專利名稱：一種微管蛋白解聚劑多肽及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及微管蛋白解聚劑多肽4及其應用，具體涉及具有抑制微管蛋白聚合、治療急性淋巴細胞性白血病的多肽。
背景技術：
急性淋巴細胞性白血病(ALL)是一種進行性惡性疾病，其特征為大量的類似于淋巴母細胞的未成熟白細胞。這些細胞可在血液、骨髓、淋巴結、脾臟和其它器官中發現。急性淋巴細胞性白血病占兒童急性白血病的80%，發病率高峰在3歲至7歲之間。ALL也可發生于成年人，占所有成年人白血病的20%。近年來隨著醫學研究的深入，對急性淋巴細胞性白血病的認識和治療取得了很大進展。其中，微管蛋白在急性淋巴細胞性白血病中扮演著重要角色。微管是細胞骨架的主要組成部分，由〃-微管蛋白和P-微管蛋白異二聚體組成，具有中空管狀結構的特點。此外，還有一種r微管蛋白，它不是微管的組成成分，但參與微管的組裝。微管具有聚合和解聚的動力學特性，在維持細胞形態、細胞分裂、信號轉導及物質輸送等過程中起著重要作用。微管在細胞分裂前期聚合成為紡錘體，而紡錘體在有絲分裂中牽引染色體向兩極移動進入兩個子細胞中，完成細胞增殖。微管的組裝過程是α -和β -微管蛋白異性二聚體之間緊密的非共價相互作用，這一過程是受GTP水解驅動的。異性二聚體不斷地在微管的正極生長，在負極收縮，并且維持動態穩定。當微管的動態穩定性被破壞時，細胞的有絲分裂過程就有可能被阻止，從而導致細胞死亡。由于微管在細胞分裂中具有極其重要的作用，現已成為抗腫瘤藥物研究的重要靶點之一。微管蛋白抑制劑有兩種分類方法。一種是根據作用機制的不同分為兩種類型:①抑制微管蛋白聚合的微管蛋白解聚劑；②促進微管蛋白聚合的微管蛋白聚合劑。抑制微管蛋白聚合的微管蛋白解聚劑有長春堿類、秋水仙堿等化合物，多用于腫瘤治療。這類化合物其特點是作用于微管的長春堿位點的微管蛋白解聚劑。研究表明，長春堿類藥物作用于細胞微管蛋白并干擾細胞周期的有絲分裂階段，抑制微管聚合，阻止紡錘體微管的形成，從而阻止腫瘤細胞分裂增殖。該類生物堿自發現具有抗腫瘤活性以來，已有長春堿(vinblastine, 15)、長春新堿(vincristine, 16)、長春地辛(vindesine, 17)和長春瑞濱(vinorelbine, 18)用于臨床治療,而長春氟寧(vinflunine, 19)、長春甘酯(vinglycinate, 20)及脫水長春堿(anhydrovinblastine, 21)正處于臨床研究階段。但這些都有自身的缺陷，如長春堿與作用靶點親和力小，藥效不強。長春新堿有兩個重要的因素限制了它在臨床上的應用:(1)長春新堿神經系統毒性和局部刺激性較大；(2)水溶性相對較低，吸收能力差。因此，需要開發水溶性好，特異性強的微管蛋白解聚劑用于治療急性淋巴細胞白血病。微管蛋白解 聚劑包括大分子和小分子。大分子解聚劑的制備和使用限制了它們的發展，例如重組人微管蛋白抑制因子的體內半衰期只有4分鐘。很多成功的小分子解聚劑，可以在納摩爾水平上抑制微管蛋白的活力，但小分子解聚劑缺乏特異性，如果在慢性疾病中長期使用缺乏特異性的微管蛋白解聚劑可產生較大副作用。因而，從微管蛋白解聚劑的應用角度來看，以急性淋巴細胞白血病作為研究對象是正確的選擇。在急性反應期，機體能夠耐受短期的、微管蛋白廣譜解聚劑對正常生理功能的抑制，同時使關鍵組織器官的生理結構免受破壞，增加了生存幾率。本專利中的微管蛋白解聚劑多肽4已證明在急性淋巴細胞白血病中有效，具有在其他腫瘤模型中開發的前景。

發明內容
發明目的
本發明提供全新的序列，該序列微管蛋白解聚劑，對急性淋巴細胞白血病具有很好的療效。技術方案
微管蛋白解聚劑多肽4，其特征在于其序列為VELSQHYLTHR，見Seq N0.1。微管蛋白解聚劑多肽4在制備治療急性淋巴細胞白血病藥物中的應用。有益效果
利用固相合成法化學合成微管蛋白解聚劑多肽4，該多肽具有全新的序列，該多肽可體外抑制微管蛋白，治療急性淋巴細胞白血病。在內毒素休克模型實驗中成功的增加了小鼠的生存率。我們發現的多肽解聚劑可以同時抑制微管蛋白聚合活力，并在體內試驗中提高荷瘤小鼠生存率，具有潛在的新藥開發價值。
具體實施例方式
本發明涉及肽4由上海生工合成。實施例1
微管蛋白解聚劑多肽4對體外微管蛋白聚合與解聚的作用。取新鮮牛腦組織，剝去腦膜和大的血管，剪碎，用冷MES緩沖液洗滌1-2次，以每克腦組織0.5-lml的比例加入MES緩沖液，在4°C下，用電動勻漿器勻漿；4°C，105000g離心lh，取上清，加入等體積的微管聚合緩沖液，37°C水浴保溫30min。26°C，105000g離心lh，取沉淀，加入約1/10勻漿體積的冷MES緩沖液，輕輕攪拌或用勻漿器將沉淀碾碎；將懸液放冰浴30min，使沉淀完全溶解。用Lowry’ s法測定蛋白含量(SDS聚酰胺凝膠電泳法)。微管蛋白用MES緩沖液稀釋至4-5mg/ml，置液氮中保存。取冷凍的微管蛋白溶液，快速用常溫水沖其壁，使之融化，放入冰浴，用MES緩沖液稀釋至所需濃度(2-3mg/ml)，加入ATP至lmmol/1。以從冰浴中馬上取出的微管蛋白溶液在分光光度計350nm處調定為“O”點。然后將比色杯在37°C溫度下測定微管蛋白溶液的OD值，連續20-30min,記錄溫度-吸光值曲線(T-OD曲線)，重復三次。抑制率計算:抑制率(％)=(對照管“0D”值一加藥管“0D”值)/對照管“0D” 實驗組設五個劑量:0.75μΜ、1.5μΜ、3μΜ、12μΜ、24μΜ，陽性對照組長春新堿劑量
3 μ Μ，空白組加入等體積的溶劑DMSO ;按上述操作測定吸光值。結果，隨微管蛋白解聚劑多肽4濃度增加，聚合抑制率逐漸下降，說明有聚合能力的微管蛋白隨藥物濃度的增加而不斷減少。
實施例2
微管蛋白解聚劑多肽4對體外培養腫瘤細胞的生長和存活IC50。采用MTT比色法。將對數生長的U937細胞，以1.0 X 105加入96孔培養板中，培養24h，實驗孔、陽性藥物對照孔分別加入不同濃度的實驗藥物微管蛋白解聚劑多肽4和陽性對照藥物長春新堿；空白組加入相同體積的溶劑。每孔設五個復孔，培養48h，分別在0h、2h、8h、14h、20h、24h、36h、，48h 每孔加入 MTT，作用 4h 后，加入 DMS0，孵育 30min，在酶標儀620nm處測定吸光度A值，按公式腫瘤細胞生長抑制率=(1-實驗組吸光值/對照組吸光值)X100%。計算出實驗藥物的IC50為8.76μΜ。實施例3
用腫瘤模型檢測微管蛋白解聚劑多肽4的體內活力。

建立U937腫瘤模型，陽性對照藥物長春新堿；空白組加入相同體積的溶劑，實驗組設3個劑量:0.75、1.5 μ Μ、3 μ M mg/Kg。21天后，觀察小鼠存活數量，計算存活率。結果顯示，微管蛋白解聚劑多肽4可有效地保護小白鼠，提高荷瘤小鼠的生存率，生存率達到65.1%。
權利要求
1.微管蛋白解聚劑多肽4，其特征在于其序列為VELSQHYLTHR。
2.微管蛋白解聚劑多肽4在制備治療急性淋巴細胞性白血病藥物中的應用。
全文摘要
本發明為一種微管蛋白解聚劑多肽及其應用，涉及藥物領域，具體涉及具有抑制微管蛋白聚合，治療治療急性淋巴細胞性白血病的多肽。其序列VELSQHYLTHR是全新的序列，它們可以在1微摩爾水平上體外抑制微管蛋白聚合，并在體內試驗中提高荷瘤小鼠生存率，具有潛在的新藥開發價值。
文檔編號A61K38/08GK103254284SQ201310208878
公開日2013年8月21日 申請日期2013年5月30日 優先權日2013年5月30日
發明者羅瑞雪 申請人:蘇州普羅達生物科技有限公司