專利名稱：一種活性多糖產品加工工藝優化方法
技術領域：
本發明屬于天然產物制備方法領域，更具體涉及一種活性多糖產品加工工藝的優化方法。
背景技術：
長期以來，人們認為糖類在生物體內的作用主要是作為能量源或作為結構材料， 但大量實驗證明，多糖及其綴合物與細胞各種生命現象的調節有著密切的聯系。從植物、動物和微生物等不同生物體所獲得的活性多糖具有各自不同的多種藥用生物活性，活性多糖能提高人體免疫力和治療多種疾病，具有良好的應用前景，活性多糖基礎研究及產品開發已越來越引起人們的廣泛關注。目前對多糖藥用生理活性的基礎研究、多糖加工工藝條件的探討雖有很多報道，但相關藥用生理活性研究缺乏對供試材料制備條件與活性試驗結果聯系的探討；加工工藝的探討僅限于以多糖得率為評價指標優化其提取工藝，以多糖保存率和蛋白脫除率為評價指標優化脫蛋白工藝。部分脫蛋白研究雖引入了活性評價指標，但對脫蛋白前粗多糖適宜獲取條件、活性多糖的組成等缺乏系統研究，在實際工作中，往往因為提取和脫蛋白工藝選擇不當，導致制備的多糖活性大大降低。因此，由于不同的工藝會影響多糖生物活性的保持，從活性多糖質量可控和經濟、高效開發產品的角度，建立科學合理的多糖提取、加工工藝綜合評價體系，成為促進多糖活性組分利用產品開發和廣泛應用的關鍵因素。

發明內容
為改善目前活性多糖產品開發加工工藝評價和選擇缺乏合理科學的方法，導致活性多糖產品質量管理混亂，產品開發和廣泛應用受到制約的現狀，本發明通過引入活性跟蹤技術，將多糖得率和活性保持綜合評價應用于活性多糖提取工藝的條件試驗過程；將多糖保存率、蛋白脫除率和活性保持綜合評價應用于活性多糖的脫蛋白純化條件試驗過程， 提出科學合理的活性多糖生產工藝優化方法。該方法簡單易行，能夠最大程度的保留制備出來的多糖的活性，并使具有活性的多糖樣品的提取率達到最大化，保證多糖的提取率和生物活性保持率均在一個較高的水平。本發明是通過如下技術方案實施的
一種活性多糖產品加工工藝優化方法包括如下步驟
1)、根據多糖產品最主要的標示生物活性選擇生物活性試驗方法；
2)、對原料進行預處理；
3)、以常用的水提醇沉工藝為基礎，選擇增效提取手段，對溫度、時間、功率、pH進行單因素試驗和正交試驗，以步驟1)所選擇的生物活性試驗方法，測定設計試驗所得各多糖樣品的生物活性，以提取物得率、生物活性檢測值綜合評分得分高的工藝條件，作為活性多糖的優化提取條件；
4)、依步驟3)選擇的優化提取條件提取的多糖樣品進行脫蛋白工藝條件試驗；以步驟1)所選擇的生物活性試驗方法，測定各脫蛋白工藝條件試驗所得多糖樣品的生物活性，以多糖保持率、蛋白脫除率和生物活性檢測值綜合評分得分高的工藝條件，作為活性多糖的優化脫蛋白工藝條件；
所述步驟3)的提取物得率、生物活性檢測值綜合評分得分高是指評分時以各指標的最大值為參照將數據進行歸一化，再給出不同的權重，提取物得率的權重系數為0. 4，生物活性檢測值的權重系數為0. 6，加權求和計算得分，得最高分；
所述步驟4)的多糖保持率、蛋白脫除率和生物活性檢測值綜合評分得分高是指評分時以各指標的最大值為參照將數據進行歸一化，再給出不同的權重，多糖保存率的權重系數為0. 3，生物活性檢測值的權重系數設為0. 3、蛋白脫除率的權重系數設為0. 4，加權求和計算得分，得最高分。所述步驟1)的標示生物活性包括抗腫瘤活性、抗病毒活性、抗氧化活性。所述步驟1)的生物活性試驗方法包括采用TBA法測定多糖抗小鼠肝組織脂質過氧化作用、根據Griess反應測定細胞培養上清液的NO2—量，間接反映巨噬細胞的NO生成量，判斷多糖抗脂質過氧化、細胞免疫及抗腫瘤活性的高低。所述步驟2)的預處理步驟選自凍融破壁工藝、乙醇浸提除去脂溶性成分工藝。所述步驟3)的增效提取手段選自微波、超聲波。所述步驟4)脫蛋白的方法選自Sevag法、酶法、三氯乙酸法和等電點法。除蛋白后的多糖樣品可進一步進行純化，所述純化方法選自纖維素柱層析、葡聚糖凝膠柱層析和膜透析。選擇纖維素柱層析、葡聚糖凝膠柱層析，分析層析洗脫液的蛋白洗脫曲線和糖洗脫曲線，結合各洗脫峰活性多糖活性跟蹤試驗，解析生物活性檢測值高且含量較高之分離部多糖的組成特征，測定主要活性組分多糖的分子量，為工藝評價和產品質量控制方法的提出提供依據。本發明的優點為采用本發明提出的技術方法，可以方便、快速、合理的實施活性多糖提取工藝條件和脫蛋白純化工藝條件的探索，評價和選擇活性多糖的加工工藝，實現高質、高效開發生產出具有不同原料活性的多糖產品，在能很好保持多糖生物活性的基礎上，又使制備的茶樹菇多糖的得率在一個較高的水平，與現有技術以多糖得率為指標優選提取工藝并獲得多糖后，將多糖樣品進行活性認定試驗的工藝研究方法想比較，本發明可以有效的避免由于加工工藝不當，造成加工過程中活性成分的大量丟失。


圖1為一種活性多糖產品加工工藝優化方法技術路線圖； 圖2為螺旋藻活性多糖微波提取正交試驗因素水平表；
圖3為螺旋藻活性多糖L9 (34)正交試驗設計表及結果；
圖4為螺旋藻活性多糖綜合評分方差分析表，注=Fatl5(2. 2) =19.0；
圖5為不同脫蛋白處理工藝對螺旋藻活性提取物多糖保存率、蛋白脫除率及活性的影響。
具體實施方式
①確定多糖產品主要標示活性不同種類的生物體材料，其活性多糖產品特征藥理活性存在差異，應根據材料的特點和現有基礎藥理研究已明確的藥用生物活性，定位產品的主要標示活性(如抗腫瘤、提高免疫力、抗氧化等)。②選擇適宜的活性試驗方法根據產品主要標示活性，選擇可靠、方便的活性試驗方法(如采用TBA法測定多糖抗小鼠肝組織脂質過氧化作用、根據Griess反應測定細胞培養上清液的NO2—量，間接反映巨噬細胞的NO生成量等，考察多糖抗脂質過氧化、細胞免疫及抗腫瘤活性)。③原材料提取物主要標示活性的認定將原材料在中性、50°C溫度條件下，經水提醇沉獲得活性粗多糖樣品，通過活性試驗明確活性提取物的生物活性。④原料預處理不同活性多糖產品其共存組分具有不同的特點，應根據活性多糖產品生產原材料的不同特點及多糖組成、生產工藝的不同，選擇差異化的預處理工藝(如凍融破壁、采用乙醇等溶劑除去脂溶性成分等)，在保證材料活性多糖生物活性的前提下，為高效率的提取、純化并得到活性多糖創造有利條件。⑤提取工藝條件的單因素試驗和正交試驗以常用的水提醇沉工藝為基礎，根據材料的特點，選擇微波、超聲波作為高效提取的手段，通過單因素試驗分別考察溫度、時間、 功率、PH等對提取過程的影響，確定正交試驗的因素和水平，以多糖提取率和活性試驗值綜合評分，以得分最高著為適宜的提取工藝，以選擇的適宜提取工藝條件加工獲得活性多糖
工業產品。⑥脫蛋白純化試驗采用不同脫蛋白工藝(如kvag法、酶法法聯用、三氯乙酸法、三氯乙酸法與Sevag法聯用、等電點法)對活性多糖工業產品進行脫蛋白處理，以多糖保持率、蛋白脫除率和生物活性指標值進行綜合評價，以得分最高者為適宜的脫蛋白工藝，以試驗確定的脫蛋白工藝對活性多糖工業產品進行脫蛋白處理，形成脫蛋白活性多糖工業產品。⑦解析主要質量指標成分，實現生產過程控制活性試驗跟蹤條件下，將優選工藝條件制備的脫蛋白活性多糖樣品透析出去小分子，纖維素、葡聚糖凝膠柱層析純化，通過解析柱層析洗脫液蛋白洗脫曲線和糖洗脫曲線，明確產品主要質量指標成分的組成、分子量， 通過分析不同批次產品主要質量指標成分，實現生產過程控制。實施例1
以螺旋藻活性多糖為例
1)、稱取螺旋藻鮮藻500g，加IOOOmL水攪勻，于_20°C凍融處理2次，加鮮藻3倍量的水后，依正交試驗設計的因素和水平，分別調節溶液PH 8-10,400-1000w微波提取4-8min 后(見圖2)，4000rpm離心15min，棄沉淀，取上清液；
2)、取1)所得正交試驗各上清液樣，減壓濃縮至1/3體積，加入3倍量95%乙醇，4°C靜置M!，4(KK)rpm離心15min，得各沉淀分離樣，測定各沉淀分離樣活性提取物得率和抗肝組織脂質過氧化活性，綜合評價確定優化提取條件，相關試驗結果見圖3、圖4 ；以優化條件提取制備活性提取物，冷凍干燥即得螺旋藻活性多糖；該螺旋藻活性多糖其主要活性成分是分子量分別為100000和9500的結合蛋白多糖，其中100000多糖含量> 9. 38%，分子量為 9500的多糖含量彡22. 12%ο3)、取2)優化條件下制備所得螺旋藻上清液，快速攪拌下緩慢加入粉末狀固體硫酸銨，使硫酸銨濃度達10%，沉淀部分蛋白，4000rpm離心15min，棄沉淀(去除的蛋白可復性利用)，取上清液；
4)、取3)所得上清液，分別以Sevag法一次、Sevag法四次、三氯乙酸法、酶法進行脫蛋白處理，4000rpm離心15min后，測定各脫蛋白樣多糖保存率、蛋白脫除率和抗肝組織脂質過氧化活性，綜合評價確定優化脫蛋白工藝條件；以優化工藝條件對3)所得上清液進行脫蛋白處理經試驗后所選擇的最終條件為將3)所得上清液減壓濃縮至1/3體積，與氯仿-正丁醇混合液(氯仿正丁醇=4:1)等體積混合后，劇烈震蕩5min，靜置濁后，4000rpm 離心15min，離心液加3倍體積95%乙醇，醇析Mh，4000rpm離心15min，丙酮洗滌沉淀， 沉淀冷凍干燥即得脫蛋白螺旋藻活性多糖。該脫蛋白螺旋藻活性多糖主要活性成分是的分子量分別為100000和9500的結合蛋白多糖，其中分子量100000的結合蛋白多糖含量彡19. 51%，分子量為9500結合蛋白多糖含量彡46. 02%。相關結果見圖4。分別測定螺旋藻活性提取物總量和提取物抗肝組織脂質過氧化活性，計算螺旋藻活性提取物得率和抑制率，進行多指標綜合評分。評分時以各指標的最大值為參照將數據進行歸一化，再給出不同的權重。提取物得率的權重系數設為0. 4，抑制率的權重系數設為 0. 6，以綜合分進行統計分析，結果見圖3、圖4。其中綜合評分Y=O. 4 X 100 / 0. 2037 + 0. 6 X 100 / 0. 4189，公式 1); 綜合比較三種工藝，確定微波提取提取溶液pH10、400w、處理4 min為優選工藝。對于脫蛋白的工藝選擇，見圖5，參考公式1的計算方式，由計算結果可知，脫蛋白方法選擇Sevag法1次操作具有較高的多糖保存率和很好的蛋白脫除率，且抗肝組織脂質過氧化活性能得到很好的保持，故選擇kvag法1次操作作為脫蛋白螺旋藻活性提取物的脫蛋白加工工藝。以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋范圍。
權利要求
1.一種活性多糖產品加工工藝優化方法，其特征在于所述優化方法包括如下步驟1)、根據多糖產品最主要的標示生物活性選擇生物活性試驗方法；2)、對原料進行預處理；3)、以常用的水提醇沉工藝為基礎，選擇增效提取手段，對溫度、時間、功率、pH進行單因素試驗和正交試驗，以步驟1)所選擇的生物活性試驗方法，測定設計試驗所得各多糖樣品的生物活性，以提取物得率、生物活性檢測值綜合評分得分高的工藝條件，作為活性多糖的優化提取條件；4)、依步驟3)選擇的優化提取條件提取的多糖樣品進行脫蛋白工藝條件試驗；以步驟 1)所選擇的生物活性試驗方法，測定各脫蛋白工藝條件試驗所得多糖樣品的生物活性，以多糖保持率、蛋白脫除率和生物活性檢測值綜合評分得分高的工藝條件，作為活性多糖的優化脫蛋白工藝條件。
2.根據權利要求1所述的一種活性多糖產品加工工藝優化方法，其特征在于所述步驟3)的提取物得率、生物活性檢測值綜合評分得分高是指評分時以各指標的最大值為參照將數據進行歸一化，再給出不同的權重，提取物得率的權重系數為0.4，生物活性檢測值的權重系數為0. 6，加權求和計算得分，得最高分。
3.根據權利要求1所述的一種活性多糖產品加工工藝優化方法，其特征在于所述步驟4)的多糖保持率、蛋白脫除率和生物活性檢測值綜合評分得分高是指評分時以各指標的最大值為參照將數據進行歸一化，再給出不同的權重，多糖保存率的權重系數為0. 3，生物活性檢測值的權重系數為0. 3、蛋白脫除率的權重系數為0. 4，加權求和計算得分，得最高分。
4.根據權利要求1所述的一種活性多糖產品加工工藝優化方法，其特征在于所述步驟1)的標示生物活性包括抗腫瘤活性、抗病毒活性、抗氧化活性。
5.根據權利要求1所述的一種活性多糖產品加工工藝優化方法，其特征在于所述步驟1)的生物活性試驗方法包括采用TBA法測定多糖抗小鼠肝組織脂質過氧化作用、根據 Griess反應測定細胞培養上清液的NO2—量，間接反映巨噬細胞的NO生成量，判斷多糖抗脂質過氧化、細胞免疫及抗腫瘤活性的高低。
6.根據權利要求1所述的一種活性多糖產品加工工藝優化方法，其特征在于所述步驟2)的預處理步驟選自凍融破壁工藝、乙醇浸提除去脂溶性成分工藝。
7.根據權利要求1所述的一種活性多糖產品加工工藝優化方法，其特征在于所述步驟3)的增效提取手段選自微波、超聲波。
8.根據權利要求1所述的一種活性多糖產品加工工藝優化方法，其特征在于所述步驟4)脫蛋白的方法選自Sevag法、酶法、三氯乙酸法和等電點法。
全文摘要
本發明涉及一種活性多糖產品加工工藝優化方法，該方法通過引入活性跟蹤技術，將多糖得率和活性保持綜合評價應用于活性多糖提取工藝的條件試驗過程；將多糖保存率、蛋白脫除率和活性保持綜合評價應用于活性多糖的脫蛋白純化條件試驗過程；通過纖維素、葡聚糖凝膠柱層析，對脫蛋白活性多糖產品進行純化分離過程研究，活性試驗跟蹤，了解主要活性分離部各峰的組成、多糖分子量，實現生產過程質量控制，提出科學合理的活性多糖生產工藝優化方法。采用本發明提出的技術方法，可以方便、快速、合理的實施活性多糖提取工藝條件和脫蛋白純化工藝條件的探索，評價和選擇活性多糖的加工工藝，實現高質、高效開發生產不同原料活性多糖產品。
文檔編號A61P35/00GK102295708SQ20111016378
公開日2011年12月28日 申請日期2011年6月17日 優先權日2011年6月17日
發明者俞白楠, 葉舟, 呂千, 呂楊蘭, 康彥斌, 汪世華, 黃碧芳 申請人:福建農林大學