專利名稱：一種具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實提取物及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種中藥提取法，具體涉及一種具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實提取物及其制備方法和應用。
背景技術：
芡實始載于《神農本草經》，列為上品，又名雞頭子，歷版《中國藥典》均有記載，為睡蓮科一年生水生草本植物芡的干燥成熟種仁，具有益腎固精，補脾止瀉，祛濕止帶的功效，主治夢遺、滑精，遺尿、尿頻、脾虛久瀉、白濁、帶下，素有“水中人參”和“水中桂圓”的美譽，是傳統的中藥材和珍貴的天然補品。我國是世界上老齡化發展速度最快的國家之一，也是老齡人口最多的國家之一。
2005年底全國I %人口抽樣顯示，65歲以上人口占總人口數的7.7%，預測到2020年65歲以上老年人口將達11. 92%。衰老是一種復雜的生命現象，衰老時機體的各項機能均趨于下降，通常表現為一系列形體的老化及行為異常，如毛發脫落、皮膚松弛、老年斑堆積、思維判斷能力減弱甚至癡呆等。因此，形體的老化及行為學考察通常被作為衰老模型制備成功的標志。目前有關衰老的學說很多，包括自由基學說、遺傳程序學說、脂褐素累積學說、內分泌功能減退學說等，其中自由基損傷在衰老機制的研究中占有十分重要的地位。GSH-Px是機體一種抗氧化的重要酶，它特異地催化還原型谷胱甘肽(GSH)對過氧化物的還原反應，其作用在于阻斷由過氧化物引發的自由基對機體的損害，保護細胞膜免受過氧化損傷。一氧化氮合成酶(NOS)在體內能催化NO生成，NO既是一種神經遞質，也是一種極不穩定的強氧化劑，但腦內過多的NO沉積會發生細胞毒性反應，這可能與誘生型NOS的過表達有關。乙酰膽堿酯酶(AChE)是在膽堿能神經元的突觸處水解神經遞質乙酰膽堿(ACh)的酶，AChE含量的變化在一定程度上可體現膽堿能神經元的功能活性。中醫藥在抗氧化、抗衰老活性方面具有獨體的優勢，因此從中草藥中尋找純天然、抗氧化、抗衰老活性強的物質具有重要的意義。

發明內容
發明目的本發明的目的是為了解決現有技術的不足，從中藥芡實中提取分離得到抗氧化、抗衰老活性強，不良反應低的提取物，本發明另一個目的是提供芡實提取物的制備方法和其應用。技術方案為了實現以上目的，本發明提供的具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實提取物，它是通過以下方法制備得到(I)取芡實藥材，凈選，去除雜質，置多功能提取罐內，加4至8倍量濃度為80%至90%的乙醇，提取I至3次，每次提取6至8小時，合并提取液，過濾，得濾液，減壓濃縮，蒸干，得芡實乙醇提取物，備用。
(2)取上述步驟(I)制備得到的芡實乙醇提取物，加水混懸后，用乙酸乙酯或正丁醇萃取3至6次，得乙酸乙酯或正丁醇萃取液，減壓濃縮，蒸干，得芡實的乙酸乙酯或正丁醇提取物，備用；(3) 取步驟(2)制備得到的乙酸乙酯或正丁醇提取物上大孔樹脂柱，先分別用水和濃度為10%乙醇洗脫，再用濃度為50% 60%的乙醇洗脫，薄層色譜檢識、收集50% 60%乙醇洗脫液、濃縮、減壓干燥得到含有5，7，4'-三羥基二氫黃酮的芡實提取物。作為優選方案，以上所述的具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實提取物中5，7，4/ -三羥基二氫黃酮的百分含量為10%至20%。作為優選方案，以上所述的具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實提取物，其步驟(I)所述的提取方法為回流提取法；步驟(I)所述的提取溶劑乙醇的濃度為80%。本發明通過大量實驗篩選提取方法和提取溶劑，實驗結果表明，當提取溶劑為濃度為80%乙醇，在回流提取法下，芡實中抗氧化、抗衰老活性成分提取效率最高。本發明步驟(I)得到乙醇提取物，為了進一步提純活性成分，本發明通過優選的溶劑進行萃取，通過大量實驗篩選表明，采用乙酸乙酯或正丁醇進行萃取能夠將芡實乙醇提取物中的抗氧化、抗衰老活性成分最大限度的分離出，將雜質去掉，從而保證藥效，最大程度降低不良反應。本發明提供的具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實提取物的制備方法，其包括以下步驟(I)取芡實藥材，凈選，去除雜質，置多功能提取罐內，加4至8倍量濃度為80%至90%的乙醇，提取I至3次，每次提取6至8小時，合并提取液，過濾，得濾液，減壓濃縮，蒸干，得芡實乙醇提取物，備用。(2)取上述步驟(I)制備得到的芡實乙醇提取物，加水混懸后，用乙酸乙酯或正丁醇萃取3至6次，得乙酸乙酯或正丁醇萃取液，減壓濃縮，蒸干，得芡實的乙酸乙酯或正丁醇提取物，備用；(3)取步驟(2)制備得到的乙酸乙酯或正丁醇提取物上大孔樹脂柱，先分別用水和濃度為10%乙醇洗脫，再用濃度為50% 60%的乙醇洗脫，薄層色譜檢識、收集50% 60%乙醇洗脫液、濃縮、減壓干燥得到含有5，7，4'-三羥基二氫黃酮的芡實提取物。作為優選方案，以上所述的具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實提取物的制備方法，步驟(I)所述的提取方法為回流提取法、提取溶劑乙醇的濃度為80%。作為優選方案，以上所述的具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實提取物的制備方法，步驟(3)所述的大孔吸附樹脂為DlOl型大孔吸附樹脂。本發明通過正交實驗篩選不同極性不同型號的大孔樹脂、不同濃度(10%、20%、30%、40%、50%、60%、70% )的乙醇洗脫齊U，以抗氧化、抗衰老為藥效評價指標，實驗結果表明以非極性大孔吸附樹脂DlOl型大孔吸附樹脂除雜效果比較好，且實驗結果表明濃度為10%的乙醇可以洗脫大部分極性稍大的雜質，而濃度為50%至60%的乙醇對抗氧化、抗衰老活性成分的洗脫能力最好，因此本發明經正交實驗篩選結果確定出最佳的吸附材料為DlOl型大孔吸附樹脂和最佳的洗脫劑為濃度為50%至60%的乙醇。作為優選方案，以上所述的具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實提取物的制備方法分離得到的芡實提取物，檢測結構表明提取物中5，7，4'-三羥基二氫黃酮的百分含量為10%至 20%。本發明提供的具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實提取物藥理實驗結果表明具有很好的抗氧化、延緩衰老的功效，可以用于制備抗氧化、抗衰老保健品或用于制備抗缺血性損傷疾病藥物。有益效果本發明提供的具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實提取物和現有技術相比具有以下優點I、本發明以抗氧化、抗衰老為評價指標，通過大量實驗優選出最佳制備方法，分離得到的芡實提取物，活性成分含量高，雜質少，藥效明顯，在曠場、Morris水迷宮的實驗結果證實，本發明提供的具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實提取物對亞急性衰老小鼠的學習記憶能力有很好的改善作用，對亞急性衰老小鼠的脾、腎臟器指數有明顯提高作用，且可以提高亞急性衰老小鼠腦組織NOS、GSH-Px活力，降低AChE活力。2、本發明提供的芡實提取物能提高亞急性衰老小鼠腦組織GSH-Px的活力，并隨 劑量的增高，酶活性有增加的趨勢，顯示出了良好的抗氧化作用，清除自由基和抗衰老作用。3、實驗結果表明本發明提供的芡實提取物能夠降低亞急性衰老小鼠腦組織中AChE的活力，從而可提高小鼠腦內ACh的含量，具有改善衰老引起的學習記憶功能下降的作用。4、D_半乳糖致衰老模型實驗結果表明，本發明提供的芡實提取物能明顯抑制海馬神經細胞的凋亡，甚至達到或超過正常水平，進一步從病理學角度證明芡實提取物能改善D-半乳糖致衰老小鼠學習記憶能力。本發明提供的芡實提取物，活性強，藥效全面，且不良反應低，和現有技術相比取得了很好的技術效果。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例I一種具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實提取物，它通過以下方法制備得到(I)取芡實藥材，凈選，去除雜質，置多功能提取罐內，加8倍量濃度為80%的乙醇，回流提取3次，每次提取8小時，合并提取液，過濾，得濾液，減壓濃縮，蒸干，得芡實乙醇提取物，備用。(2)取上述步驟(I)制備得到的芡實乙醇提取物，加水混懸后，用相同體積的乙酸乙酯萃取6次，得乙酸乙酯萃取液，減壓濃縮，蒸干，得芡實的乙酸乙酯提取物，備用；(3)取步驟⑵制備得到的乙酸乙酯提取物上DlOl型大孔吸附樹脂，先分別用水和濃度為10%乙醇洗脫，再用濃度為50% 60%的乙醇洗脫，薄層色譜檢識、收集50% 60%乙醇洗脫液、濃縮、減壓干燥得到含有10% 5，7，4'-三羥基二氫黃酮的芡實提取物。實施例2一種具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實提取物，它通過以下方法制備得到
(I)取芡實藥材，凈選，去除雜質，置多功能提取罐內，加6倍量濃度為80%的乙醇，回流提取3次，每次提取8小時，合并提取液，過濾，得濾液，減壓濃縮，蒸干，得芡實乙醇提取物，備用。(2)取上述步驟(I)制備得到的芡實乙醇提取物，加水混懸后，用相同體積的正丁醇萃取6次，得正丁醇萃取液，減壓濃縮，蒸干，得芡實的正丁醇提取物，備用；(3)取步驟(2)制備得到的正丁醇提取物上DlOl型大孔吸附樹脂，先分別用水和濃度為10 %乙醇洗脫，再用濃度為50 % 60 %的乙醇洗脫，薄層色譜檢識、收集50 % 60%乙醇洗脫液、濃縮、減壓干燥得到含有20% 5，7，4'-三羥基二氫黃酮的芡實提取物。實施例3抗氧化、抗衰老實驗I、實驗材料
I. I試驗藥物芡實購于北京中葛綠元科技有限公司，批號110901 ;本發明實施例I和實施2制備得到的提取物。D-半乳糖，上海寶曼生物有限公司，批號110523。GSH_Px、N0S、AChE、考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號20120416。I. 2試驗動物清潔級KM小鼠，由江蘇大學實驗動物中心提供，動物合格證號SCXK (蘇)2009-0002 。I. 3實驗儀器小鼠曠場裝置，上海軟隆科技發展有限公司。SLY-WMS型Morris水迷宮，北京碩林苑科技有限公司。FSH-2A可調高速電動勻漿機，金壇市金南儀器廠。LXJ-II B低速大容量多管離心機，南京曉曉儀器設備有限公司。Powerwave X340全波長酶標儀，美國Bio-Tek公司。2.實驗方法2. I本發明中提取物對D-半乳糖所致小鼠亞急性衰老模型的作用取體重18 22g的雄性KM小鼠104只，隨機分成8組，S卩正常對照組、D-半乳糖模型對照組、本發明芡實80%乙醇提取物高、低劑量組、本發明實施例I提取物高、低劑量組、本發明實施例2提取物高、低劑量組，每組15只小鼠，除正常對照組外，其余各組小鼠每日腹腔注射0. 5% D-半乳糖，0. lml/10g，連續注射6周，正常對照組腹腔注射等量的無菌生理鹽水，同時開始給藥，芡實80%乙醇提取物、實施例I提取物和實施例2提取物的高、低劑量組小鼠每日灌胃給藥劑量分別為0. 5g/kg和0. 25g/kg ;正常對照組及模型對照組每日灌胃同體積的生理鹽水。連續給藥6周后，測定各組小鼠的自主活動情況，記錄小鼠90秒內在曠場中央區和周邊區的平均運行速度及跨格次數；然后采用水迷宮訓練小鼠的學習記憶能力，記錄其學習成績，即2分鐘內找到固定平臺的潛伏期及撤離平臺后，穿越原平臺所在象限的次數；比較組間差異并進行統計學處理；實驗最后，脫頸椎處死小鼠，記錄小鼠的體重，取脾、腎稱重，計算臟器指數。另取小鼠的腦組織勻漿后，測定腦組織中的GSH-Px、N0S、AChE的活性，比較組間差異并進行統計學處理。結合上述各項指標評述本發明中各提取物的作用效果。分離小鼠腦組織海馬區，石蠟切片經染色后，光學顯微鏡下觀察細胞染色情況。3.實驗結果3. I本發明中提取物對D-半乳糖所致小鼠亞急性衰老模型的作用連續腹腔注射D-半乳糖6周后，除正常對照組外，各組小鼠肉眼可見皮毛無光澤且稀疏、行動較為遲緩、精神萎靡不振等現象，對小鼠的自主活動的影響見表I ;對小鼠水迷宮實驗的影響見表2 ;對小鼠器官指數的影響見表3 ;對小鼠腦組織中各項生化指標的檢驗結果見表4。表I本發明提取物對亞急性衰老小鼠曠場實驗的影響(j±SD, n=13)
權利要求
1.一種具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實提取物，其特征在于，它通過以下方法制備得到 (1)取芡實藥材，凈選，去除雜質，置多功能提取罐內，加4至8倍量濃度為80%至90%的乙醇，提取I至3次，每次提取6至8小時，合并提取液，過濾，得濾液，減壓濃縮，蒸干，得芡實乙醇提取物，備用。
(2)取上述步驟(I)制備得到的芡實乙醇提取物，加水混懸后，用乙酸乙酯或正丁醇萃取3至6次，得乙酸乙酯或正丁醇萃取液，減壓濃縮，蒸干，得芡實的乙酸乙酯或正丁醇提取物，備用； (3)取步驟(2)制備得到的乙酸乙酯或正丁醇提取物上大孔樹脂柱，先分別用水和濃度為10%乙醇洗脫，再用濃度為50% 60%的乙醇洗脫，薄層色譜檢識、收集50% 60% 乙醇洗脫液、濃縮、減壓干燥得到含有5，7，4'-三羥基二氫黃酮的芡實提取物。
2.根據權利要求I所述的具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實提取物，其特征在于，步驟(I)所述的提取方法為回流提取法。
3.根據權利要求I所述的具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實提取物，其特征在于，步驟(I)所述的提取溶劑乙醇的濃度為80%。
4.權利要求I所述的具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實提取物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)取芡實藥材，凈選，去除雜質，置多功能提取罐內，加4至8倍量濃度為80%至90%的乙醇，提取I至3次，每次提取6至8小時，合并提取液，過濾，得濾液，減壓濃縮，蒸干，得芡實乙醇提取物，備用。
(2)取上述步驟(I)制備得到的芡實乙醇提取物，加水混懸后，用乙酸乙酯或正丁醇萃取3至6次，得乙酸乙酯或正丁醇萃取液，減壓濃縮，蒸干，得芡實的乙酸乙酯或正丁醇提取物，備用； (3)取步驟(2)制備得到的乙酸乙酯或正丁醇提取物上大孔樹脂柱，先分別用水和濃度為10 %乙醇洗脫，再用濃度為50 % 60 %的乙醇洗脫，薄層色譜檢識、收集50 % 60 %乙醇洗脫液、濃縮、減壓干燥得到含有5，7，4'-三羥基二氫黃酮的芡實提取物。
5.根據權利要求4所述的具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實提取物的制備方法，其特征在于，步驟(I)所述的提取方法為回流提取法、提取溶劑乙醇的濃度為80%。
6.根據權利要求4所述的具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實提取物的制備方法，其特征在于，步驟(3)所述的大孔吸附樹脂為DlOl型大孔吸附樹脂。
7.根據權利要求4所述的具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實提取物的制備方法，其特征在于，步驟(3)所述的芡實提取物中5，7，4'-三羥基二氫黃酮的百分含量為10至20%。
8.權利要求I至3任一項所述的具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實提取物在制備抗氧化、抗衰老保健品中的應用。
9.權利要求I至3任一項所述的具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實提取物在制備防治缺血性損傷疾病藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實提取物及其制備方法，本發明通過提取溶劑、提取方法、萃取方法、大孔樹脂分離方法的系統優化，得到最佳的制備工藝，制備得到的芡實提取物，實驗結果表明，本發明提供的芡實提取物能夠明顯提高亞急性衰老小鼠曠場實驗中的活動能力和探究行為以及小鼠水迷宮測試中的學習成績和記憶能力，且能明顯提高小鼠的脾、腎臟器指數；并能升高腦組織中GSH-Px、NOS的活性及蛋白含量；降低腦組織AChE的活性；還能明顯改善腦組織病理改變，具有很好的抗氧化、抗衰老的功效。
文檔編號A61K36/62GK102793754SQ20121022604
公開日2012年11月28日 申請日期2012年7月3日 優先權日2012年7月3日
發明者吳啟南, 周婧, 樂巍, 段金廒, 沈蓓 申請人:南京中醫藥大學