專利名稱：人體免疫活性細胞dccik抗腫瘤細胞制劑的制備方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及人體免疫活性細胞(DCCIK)制劑的制備方法及應用。
背景技術：
免疫治療已被公認是腫瘤手術、化療和放療之外的最為重要的手段，對清除腫瘤患者體內的微轉移腫瘤細胞，防止腫瘤的轉移和復發以及提高患者生存率和生活質量具重要作用。腫瘤的特異性主動免疫治療和被動過繼免疫治療研究。近20年來，取得了巨大進步(1)鑒定和純化了起免疫活化功能的細胞因子(Miller DL，et al.Science.1982；215689-390)，它可以增強機體對癌細胞的免疫應答。(2)開發出能選擇性高效擴增特異性免疫效應細胞的方法，即獲得大量特異性具殺傷腫瘤的T和NK細胞(GrimmEA，et al.J Exp Med.1982；1551823-1941)，用于免疫治療。(3)獲得并了解了各種腫瘤特異性抗原的分子特性，例如MUC(Ioannides CG，et al.J Immunol.1993；1513693-3703)和PSA(Vesey SG，et al.Urology.1990；35483-486)等。(4)證實樹突狀細胞(Dendritic Cell，DC)是一個關鍵的抗原提呈細胞(AntigenPresenting Cells，APC)(Steinman RM.Annu Rev Immunol.1991；9271-296)起調控免疫作用。(5)認識到腫瘤細胞具有發展各種方式以逃避免疫系統的能力(Khong HT，et al.Nat Immunol.2002；3999-1005)。(6)確證免疫系統在剔除具有免疫-刺激抗原的腫瘤細胞中起重要作用(Shan Karan V，et al.Nature，2001；4101107-1111)。
上述這些免疫學的進步使研究者認識到設法啟動機體自身的免疫應答來消滅惡性腫瘤在體內的生長是確實可行的。
在腫瘤的過繼免疫治療中，前后出現了5種用于治療腫瘤的免疫活性效應細胞。(1)淋巴因子激活的殺傷細胞(Lymphokine activated killer cell，LAK)(Rosenberg SA，et al.N.Engl.J.Med.1985；3131485-1492)。(2)腫瘤浸潤淋巴細胞(Tumorinfiltrating lymphocyte，TIL)(Itok，et al.J.Exp.Med.1988；1681419-1441)。(3)抗白細胞分化抗原-3單抗激活的殺傷細胞(Anti-CD3McAb activated killer cell，CD3-AK)(Uberti JP，et al.Clin.Immunol.Immunother.1994；70234-240)。(4)細胞毒T淋巴細胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)(Aruga A，et al.Int.J.Cancer.1991；4919-24)。(5)細胞因子誘導的殺傷細胞(Cytokine induced killer cell，CIK)(Schmidt-Wolf IGH，et al.J.Exp.Med.1991；174139-149)。
對上述5種免疫活性制劑用于臨床治療腫瘤后發現(1)盡管LAK在小鼠腫瘤實驗中獲巨大成功，但在臨床應用，因其對IL-2的嚴重依賴性，可產生全身性毒性，這限制它在人體上的廣泛應用。
(2)CTL和TIL，特別是CTL，從理論講上是最被看好的免疫活性細胞，但因目前尚無法獲得足夠臨床所需之數量，以及其他限制因素而應用較少。
(3)CD3-AK和CIK，兩者都是用抗CD3單抗為刺激因子來刺激T淋巴細胞增殖，幾乎具有相同的增殖活性和對腫瘤細胞的殺傷能力，但CIK細胞還有賴于其他細胞因子的參與，因此CIK要比CD3-AK有更強的增殖和細胞毒活性。CIK細胞胞質中含有大量顆粒，內含酯酶、穿孔素、細胞溶解素等，可使靶細胞發生溶解和死亡。CIK細胞還分泌多種細胞因子和上調粘附分子的表達能增加效應細胞的抗腫瘤作用。
樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)是近來所發現的最為重要的免疫調控和輔助細胞，它是最主要的抗原提呈細胞，具有捕獲，加工處理抗原并向T淋巴細胞提呈抗原分子的功能，并表達共刺激分子和粘附分子；且能分泌在機體抗腫瘤免疫中發揮重要作用的Th1型細胞因子IL-12，誘導機體產生抗原特異性T淋巴細胞，認別和殺傷腫瘤細胞。
人們又發現當在CIK細胞培養時加入腫瘤患者自體的DC后，彼此能相互作用，促進雙方細胞的成熟，并誘導出比同源CIK細胞更強增殖活性和更高腫瘤細胞殺傷活性的細胞群(Marten A，et al.J Immunother.2001；24(6)502-510)。
本發明人在對T淋巴細胞增殖特性研究的基礎上，把DC與CIK進行共培養，發現可產生出一個比原CIK細胞更為高的增殖率和更強抑瘤細胞毒活性的細胞群。并把該新型細胞定命為DCCIK(免疫活性細胞)，本發明人用該DCCIK在人體肺腺癌裸鼠動物模型證實DCCIK實驗組比CIK和生理鹽水(NC)兩對照組有顯著差異，其生存期分別為60±78；40.5±5.6和19.8±1.2(P＜0.01)，并證實DCCIK細胞免疫治療可以改善帶瘤(肺癌、肝癌、黑色素瘤)裸鼠化療的效果，兩者有協同抑瘤效果，可使瘤體縮小和消失而單純化療組只有縮小無消失現象。這表明DCCIK對多種腫瘤有治療意義，提示在臨床上選用DCCIK作為腫瘤病人的免疫治療制劑將比CIK細胞更具優勢。

發明內容
本發明所要解決的技術問題在于研究設計制備DCCIK細胞制劑。
本發明提供了一種人體免疫活性細胞DCCIK抗腫瘤細胞制劑，該細胞制劑使用患者自體外周血來源的PBMC，經培養分離獲得粘附和非粘附兩類細胞，再經相關細胞因子誘導分別產生DC和CIK細胞。用α-Galcer或CI沖擊DC后再與CIK按比例進行共培養，即獲得CD3+CD56+為主的一個免疫活性細胞群(DCCIK)。
本發明DCCIK的創新是使用了α-Galcer糖脂質和CI鈣離子載體來多次沖擊共培前的DC，使DC對其進行捕獲、加工處理在與CIK共培時向T淋巴細胞提呈該抗原分子進行信號轉導，在DC與CIK的相互接觸反應中使多基因活化表達和釋放更多的細胞因子及上調T淋巴細胞中的CD3+CD56+比例，這將極大地增強了DCCIK對腫瘤靶細胞的細胞毒殺傷活性。
本發明提供了人體免疫活性細胞DCCIK抗腫瘤細胞制劑的制備方法，該方法包括下列步驟(1)外周血單個核細胞PBMC的制備無菌條件下用血分器取腫瘤患者抗凝外周血，用生理鹽水對倍稀釋后，用淋巴細胞分離液Ficoll，1.077，離心2000rpm×25’，分離得PBMC，再用Hanks液洗滌2次，鏡下計細胞數，最后用無血清培養液AIM-V調節細胞密度使成4×106/ml細胞懸液。
(2)非粘附與粘附細胞分離將細胞懸液移入6孔板Nuclon，37℃，5％CO2，培養2h，然后用移液管輕輕沖吸細胞，將非粘附細胞懸液收集在離心管中作誘導CIK細胞備用，粘附細胞就留在6孔板上，加入DC培養液3ml/孔待用；(3)非粘附CIK細胞的誘導和擴增把離心管中的非粘附細胞懸液接種到含有IFN-γ1000U/ml AIM-V培養液的25cm2培養瓶100ml/瓶，置37℃，5％CO2培養箱中24-36h后，把用Hanks液配制的抗CD3單抗5μg/ml包被25cm2培養瓶，同時加入終濃度IL-1β100U/ml AIM-V，IL-2 300U/mlAIM-V繼續培養48h，鏡下計數，用CIK培液調細胞密度為4×105/ml，每隔48h按上述相同條件擴增1次，培養至第5-7天即收集CIK細胞備用；抗CD3單抗包被方法在AIM-V培液中加入抗CD3單抗，使成為抗CD3單抗濃度為5～10μg/ml的包被液，在25cm2培養瓶中加入5ml包被液，4℃過夜或者37℃溫育2h后，棄去全部包被液即可；(4)粘附DC細胞的誘導和擴增在留有粘附細胞的6孔板上，每孔添加DC培液3ml內含有GM-CSF 800U/ml和IL-4500U/ml，于37℃，5％CO2培養2天后，在各孔添加α-Galcer 100ng/ml或CI(200ng/ml)，每天加1次，共3次，連續刺激3天以后，于第5-7天收集細胞備用；(5)DC與CIK 1∶5混合共培養制取DCCIK細胞取培養至第5天之DC和CIK細胞，計數，離心，分別收集DC和CIK細胞，用AIM-V無血清培養液調兩細胞的密度分別為2×105和1×106，按DC∶CIK＝1∶5等體積混合后移入25cm2培養瓶10ml/瓶，于37℃，5％CO2培養，每隔48-72h按以上細胞密度分瓶擴大培養1次，經5次擴大培養后即可獲5×109～1×1010的DCCIK細胞；(6)DCCIK細胞制劑離心收集1～5×109細胞，用0.9％氯化鈉注射液洗滌2次，離心，棄上清，將細胞移至250ml輸液瓶中，加2g人血清白蛋白和250ml 0.9％氯化鈉注射液，制成細胞懸液制劑，留樣，進行各項指標的檢定，凡合格者，低溫保存，待用。
本發明應用共培養得到的DCCIK細胞與LAK、CIK細胞一樣均為非均質細胞群，其主要生物學特性如下(1)細胞組成DCCIK細胞中T淋巴細胞大于90％以上和少量DC。T淋巴細胞中各亞群所占比例具有個體差異和因體外培養時間長短而有一定變化范圍，一般為CD3-CD56+T細胞(NK細胞)為20～40％，CD3+CD8+細胞為20～50％，CD3+CD56+(NKT)細胞為50～70％。
(2)增殖活性高DCCIK細胞的增殖活性比CIK細胞強大，體外擴增3～4周后，DCCIK細胞比同源CIK細胞和LAK細胞分別大2～4倍和20～40倍。
(3)釋放細胞因子量大DCCIK細胞釋放IFN-γ的量是同源CIK細胞的2～5倍。
(4)細胞毒性高與同源CIK細胞比較，DCCIK細胞體外對特異性靶細胞的殺傷作用高出10～20％，表現對同源惡性細胞的特異性殺傷，人癌動物模型治療實驗表明，DCCIK組動物的平均生存期約是CIK組動物的1～2倍(見動物試驗數據統計表)。
實驗組No.1接種生理鹽水(N.S)對照組No.2 CIK實驗組No.3 DCCIK實驗組方法每只動物接種A549 3×105個細胞，接種后24h、72h、144h分別尾部靜脈給生理鹽水、CIK細胞(5×106)、DCCIK(5×106)，以生存天數作為觀察指標來考察3組實驗的致瘤情況和療效。
CIK與DCCIK對A549腫瘤動物生存期的影響

可見，CIK組和DCCIK組分別與對照組相比其P值均小于0.001，實驗組與對照組之間存在有非常顯著的差異，且CIK組和DCCIK組之間也有顯著差異(P＜0.01)。結果表明CIK和DCCIK都顯示了對A549腫瘤的強烈抑制作用，其生存期CIK組比對照組的生存期延長了1倍多，而DCCIK組比對照組延長了幾近2倍。說明DCCIK組比CIK組展示出更強的抑瘤力，提示在臨床上選用DCCIK做腫瘤病人的免疫治療制劑將比CIK更有優勢。
DCCIK細胞制劑主要用于自體腫瘤的臨床治療，可以配合術后和放、化療后的輔助治療能有效防轉腫瘤的轉移和復發。此外，DCCIK細胞也可用于某些傳染性疾病和中毒性化學損傷，有較好的臨床應用前景。
具體實施例方式
以下通過具體實施例，對本發明作進一步說明1.外周血單個核細胞(PBMC)的制備無菌條件下用血分器取確診的腫瘤患者抗凝外周血，用生理鹽水(0.9％NaCl)等倍稀釋后，用淋巴細胞分離液(Ficoll，1.077)，離心(2000rpm×25’)，分離得PBMC，再用Hanks液洗滌2次，鏡下計細胞數，最后用無血清培液(AIM-V)調節細胞密度使成4×106/ml細胞懸液。
2.非粘附與粘附細胞分離將細胞懸液移入6孔板(Nuclon)，置37℃，5％CO2培養2-6h，然后用移液管輕輕沖吸細胞，將非粘附細胞懸液收集在離心管中作誘導CIK細胞備用；而粘附細胞就留在6孔板上，加入DC培養液(3ml/孔)。
3.非粘附(CIK)細胞的誘導和擴增把離心管中的非粘附細胞懸液接種到含有IFN-γ(1000U/ml)AIM-V培養液的25cm2培養瓶(100ml/瓶)，置37℃，5％CO2培養箱中24-36h后，把用Hanks液配制的抗CD3單抗(5μg/ml)包被*25cm2培養瓶，同時加入終濃度IL-1β(100U/ml AIM-V)，IL-2(300U/ml AIM-V)繼續培養48-72h，鏡下計數。用CIK培液調細胞密度為4×105/ml，每隔48h按上述相同條件擴增1次，培養至第5-7天即收集CIK細胞備用。
4.粘附(DC)細胞的誘導和擴增在留有粘附細胞的6孔板上，每孔添加DC培液3ml，內含有GM-CSF(800U/ml)和IL-4(500U/ml)，于37℃，5％CO2培養2天后，在各孔添加Galcer(100ng/ml)或CI(200ng/ml)，每天加1次，共3次，連續刺激3天以后，于第5-7天收集細胞備用。
5.DC與CIK(1∶5混合)共培養制取DCCIK細胞取培養至第5-7天之DC和CIK細胞，計數，離心，分別收集DC和CIK細胞，用AIM-V無血清培養液調兩細胞的密度分別為2×105和1×106(DC∶CIK＝1∶5)等體積混合后移入25cm2培養瓶(10ml/瓶)，于37℃，5％CO2培養，每隔48-72h按以上細胞密度分瓶擴大培養1次，經5次擴大培養后，即可獲5×109～1×1010的DCCIK細胞。
6.DCCIK細胞制劑離心收集1～2×109細胞，用0.9％氯化鈉注射液洗滌2次，離心，棄上清，將細胞移至250ml輸液瓶中，加入2g人血清白蛋白和250ml 0.9％氯化鈉注射液，制成細胞懸液，留樣，進行各項指標的檢定，凡合格者，低溫保存，待用。
權利要求
1.一種人體免疫活性細胞DCCIK抗腫瘤細胞制劑，其特征在于該制劑是通過下列方法制得的，(1)外周血單個核細胞PBMC的制備無菌條件下用血分器取腫瘤患者抗凝外周血，用生理鹽水對倍稀釋后，用淋巴細胞分離液Ficoll，1.077，離心2000rpm×25’，分離得PBMC，再用Hanks液洗滌2次，鏡下計細胞數，最后用無血清培養液AIM-V調節細胞密度使成4×106/ml細胞懸液；(2)非粘附與粘附細胞分離將細胞懸液移入6孔板Nuclon，37℃，5％CO2，培養2-6h，然后用移液管輕輕沖吸細胞，將非粘附細胞懸液收集在離心管中作誘導CIK細胞備用，粘附細胞就留在6孔板上，加入DC培養液3ml/孔待用；(3)非粘附CIK細胞的誘導和擴增把離心管中的非粘附細胞懸液接種到含有IFN-γ 1000U/ml AIM-V培養液的25cm2培養瓶，100ml/瓶，置37℃，5％CO2培箱中24-36h后，把用Hanks液配制的抗CD3單抗5μg/ml包被25cm2培養瓶，同時加入終濃度IL-1β 100U/ml AIM-V，IL-2300U/mlAIM-V繼續培養48-72h，鏡下計數，用CIK培養液調細胞密度為4×105/ml，每隔48h按上述相同條件擴增1次，培養至第5-7天即收集CIK細胞備用；抗CD3單抗包被方法在AIM-V培液中加入抗CD3單抗，使成為抗CD3單抗濃度為5～10μg/ml的包被液，在25cm2培瓶中加入5ml包被液，4℃過夜或者37℃溫育2h后，棄去全部包被液即可；(4)粘附DC細胞的誘導和擴增在留有粘附細胞的6孔板上，每孔添加DC培液3ml內含有GM-CSF 800U/ml和IL-4500U/ml，于37℃，5％CO2培養2天后，在各孔添加α-Galcer 100ng/ml或CI(200ng/ml)，每天加1次，共3次，連續刺激3天后，于第5-7天收集細胞備用；(5)DC與CIK 1∶5混合共培養制取DCCIK細胞取培養至第5-7天之DC和CIK細胞，計數，離心，分別收集DC和CIK細胞，用AIM-V無血清培液調兩細胞的密度分別為2×105和1×106，按DC∶CIK＝1∶5等體積混合后移入25cm2培養瓶10ml/瓶，于37℃，5％CO2培養，每隔48-72h按以上細胞密度分瓶擴大培養1次，經5次擴大培養后即可獲5×109～1×1010的DCCIK細胞；(6)DCCIK細胞制劑離心收集1～5×109細胞，用0.9％氯化鈉注射液洗滌2次，離心，棄上清，將細胞移至250ml輸液瓶中，加2g人血清白蛋白和250ml 0.9％氯化鈉注射液，制成細胞懸液制劑。
2.一種人體免疫活性細胞DCCIK抗腫瘤細胞制劑的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)外周血單個核細胞PBMC的制備無菌條件下用血分器取腫瘤患者抗凝外周血，用生理鹽水等倍稀釋后，用淋巴細胞分離液Ficoll，1.077，離心2000rpm×25’，分離得PBMC，再用Hanks液洗滌2次，鏡下計細胞數，最后用無血清培養液AIM-V調節細胞密度使成4×106/ml細胞懸液；(2)非粘附與粘附細胞分離將細胞懸液移入6孔板Nuclon，37℃，5％CO2，培養2h，然后用移液管輕輕沖吸細胞，將非粘附細胞懸液收集在離心管中作誘導CIK細胞備用，粘附細胞就留在6孔板上，加入DC培養液3ml/孔待用；(3)非粘附CIK細胞的誘導和擴增把離心管中的非粘附細胞懸液接種到含有IFN-γ1000U/ml AIM-V培養液的25cm2培養瓶10-15ml/瓶，置37℃，5％CO2培養箱中24-36h后，把用Hanks液配制的抗CD3單抗5μg/ml包被25cm2培養瓶，同時加入終濃度IL-1β 100U/ml AIM-V，IL-2300U/ml AIM-V繼續培養48-72h，鏡下計數，用CIK培液調細胞密度為4×105/ml，每隔48h按上述相同條件擴增1次，培養至第5-7天即收集CIK細胞備用；抗CD3單抗包被方法在AIM-V培液中加入抗CD3單抗，使成為抗CD3單抗濃度為5～10μg/ml的包被液，在25cm2培養瓶中加入5ml包被液，4℃過夜或者37℃溫育2h后，棄去全部包被液即可；(4)粘附DC細胞的誘導和擴增在留有粘附細胞的6孔板上，每孔添加DC培液3ml內含有GM-CSF 800U/ml和IL-4500U/ml，于37℃，5％CO2培養2天后，在各孔添加α-Galcer 100ng/ml或CI(200ng/ml)，每天加1次，共3次，連續刺激3天后，于第5-7天收集細胞備用；(5)DC與CIK 1∶5混合共培養制取DCCIK細胞取培養至第5-7天之DC和CIK細胞，計數，離心，分別收集DC和CIK細胞，用AIM-V無血清培養液調兩細胞的密度分別為2×105和1×106，按DC∶CIK＝1∶5等體積混合后移入25cm2培養瓶10ml/瓶，于37℃，5％CO2培養，每隔48-72h按以上細胞密度分瓶擴大培養1次，經5次擴大培養后即可獲5×109～1×1010的DCCIK細胞；(6)DCCIK細胞制劑離心收集1～5×109細胞，用0.9％氯化鈉注射液洗滌2次，離心，棄上清，將細胞移至250ml輸液瓶中，加2g人血清白蛋白和250ml 0.9％氯化鈉注射液，制成細胞懸液制劑。
3.根據權利要求1或2所述的一種人體免疫活性細胞DCCIK細胞制劑的制備方法，其特征在于其中所述的步驟(3)，非粘附CIK細胞的誘導和擴增，采用固相抗CD3單克隆抗體刺激的方法，包括在無血清培養AIM-V中加入抗CD3單抗，使成為抗CD3單抗濃度為5～10μg/ml的包被液，加入培養瓶，4℃過夜或37℃溫育2h后，傾去全部包被液后，移入經IFN-γ處理過非粘附的細胞懸液接受抗CD3單抗的刺激。
4.根據權利要求1或2所述的一種人體免疫活性細胞DCCIK細胞制劑制備方法，其特征在于其中所述的步驟(4)，DC的誘導和擴增，除去DC培養液中除添加GM-CSF和IL-4外，還在各培養孔中添加α-Galcer 100ng/ml或CI 200ng/ml，每24h 1次，共3次。
5.一種人體免疫活性細胞DCCIK在制備抗腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了人體免疫活性細胞(DCCIK)抗腫瘤細胞制劑及制備方法。該方法用有關細胞因子對取自患者外周血分別誘導成DC與CIK，在應用α－Galcer或CI對DC反復沖擊后與CIK細胞按比例作混合共培養，即獲DCCIK細胞。與同源CIK比較，其增殖活性和細胞毒活性均有較大提高。該DCCIK為未經相關腫瘤抗原沖擊而對同源腫瘤具有特異靶向和高效廣譜殺瘤作用。可有效防止腫瘤術后和放化療后的轉移和復發。在與其他療法配合下，可延長患者生存期并改善生活質量。
文檔編號A61K35/14GK1990044SQ20051011238
公開日2007年7月4日 申請日期2005年12月30日 優先權日2005年12月30日
發明者劉祥麟, 王定華 申請人:上海中科英達生物技術有限公司