專利名稱：小型化Endoglin抗體與阿霉素的偶聯物及其制備方法
技術領域：
本發明涉及制備抗腫瘤藥物，尤其涉及具有抗腫瘤作用的小型化Endoglin抗體與阿霉素的偶聯物及其制備方法。
背景技術：
利用抗體對腫瘤特異抗原的選擇性，對抗腫瘤藥物進行主動靶向設計，可提高抗腫瘤藥物對腫瘤細胞的選擇性，降低其對正常器官的毒性。目前，抗體藥物的研究主要有兩個方向一個是抗體藥物的小型化。由于抗體及其偶聯物均為大分子物質。IgG型抗體的分子質量約為150kD，龐大的抗體或偶聯物分子難以通過毛細管內皮層和細胞外間隙到達實體瘤深部的腫瘤細胞。因此，研制小型化抗體藥物對提高療效有重要意義。通過酶切方法獲得的Fab片段，其分子質量約相當于完整抗體的1/3。研究表明，抗體片段較易穿透細胞外間隙到達深部的腫瘤細胞。與完整抗體相比，抗體片段的免疫原性較弱。使用抗體片段， 可降低人體的抗體反應。另一個研究方向就是抗體藥物的高效化。抗體連接上對腫瘤細胞有強烈殺傷作用的“彈頭”，可降低藥物的用量及對其他器官的毒性，還可以減少治療費用。早在本世紀70年代初，美國哈佛大學Judah Folkman博士就正式提出腫瘤的發生、發展和轉移都與腫瘤血管生成(Tumor Angiogenesis)密切相關，因此靶向腫瘤血管生成的治療策略就顯得尤為重要。研究表明，Endoglin高表達于各種腫瘤組織及腫瘤組織邊緣血管起源的內皮細胞，但很少出現在正常組織的內皮細胞，是腫瘤血管生成的標志性分子之一，可作為腫瘤抗血管治療和靶向治療的重要靶點。阿霉素(AdriamyCin，ADM)是一種抗腫瘤抗生素，可嚴重干擾DNA的合成、DNA依賴性RNA合成和蛋白質合成，抗瘤譜較廣，對多種腫瘤均有作用，屬周期非特異性藥物，對各種生長周期的腫瘤細胞都有殺滅作用。本文將初步探討小型化的Endoglin抗體片段與阿霉素偶聯物的抗腫瘤作用。

發明內容
本發明的目的在于提供一種具有抗腫瘤作用的小型化Endoglin抗體與阿霉素的偶聯物，該偶聯物Fab-ADM不但有更強的腫瘤抑制效果，還可顯著延長荷瘤動物的生存時間。為實現上述目的，本發明的技術方案為提供小型化Endoglin抗體與阿霉素的偶聯物，其中，偶聯物Fab-ADM是由N-羥基琥珀酰亞胺基-間-(N-馬來酰亞胺基)苯甲酸酯 (MBS)作為交聯劑，MBS首先與一含有-NH2的分子即阿霉素(ADM)反應并穩定結合為活性的中間產物，然后再與一含有-S-的分子即為經胃蛋白酶消化、二硫蘇糖醇(DTT)還原的抗體片段Fab反應得到終產物，即偶聯物Fab-ADM ；Fab與ADM的分子比為1 2。本發明還提供小型化Endoglin抗體與阿霉素偶聯物的制備方法包括以下步驟(1)、選用MBS作為交聯劑備用；(2)、阿霉素的MBS修飾阿霉素的MBS修飾調整阿霉素濃度為10mg/ml，MBS濃度為ang/ml，以MBS與阿霉素摩爾比為10 1調整反映體系，于室溫反應30min后，立即與巰基化的單抗混合。
(3)、Endoglin抗體片段Fab的巰基化 經飽和硫酸銨沉淀及丙烯葡聚糖凝膠S-200HR (Sephacryl S-200HR)純化得到的單抗分子，與胃蛋白酶反應時的分子比約為20 1，37°C，反應3-6小時，反應體系pH值為 4. 5 ；反應結束后，加入2M的三羥甲基氨基甲烷(Tris)，pH8.0終止反應；調整經^^！！肌巧工 S-200HR凝膠柱純化所得的F(ab' )2濃度為10mg/ml，加入二硫蘇糖醇(DTT)還原，其終濃度為50mM，室溫反應30min，脫鹽后立即與步驟O)中的MBS修飾的阿霉素偶聯。0)、偶聯物的制備MBS修飾的阿霉素與巰基化單抗的摩爾比為約15 1，室溫反應18h;偶聯物過 Sephacryl S-200HR凝膠柱純化并超濾濃縮，于吸光度^Onm處測定蛋白濃度。


圖1為偶聯物的制備原理圖；其中A :MBS反應原理圖(引自Bioconjugate Techniques (2nd Edition), Greg Τ. Hermanson, P287) ；B :阿霉素；C :經胃蛋白酶消化、DTT 還原所得的抗體片段Fab ；D 抗體經胃蛋白酶消化示意圖(來自hternet :http://www. binglixue. com/zhikao/yaodian/jichu/my05. htm)；圖2為MTT法分析游離ADM與偶聯物Fab-ADM對肝癌細胞株BEL-7402的體外增值抑制率；圖3為荷瘤小鼠在不同監測點的腫瘤體積；圖4為荷瘤小鼠在不同監測點的存活率。
具體實施例方式1材料與方法1.1 材料1. 1. 1實驗動物及細胞株分泌抗Endoglin單克隆抗體的雜交瘤細胞株、肝癌細胞株BEL-7402由本實驗室保存，小鼠肝癌H22細胞株來源于中國典型培養物保藏中心；體重18-22g的清潔II級昆明種雄性小鼠由廣東省醫學實驗動物中心提供。1. 1.2藥品與試劑鹽酸阿霉素(鹽酸多柔比星)為意大利Pfizer Italia S. r. 1.公司產品。 Sephacryl S-200HR凝膠購自GE公司；濃縮超濾管購自Millipore公司。異型雙功能偶聯齊[JMBS (m-Maleimidobenzoyl-N—hydroxysuccinimide ester)購自 Sigma公司。蛋白 Marker 購自！^ermentas公司。胃蛋白酶購自Amersco公司。MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所。DMEM干粉及FBS購自Gibco公司。其他常規生化試劑均為國產分析純。1. 2 方法1. 2. 1抗體偶聯物制備1. 2. 1. 1抗體偶聯物制備原理偶聯物的制備選用MBS作為交聯劑，MBS的作用機制見圖1A，MBS首先與一含有-NH2的分子R(在本實驗中為阿霉素(結構式見圖IB))反應并穩定結合為活性的中間產物，然后再與一含有-S-的分子R'(本實驗中為經胃蛋白酶消化、DTT還原的抗體片段 Fab(圖IC))反應得到終產物，即偶聯物。胃蛋白酶作用于完整的抗體分子后，可將IgG重鏈間二硫鍵近C端切斷，得到一個具有兩價抗體活性的F(ab' )2段，還有Fc段的小部分 (此時Fc段的大部分都水解成較小分子的肽，不呈現任何生物學活性)(圖ID)。F(ab' )2 經DTT還原后可暴露出二硫鍵與交聯劑結合(圖1C)。1. 2. 1. 2阿霉素的MBS修飾調整阿霉素濃度為10mg/ml，MBS濃度為ang/ml，以MBS與阿霉素摩爾比為10 1 調整反映體系，于室溫反應30min后，立即與巰基化的單抗混合；1. 2. 1. 3Endoglin抗體片段Fab的巰基化經飽和硫酸銨沉淀及丙烯葡聚糖凝膠S_200HR(S印hacryl S-200HR)純化得到的單抗分子，與胃蛋白酶反應時的分子比約為20 1，37°C，反應3-6小時(最佳反應為 3小時)，反應體系pH值為4. 5。反應結束后，加入2M的Tris，pH8.0終止反應。調整經 Sephacryl S-200HR凝膠柱純化所得的F (ab ‘ ) 2濃度為10mg/ml，加入DTT還原(其終濃度為50mM)，室溫反應30min，脫鹽后立即與MBS修飾的阿霉素偶聯。1.2. 1.4偶聯物的制備MBS修飾的阿霉素與巰基化單抗的摩爾比為約15 1，室溫反應18h ；偶聯物過 Sephacryl S-200HR凝膠柱純化并超濾濃縮，于吸光度^Onm處測定蛋白濃度。1. 2. 1. 5偶聯物中Fab與ADM的分子比計算根據吸光度的加和性，可以在同一試樣中不經分離同時測定兩個以上的組分。AaSOrrSpab CFab+S^icADMA232.S=^illf Cpab+S^MCADMCadm /Cpab—(Spab 5 -Rspab)/R = A232. 5/A280上述公式中，A表示吸光度，A= ebc，其中ε為吸光系數，單位L/(g · cm)，b為液層厚度(通常為比色皿的厚度)，單位cm，c為溶液濃度，單位g/L。1. 2. 1. 6 非還原 SDS-PAGE 檢測采用非還原SDS-PAGE檢測偶聯物的大小。分離膠濃度為7.5%，濃縮膠濃度為 5%，電泳電壓為100V，時間為80min。1. 2. 2偶聯物的體外細胞增殖抑制試驗選用MTT法進行檢測。取對數生長期的BEL-7402細胞，計數并調整細胞濃度為 3000個/100 μ L，每孔加IOOyL于96孔細胞培養板中，在37°C、5% CO2的培養箱中培養 24h0加入以無血清DMEM倍比稀釋的ADM及偶聯物Fab-ADM各10 μ L/孔，每個濃度設3個平行孔，同時設空白對照孔，陰性對照孔加無血清DMEM培養液10 μ L。繼續培養72h，每孔加入10 μ L MTT溶液，在細胞培養箱內孵育4h后，每孔加入100 μ L Formanzan溶解液，繼續孵育4h左右，于570nm處測定吸光度并計算腫瘤抑制率和IC50值。抑制率(％ ) = (1 一實驗組OD值/對照組OD值)X 100%。并根據IC50值計算偶聯物的體內使用劑量偶聯物體內實際用藥劑量=游離ADM劑量X (偶聯物的體外IC50/游離ADM體外IC50)。IC50 的計算方法為改良寇式法lgIC50 = Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
其中Xm: Ig最大劑量I Ig (最大劑量/相臨劑量)P:陽性反應率之和Pm 最大陽性反應率Pn 最小陽性反應率1.2. 3偶聯物的體內腫瘤抑制試驗昆明小鼠，雄性，體重18_22g，隨機分組，每組10只。小鼠肝癌細胞株H22經小鼠腹腔傳代一次，收集腹水細胞，以生理鹽水按1 3稀釋后，接種于小鼠右腋皮下，0.2ml/只 (約2X106個細胞/只)。待腫瘤體積生長到約4X6mm大小時，開始用藥。給藥方式為尾靜脈注射，對照組給予生理鹽水0. aiil/只，ADM劑量為0. %ig/kg，偶聯物體內用量表示為等細胞毒性劑量0. %ig/kg，Fab劑量亦為0. %ig/kg。每周給藥一次，連續3周給藥。實驗期間，每周測量2次腫瘤的長徑a和短徑b，以公式V = O. 52ab2計算瘤體積(V)，繪制腫瘤生長曲線，并計算抑瘤率。觀察動物生存情況，以Kap Ian-Meier法計算中位生存時間。統計學處理各組動物的腫瘤體積均用mean 士 SD表示，組間分析采用t檢驗。2 結果2. 1偶聯物中Fab與ADM的分子比計算制作標準曲線求出ε值，R = 0. 722/0. 298 ^ 2. 42, cADM/cFab 2，分子比 Fab ADM=I 2。偶聯物中Fab與ADM的分子比為1 2，說明一個Fab分子結合了兩個ADM，根據MBS的特性，偶聯物中也應該含有兩個MBS分子，根據該假設，可估算出偶聯物的分子量為 MFab+2MADM+2MBS 51788Da。2. 2 非還原 SDS-PAGE 檢測偶聯物的分子量與估算的大致相符。2. 3偶聯物Fab-ADM的體外腫瘤細胞增殖抑制作用以MTT法測定Fab-ADM偶聯物及ADM對體外培養的BEL-7402肝癌細胞的細胞毒作用。結果見圖2。根據公式計算ADM和Fab-ADM偶聯物對肝癌BEL-7402細胞的增殖抑制的IC50分別為3. 15ug/ml和124ug/mL·若計算為等細胞毒性劑量，Fab-ADM的IC50值為 2. 78，該數值與游離ADM的IC50值差異不大，這可能與BEL-7402不是Endoglin的靶細胞有關。動物實驗中，游離ADM采用0. 4mg/kg的劑量，根據IC50值推算出偶聯物Fab-ADM 的實際使用劑量為15. 75mg/kg，但表示為0. 4mg/kg的等細胞毒性劑量。2. 4偶聯物的體內腫瘤抑制試驗小鼠皮下接種肝癌H22后，待腫瘤體積生長到約4X6mm大小時，開始用藥治療。腫瘤生長曲線如圖3所示。與游離ADM相比，等細胞毒性劑量的偶聯物Fab-ADM能顯著抑制 H22的生長。根據腫瘤體積計算藥物的抑瘤率用藥第14天，ADM(O.^ig/kg)的抑制率為 25%，偶聯物(0. %ig/kg，等細胞毒性劑量)的抑制率達到91. 94%;而第21天時，ADM治療的荷瘤小鼠均死亡，偶聯物的抑制率仍為87. 00%，抑制作用較ADM顯著增強(P < 0. 05)。觀察動物的生存狀態及生存時間，結果顯示(圖4)偶聯物Fab-ADM治療組的中位生存時間約為32天，而ADM治療組的約為14天。這說明與游離ADM相比，偶聯物Fab-ADM 不但有更強的腫瘤抑制效果，還可顯著延長荷瘤動物的生存時間(P < 0. 01)。
3 結論Endoglin抗體片段Fab經MBS與阿霉素的偶聯產物Fab-ADM大小約51788Da，體內實驗中，Fab-ADM能顯著抑制H22的生長。根據腫瘤體積計算藥物的抑瘤率用藥第14 天，ADM(0. 4mg/kg)的抑制率為25%，偶聯物(0. %ig/kg，等細胞毒性劑量)的抑制率達到 91. 94% ；而第21天時，ADM治療的荷瘤小鼠均死亡，偶聯物的抑制率仍為87. 00%，抑制作用較ADM顯著增強(P < 0. 05)。偶聯物Fab-ADM治療組的中位生存時間約為32天，而ADM 治療組的約為14天。這說明與游離ADM相比，偶聯物Fab-ADM不但有更強的腫瘤抑制效果， 還可顯著延長荷瘤動物的生存時間(P < 0. 01)。以上所揭露的僅為本發明的較佳實施例而已，當然不能以此來限定本發明之權利范圍，因此依本發明權利要求所作的等同變化，仍屬于本發明所涵蓋的范圍。
權利要求
1.小型化Endoglin抗體與阿霉素的偶聯物，其特征在于偶聯物Fab-ADM是由MBS作為交聯劑，MBS首先與一含有-NH2的分子即ADM反應并穩定結合為活性的中間產物，然后再與一含有-S-的分子即為經胃蛋白酶消化、DTT還原的抗體片段Fab反應得到終產物，即偶聯物；Fab與ADM的分子比為1:2。
2.如權利要求1的小型化Endoglin抗體與阿霉素的偶聯物的制備方法包括以下步驟(1)、選用MBS作為交聯劑備用； 0)、阿霉素的MBS修飾調整阿霉素濃度為10mg/ml，MBS濃度為ang/ml，以MBS與阿霉素摩爾比為10 1調整反映體系，于室溫反應30min后，立即與巰基化的單抗混合； (3)、Endoglin抗體片段Fab的巰基化經飽和硫酸銨沉淀及丙烯葡聚糖凝膠S-200HR純化得到的單抗分子，與胃蛋白酶反應時的分子比約為20 1，37°C，反應3-6小時，反應體系pH值為4.5;反應結束后，加入2皿的Tris，pH8.0終止反應；調整經丙烯葡聚糖凝膠S-200HR凝膠柱純化所得的F(ab' )2濃度為10mg/ml，加入DTT還原，其終濃度為50mM，室溫反應30min，脫鹽后立即與步驟⑵中的MBS修飾的阿霉素偶聯； G)、偶聯物的制備MBS修飾的阿霉素與巰基化單抗的摩爾比為約15 1，室溫反應18h;偶聯物過丙烯葡聚糖凝膠S-200HR凝膠柱純化并超濾濃縮，于吸光度^Onm處測定蛋白濃度。
全文摘要
本發明提供小型化Endoglin抗體與阿霉素的偶聯物及其制備方法，偶聯物為Fab-ADM；Fab與ADM的分子比為1∶2。制備方法包括(1)選用N-羥基琥珀酰亞胺基-間-(N-馬來酰亞胺基)苯甲酸酯(MBS)作為交聯劑備用；(2)阿霉素以異型雙功能交聯劑N-羥基琥珀酰亞胺基-間-(N-馬來酰亞胺基)苯甲酸酯(MBS)修飾(3)Endoglin抗體片段Fab的巰基化；(4)偶聯物的制備。該偶聯物Fab-ADM不但有更強的腫瘤抑制效果，還可顯著延長荷瘤動物的生存時間。
文檔編號A61K47/48GK102258789SQ201010624459
公開日2011年11月30日 申請日期2010年12月29日 優先權日2010年12月29日
發明者周松林, 林映瑩, 王 華, 譚光宏, 趙煥閣, 郭峻莉, 黃用豪, 黃風迎 申請人:海南醫學院