數生長期細胞，胰酶消化，全培養終止，移入離心管中，加全培至10mL；b.取一滴滴入計數板一側凹槽中，顯微鏡下計數四大格的細胞總數、除以4，乘104，即為每毫升培養液所含細胞數；c.調整細胞數至1×105/mL；1.4化合物E、F和G的配制分別取一定量的化合物E、F和G加入到全培中，調整濃度為500μg/mL，超聲乳化，過濾除菌，4℃保存。
2.試驗方法a.96孔板各孔加入HepG2細胞100μL(1×105/mL)，5％CO2，37℃培養4hr。
b.加入不同濃度受試對象100μL，對照加全培100μL，繼續培養48hr。
c.加入MTT(5mg/mL)各10μL，繼續培養4hr。
d.去除培養液。每孔加入DMSO100μL，輕輕振蕩5-10min，使顆粒溶解。
e.酶聯免疫儀570nm下測定每孔OD值。
f.計算抑制率腫瘤細胞殺傷率％＝[(對照組測定的平均OD值-加藥組測定的平均OD值)/對照組測定的平均OD值]×100％g.以抑制率對藥物濃度的對數作圖，求得IC50值以lgc為橫坐標，抑制率為縱坐標，求得IC50值3.試驗結果試驗結果顯示化合物E、F和G均能有效抑制HepG2細胞株生長。其中，E和F的IC50值分別為10.5μg/ml和3.5μg/ml。
權利要求
1.下述結構式E、F和G的醌類化合物
2.權利要求1所述醌類化合物的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)真菌Halorosellinia sp.1403 CCTCC NOM 201018的種子培養培養基按重量比為葡萄糖0.5～1.5，酵母提取物0.05～0.15，蛋白胨0.1～0.3，瓊脂1～1.5，氯化鈉3～5，水100，制成試管斜面，挑取菌株接入斜面，30～35℃培養5～7天；(2)真菌Halorosellinia sp.1403 CCTCC NOM 201018的發酵培養發酵培養基按重量比為葡萄糖5～15，酵母提取物1～4，蛋白胨0.5～4，氯化鈉3～5，水100，將斜面中培養好的菌株挑入發酵培養基，于室溫25～35℃靜置1～2個月；(3)將上述培養好的發酵液過濾除去菌體；(4)真菌#1403培養液過濾，菌體和培養液分別收集，培養液濃縮，將發酵液加熱濃縮至原液體積的1/10～1/5，用乙酸乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯萃取液，在硅膠柱中進行色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇為洗脫劑梯度洗脫；(5)培養液浸膏經過柱層析后，收集20％～100％的乙酸乙酯/石油醚洗脫液，30％的乙酸乙酯/石油醚為洗脫液經過多次柱層析并重結晶，濃縮得紅色物質，即為E；再用50％的乙酸乙酯/石油醚為洗脫液，經薄層層析和硅膠柱層析多次分離，重結晶，即得到F；收集100％的乙酸乙酯洗脫液反復薄層層析和柱層析，多次重結晶得到化合物G。
3.權利要求1所述醌類化合物在制備抗腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了醌類化合物及其制備方法與抗腫瘤應用。本發明發現了一類新的來源于海洋真菌的具有潛在藥用價值的醌類化合物。海洋真菌種類繁多、數量龐大，從真菌提取的方法簡單，使得醌類化合物來源豐富、成本低廉；醌類化合物抗腫瘤活性高，應用前景廣闊。
文檔編號A61P35/00GK1762961SQ200510037139
公開日2006年4月26日 申請日期2005年9月13日 優先權日2005年9月13日
發明者佘志剛, 林永成, 黃華容, 夏雪奎, 蔡小玲, 周世寧, 關利平 申請人:中山大學