專利名稱：信號調節蛋白α在制備預防和治療腫瘤的巨噬細胞中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于醫學生物工程技術領域。具體的說，本發明涉及一種信號調節蛋白 α (SIRPa)在制備預防和治療腫瘤的巨噬細胞中的應用。
背景技術：
腫瘤中浸潤的巨噬細胞又稱腫瘤相關巨噬細胞(tumor associated macrophages, TAMs)是浸潤的炎性細胞的主要成分。研究表明腫瘤細胞通過分泌細胞因子、趨化因子等從外周血中募集單核細胞到達腫瘤局部，誘導分化形成腫瘤相關巨噬細胞。 腫瘤相關巨噬細胞在腫瘤細胞的增殖、存活、浸潤和轉移中起重要作用，主要包括形成慢性炎癥的微環境，降解細胞外基質，腫瘤細胞浸潤，進入血管，促進血管生成，在遠隔部位種植等0 (John Condeelis, Jeffrey W. Pollard. Macrophages :0bligate Partners for Tumor Cell Migration，Invasion, and Metastasis. Cell. 124 :263-266.)信號調節蛋白α (SIRPa)屬于免疫球蛋白超家族(IgSF)成員，是一類主要表達在骨髓細胞和神經元細胞的胞膜蛋白，此外在平滑肌細胞、血管內皮細胞等也有少量表達。 SIRPa胞外區由三個免疫球蛋白超家族結構域(IgSF)組成，通常被高度糖基化，結構學研究顯示它與抗原受體如TCR和BCR在非常類似，提示SIRPs家族分子可能是機體免疫系統進化的重要一環，參與調節免疫細胞活化。SIRPa胞質區在人、大鼠和小鼠之間高度保守， 具有富含酪氨酸殘基的免疫受體抑制基序(ITIMs)，可以被蛋白激酶如Src蛋白磷酸化，進而與含有SH2結構域的蛋白如酪氨酸磷酸酶SHP-I和SHP-2結合，抑制免疫細胞的激活。 目前普遍認為SIRPa是一類抑制性受體。已有文獻報道SIRP α可以抑制LPS刺激引起的巨噬細胞活化，抑制中性粒細胞的遷移等。然而一部分研究證明SIRP α亦可以發揮正性調節作用，例如巨噬細胞SIRPa與配體結合后可以促進JAK-STAT的活化并促進NO的形成。 (Jacqueline Alblas. Signal Regulatory Protein Ligation Induces Macrophage Nitric Oxide Production through JAK/STAT-and Phosphatidylinositol 3-Kinase/Racl/NAPDH 0xidase/H202-Dependent Pathways. MOL CELL BIOL. 25 :7181-7192)慢病毒載體指以人類免疫缺陷病毒-1 (HIV-I)來源的一種病毒載體，能夠穩定高效的將外源基因整合到宿主染色體上，實現持續性表達。慢病毒載體可以克服脂質體轉染效果差，持續時間短等缺點，已廣泛應用與生物學研究中。

發明內容
本發明的目的在于提供信號調節蛋白α的新用途，特別是提供一種通過慢病毒載體介導上調巨噬細胞信號調節蛋白α (SIRPa)的表達，調節腫瘤相關巨噬細胞的功能， 達到預防和治療腫瘤的作用。本發明提供了信號調節蛋白a (SIRPa)在制備預防和治療腫瘤的巨噬細胞中的應用。具體是通過構建SIRPa過表達的慢病毒載體，體外轉染分離獲得的巨噬細胞，獲得過表達SIRPa的巨噬細胞，用于預防和治療腫瘤。本發明的技術方案主要包括以下幾個方面1、慢病毒表達質粒的構建LV-WT-SIRP α、LV-microRNA-SIRP α、LV-GFP2、表達質粒與包裝質粒共轉細胞，包裝慢病毒，滴度檢測；3、分離培養外周單核細胞，骨髓來源的巨噬細胞(BMDMs)，腫瘤局部的腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)；4、慢病毒轉染細胞；5、體外觀察腫瘤細胞共培養條件下SIRP α過表達與干擾的巨噬細胞(a)細胞表型的改變-流式檢測MHC II ;(b)遷移粘附到腫瘤局部-Transwell能力，細胞骨架改變，粘附相關分子表達；(c)表達分泌腫瘤炎癥與免疫相關分子-Real-Time與ELISA檢測IL-6、 TNFa、IL-12、IL-10等；(d)微環境中生存能力的改變-PI/Annexin V染色，Caspase相關分子的改變。6、體外觀察腫瘤細胞共培養條件下SIRP α過表達與干擾的腫瘤相關巨噬細胞 (TAMs)研究內容同5 ；7、體外觀察SIRP α過表達與干擾的巨噬細胞對腫瘤細胞的調節(a)巨噬細胞表面分子的改變-流式檢測TRAIL、FasL ； (b)腫瘤細胞凋亡-PI/Annexin V染色，Caspase相關分子改變。(c)腫瘤細胞增殖-CCK-8檢測；8、體內觀察SIRPa過表達與干擾的巨噬細胞對腫瘤的影響在預防和治療腫瘤模型中定期注射慢病毒載體介導的SIRPa過表達與干擾的巨噬細胞，觀察對腫瘤大小和小鼠生存時間的影響。本發明提供了信號調節蛋白α (SIRPa)的新用途。實驗結果表明1)如圖2所示，巨噬細胞SIRPa負性調控其向腫瘤細胞的遷移。與無H印al_6 細胞條件相比，巨噬細胞與ifepal-6細胞共培養時向!fepal-6遷移的能明顯增強，低表達 SIRPa促進巨噬細胞的這種遷移能力。2)如圖3所示，巨噬細胞SIRP α負性調控腫瘤炎癥微環境。圖3_1與3_2說明腫瘤微環境刺激巨噬細胞分泌IL-6、TNF a、ILl β等炎性因子，低表達SIRP α的BMDMs分泌炎性因子的能力強于對照組，。圖3-3說明SIRP α調控BMDMs與炎癥和免疫相關的信號通路。3)如圖4所示，巨噬細胞SIRP α負性調控細胞存活。低表達SIRP α的BMDMs在相應刺激下PARP與Caspase-3剪切體的表達低于對照組。4)如圖5顯示，巨噬細胞SIRP α負性調控腫瘤的生長。圖5_1顯示高表達SIRP a 的巨噬細胞培養上清明顯抑制B16F10腫瘤的生長，圖5-2顯示回輸慢病毒載體介導的高表達SIRP α的BMDMs抑制B16F10的生長。圖5_3顯示回輸慢病毒載體介導的高表達SIRP a 的巨噬細胞抑制H印al-6的生長。實驗結果證明巨噬細胞SIRPa負性調控腫瘤的發生發展。本發明提供了一種利用慢病毒載體針對腫瘤相關巨噬細胞的方法，可以用于預防和治療小鼠肝癌、黑色素瘤等腫瘤，進而可以預防和治療哺乳動物腫瘤，特別是與巨噬細胞相關的腫瘤如肝癌、乳腺癌等。本發明為SIRPa的臨床應用提供了新的思路。本發明提供了一種新型的腫瘤治療方案。


圖1是慢病毒表達質粒的構建、鑒定及包裝、感染。SIRP α表達特異性檢測。其中圖1-1 為 Western-Blot 檢測 LV-WT-SIRP α、LV-miRNA-SIRP α、LV-GFP 質粒包裝的慢病毒的感染效果；圖1-2為Wfestern-Blot檢測LV-miRNA-SIRP α包裝的慢病毒的不同滴度的感染效果以及腫瘤細胞Hepal-6表達SIRP α的情況。圖2是SIRP α與巨噬細胞遷移到腫瘤局部的能力其中圖2-1是利用Transwell方法，光鏡下觀察BMDMs KD Control組與!fepal-6 細胞共培養10hr、20hr后的遷移能力；圖2_2是對圖2_1的各組細胞計數后進行統計分析。圖3是SIRP α調節巨噬細胞在腫瘤微環境中的表型其中圖3-1為高低表達SIRP α的巨噬細胞與腫瘤細胞細胞共培養后IL_6、TNF α、 IL10、IL12等細胞因子的表達情況；圖3-2為ELISA檢測高低表達SIRP α的巨噬細胞與腫瘤細胞細胞共培養后IL-6、TNFa、IL10、IL12的水平；圖3_3為高低表達SIRP α的巨噬細胞與腫瘤細胞細胞共培養后相應信號通路的改變。圖4是SIRP α調節巨噬細胞存活的能力其中圖4-1是干擾SIRP α表達和對照的巨噬細胞在IFN γ誘導下發生凋亡情況。 分別檢測了參與凋亡途徑的caSpaSe3和PARP剪切情況；圖4-2是干擾SIRP α表達和對照的巨噬細胞在TNF+CHX的作用下發生凋亡情況，實驗分別檢測了 CaSpaSe3和PARP剪切情況。圖5是SIRP α調節腫瘤細胞體內生長的能力其中圖5-1為高低表達SIRP α的巨噬細胞共培養上清與B16F10腫瘤生長的能力；圖5-2為體內回輸高低表達SIRP α的巨噬細胞與B16F10腫瘤生長的能力；圖5_3為高低表達SIRP α的巨噬細胞與!fepal-6細胞皮下接種C57小鼠后瘤體生長的能力。
具體實施例方式現結合實施例和附圖，對本發明作進一步描述，但本發明的實施并不僅限于此。實施例1 :SIRPa表達載體的構建、鑒定及干擾序列的合成、鑒定；SIRP α特異性表達檢測材料1) SIRP α慢病毒表達載體與干擾載體和包裝載體Lenti-Linker、VSVG, PACK,線性化載體 pcDNA6. 2-Gff/miR 購自 hvitrogen 公司；2)克隆引物為鼠源SIRP α mRNA開放閱讀框起始和終止引物序列，委托上海生工合成。3)克隆過程使用限制性內切酶和Τ4連接酶購自NEB公司。4) 293Τ, Hepal-6細胞系購自上海市中科院細胞所。
5) M-CSF等細胞因子購自P^rotech公司6)轉染試劑 PEI 購自 Polyplus-transfection 公司。7)兔抗鼠多克隆抗體SIRPa由本實驗室自行制備(參見Kharitonenkov A. Afamily of proteins that inhibit signalling through tyrosine kinase receptors. Nature. 1997Mar 13 ；386 (6621) :181-6.)。方法1)慢病毒表達載體與干擾載體構建、鑒定1. 1構建干擾慢病毒載體LV-miRNA-SIRP α構建慢病毒干擾載體LV-microRNA-SIRP α，設計干擾引物，引物序列如下上游TGCTGTCTATGAGCAGATGAGTTCACGTTTTGGCCACTGACTGACGTGAACTCCTGCTCATAG(SEQ ID NO 1)下游 CCTGTCTATGAGCAGGAGTTCACGTCAGTCAGTGGCCAAAACGTGAACTCATCTGCTCATAGAC(SEQ ID NO 2)引物于95 °C退火5min，冷卻至常溫形成二聚體。T4連接酶連接至pcDNA6. 2-Gff/miSIRP α制備干擾質粒。再以該質粒為模版，通過上游引物 GGACTAGTGCAGATATCAACAAGTTTG(SEQ ID NO 3)(帶 Spe 1 酶切位點)，和下游引物 GGACT AGTCTGCGGCCGCACCACTTTGTACAAGAAAGTCGG(SEQ ID NO 4)(帶 Spel 酶切位點)PCR 擴增 GFP-miSIRP α片段，得到約900bp的片段，經Spel單酶切后連入NheI和SpeI雙酶切的 pLenti-linker1. 2構建過表達慢病毒載體LV-WT-SIRP α以小鼠cDNA為模版，設計相應引物PCR獲得目的片段。引物序列如下上游GGATCCATGGAGCCCGCCGGCCCG(SEQID NO 5)(帶 BamHI 酶切位點)下游GCTAGCTCACTTCCTCTGGACCTGGACACT(SEQID NO 6)(帶 NheI 酶切位點)使用高保真KOD酶體系擴增獲得全長序列約1500bp，BamHl與NheI雙酶切表達載體和目的片段，酶切鑒定后，用T4連接酶連接至表達載體。幻慢病毒包裝，滴度檢測細胞在IOcm培養皿中培養至70%匯合度，采用磷酸鈣法(參照分子克隆，第三版，1282-1287頁)共轉慢病毒表達質粒與包裝質粒，60hr后收集培養上清，測定病毒滴度，具體方法如下傳四31~細胞IX IO5于M孔板，用無血清培養基稀釋病毒原液1 10、 1 100、1 1000加入M孔板，感染體積為200 μ 1。感染60hr后，收集細胞經流式計數鑒定。病毒滴度公式計算為滴度(/ml)比例％ X(IXlO5)X稀釋倍數/培養體積ml。3)干擾效果檢測分離小鼠骨髓細胞，M-CSF 100ng/ml培養7天，分化成熟形成巨噬細胞(BMDMs)， 1 X IO6/孔傳至6孔板，使用干擾SIRP α慢病毒，選定MOI值為50，80，感染8hr后換液，感染60hr后觀察感染效率，Western-Blot檢測效果。4) SIRP α特異性表達檢測本發明中腫瘤模型建立在H印al-6等腫瘤細胞模型基礎上，因此flfestern-Blot檢測H印al-6細胞SIRP α的表達情況。結果如圖1所示，通過flfestern-Blot檢測，LV_WT_SIRP α包裝的過表達慢病毒能夠有效的提高巨噬細胞SIRP α的表達，同時LV-miRNA-SIRPa包裝得到的慢病毒能下調巨噬細胞SIRP α的表達。如圖1-2所示，當MOI =40時，巨噬細胞可以獲得較好的干擾效果，因此以下實驗建立在此干擾效率的基礎上。同時圖1-2顯示，與BMDMs相比，!fepal-6細胞的 SIRPa表達量很低，說明SIRPa主要表達于BMDMs，具有較好的特異性。實施例2 =SIRPa與巨噬細胞遷移到腫瘤局部能力材料DTranswell 24 孑L板，0. 8 μ m，購自 Corning 公司2)0. 結晶紫、0.4%多聚甲醛購自國藥公司3)!fepal-6細胞購自上海市中科院細胞所4) C57/BL6小鼠購自中科院方法分離培養C57小鼠的BMDMs，腫瘤細胞Hepal-6種植于Transwell下室，BMDMs SIRPaKD, Control組細胞種植于細胞上室，加入無血清DMEM培養基，培養10hr、20hr后 0.4%多聚甲醛固定BMDM細胞15min，0. 結晶紫染色15-30min，生理鹽水洗凈后鏡下觀察，每孔在100X視野條件下隨機選取5個視野，計數細胞總數取均值為該孔細胞數。結果如圖2-1與圖2-2所示，無腫瘤細胞存在條件下，差異表達SIRPa的BMDMs遷移能力沒有明顯差別。在與ifepal-6細胞共培養時，巨噬細胞向ifepal-6遷移的能明顯增強， SIRPa抑制巨噬細胞向腫瘤細胞的遷移。說明SIRPa負性調節巨噬細胞向腫瘤局部遷移的能力。實施例3 =SIRP α調節巨噬細胞在腫瘤微環境中的表型材料l)mIL_6、mTNFa、mILlO、mIL12 等引物由生工公司合成，2) Sybr-Green 購自 TaKaRa 公司3)mIL-6、mTNFa、mILlO、mIL12 等 ELISA 試劑盒購自達科為公司4)B16細胞購自中科院5) TRIZOL 購自 Invitrogen 公司6) M-MLV逆轉錄體系購自Promega公司7)p-statl、p-stat3、IkBa、N0S2 等抗體購自 Cell signaling technology 公司方法1)H印al_6、B16 細胞與 BMDMs SIRP α KD，Control 細胞共培養 12M36hr，收取培養上清進行ELISA檢測，同時收取BMDMs的RNA，逆轉錄得到相應cDNA，通過Real-Time檢測相關細胞因子的表達。2) BMDMs與!fepal-6細胞細胞共培養0、l、3Jhr，收取蛋白，Western-Blot檢測相關分子的表達情況。結果圖3-1與圖3-2分別從mRNA與蛋白水平顯示腫瘤微環境能夠刺激巨噬細胞分泌 IL_6、TNFa、ILli3等炎性因子，低表達SIRP α的BMDMs分泌炎性因子的能力強于對照組， 提示低表達SIRPa可以促進腫瘤炎癥環境。
圖3-3顯示SIRP α調控BMDMs細胞與炎癥和免疫相關的信號通路，低表達SIRP α 可以增強乂&13、11^(1的磷酸化與，抑制Matl的磷酸化與N0S2的表達，提示SIRP α可以抑制巨噬細胞腫瘤相關的免疫功能。實施例4 =SIRP α與巨噬細胞存活的關系材料1) mTNF α、mIFN γ 訂購自 ρ印rotech 公司2) Caspase-3、PARP 抗體購自 CST 公司方法DBMDMs SIRP α KD 和 Control 組細胞 CHX lng/ml 預處理過夜，TNF α 10ng/ml 刺激 0、6、12hr，收取蛋白 Western-Blot 檢測 Caspase-3、PARP 的表達；2) IFNy 100ng/ml 朿Ij 激 BMDMs SIRP α KD Control 組細胞 0243648hr， Western-Blot 檢測 Caspase-3> PARP 的表達。結果如圖4-1 所示，低表達 SIRP α 的 BMDMs 在 CHX+TNF α 刺激下，PARP 與 Caspase-3 剪切體的表達低于對照組，提示SIRP α促進CHX+TNFa引起的細胞凋亡。圖4-2顯示低表達SIRP α的BMDMs抑制IFN γ誘導的PARP與Caspase-3剪切體的表達，提示SIRP α促進IFN γ引起的細胞凋亡。以上結果提示，SIRPa負性調節有害刺激引起的細胞凋亡。實施例5 =SIRPa與腫瘤體內生長的關系材料l)C57/BL6、Balb/c 小鼠購自中科院2)Hepal-6,B16F10細胞系購自中科院細胞所方法1)B16F10 細胞 5\105接種8&讓/(；小鼠腹腔，同時收集B16F10 與 BMDMs SIRPa KD, Control細胞共培養上清，待腫瘤接種5天后，腹腔注射KD、Control上清250ul/只/天， 連續12天后，小鼠活體成像檢測腫瘤大小；2) B16F10細胞5 X IO5接種Balb/c小鼠腹腔，同時體外分離小鼠BMDMs，干擾 SIRPa表達，待腫瘤接種5天后，將BMDMs SIRP a KD，Control 2 X IO6回輸小鼠體內，待12 天后活體成像檢測腫瘤大小；3)!1印&1-6細胞與腦01^ SIRP a KD，Control 細胞 1 :1 共 5 X IO6 皮下注射 C57/BL6 小鼠，并在相應時間測量腫瘤的大小。結果圖5-1顯示，低表達SIRPa的巨噬細胞培養上清能夠明顯促進B16F10腫瘤的生長，圖5-2顯示低表達SIRP α的BMDMs與B16F10共培養后亦能促進B16F10的生長。圖 5-3顯示，低表達SIRPa的巨噬細胞能促進H印al_6的生長。結果提示，低表達SIRPa的巨噬細胞能夠促進腫瘤的體內生長。
權利要求
1.信號調節蛋白α在制備預防和治療腫瘤的巨噬細胞中的應用。
2.根據權利要求1所述的信號調節蛋白α在制備預防和治療腫瘤的巨噬細胞中的應用，其特征在于通過構建SIRP α過表達的慢病毒載體，體外轉染分離獲得的巨噬細胞，獲得過表達SIRP α的巨噬細胞。
全文摘要
本發明屬于醫學生物工程技術領域。腫瘤中浸潤的巨噬細胞又稱腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)是浸潤的炎性細胞的主要成分。研究表明腫瘤細胞通過分泌細胞因子、趨化因子等從外周血中募集單核細胞到達腫瘤局部，誘導分化形成腫瘤相關巨噬細胞。信號調節蛋白α(SIRPα)屬于免疫球蛋白超家族(IgSF)成員，是一類主要表達在骨髓細胞和神經元細胞的胞膜蛋白，此外在平滑肌細胞、血管內皮細胞等也有少量表達。本發明的目的在于提供信號調節蛋白α的新用途，具體是通過構建SIRPα過表達的慢病毒載體，體外轉染分離獲得的巨噬細胞，獲得過表達SIRPα的巨噬細胞，用于預防和治療腫瘤。
文檔編號A61P35/00GK102335427SQ20111030380
公開日2012年2月1日 申請日期2011年10月10日 優先權日2011年10月10日
發明者潘宇飛, 王紅陽, 董立巍, 談冶雄 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學