專利名稱：杜仲化學成分作為腎臟保護劑的新用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及傳統中藥材杜仲及其若干化學成分的新用途，特別是杜仲、杜仲提取物以及京尼平和京尼平苷作為腎臟保護劑的制藥用途。
背景技術：
中毒性腎病是指由外源性或內源性腎毒性物質異常引起的腎臟病(方國祥.中毒性腎病.人民衛生出版社，2006年7月)。隨著工業發展，化工原料、醫藥及各種農藥的出現，增加了環境污染，使人群接觸腎毒物的機會增加，中毒性腎病的發病率亦隨之增長，嚴重的可引起急和/或慢性腎功能衰竭，后期病死率高，是危害人類健康的主要疾病之一。外源性腎毒物質，以職業上接觸的重金屬、化學毒物等為主；日常生活中接觸洗滌劑、食品添加齊IJ、化妝品、家用殺蟲劑，生活嗜好如煙、酒、麻醉齊 、致幻劑等化學物質，也可引起中毒性腎病；大部分藥物也有腎毒性，包括抗生素、解熱鎮痛藥、金屬制劑、造影劑、利尿劑，部分中草藥如關木通雷公藤等。常見的具有腎毒性的重金屬元素有汞、鉛、金、鎘、銀、錳、鉻、鎳、鉈、鋅、釩、銻、錫、 銅、鉬、鉍、鍺、鐵等。長期接觸(吸入)汽車排放的尾氣，導致鉛中毒的危險性增加，食用重金屬污染過的飲用水、蔬菜、糧食等，或在環境污染區生活工作引起中毒性腎病的機率大大增加。日本的水俁病，就是由于食用了汞污染的水產品所致，我國和日本、德國、瑞典等國， 均有由于鎘污染而引起的腎小管損害與終末期腎衰的報道。鎘被美國毒物管理委員會列為第六位危害人體健康的有毒物質，環境中的鎘不能生物降解，隨著工農業生產的發展，受污染量逐年上升。腎損傷是鎘對人體的主要危害，鎘誘導的中毒性腎病會引起腎小球和腎小管尤其是腎小管近端的嚴重損害。目前重金屬中毒治療的關鍵只能是預防，出現癥狀后立即停止接觸。急性中毒者洗胃，應用解毒劑(根據重金屬的種類可應用依地酸鈣鈉、二巰丙磺鈉、二巰丁二鈉等靜脈滴注)及緊急透析治療，臨床尚沒有特效治療藥物，抗氧化劑和金屬鏊合劑近年有所應用。天然產物尤其是中藥在重金屬中毒性腎病中的預防和治療作用也受到越來越廣泛的重視和研究，如人們發現柚皮苷對于鎘誘導的腎損傷有保護作用，這種保護作用包括通過自由基清除，抗氧化和螯合的作用途徑起效(Renugadevi，J. and Prabu, S. Μ.， 2009.Naringenin protects against cadmium-induced oxidative renal dysfunction in rats. Toxicology 256,128-134) 0洋蔥和大蒜油也具有強的對鎘誘導的腎臟氧化應激損傷的保護作用，并呈劑量依賴關系，研究表明是通過減少脂質過氧化和提高了抗氧化的能力的途徑發揮的作用(Suru，S. M.，2008. Onion and garlic extracts lessen cadmium-induced nephrotoxicity in rats. Biometals 21,623-633)。此夕卜，據說復方冬蟲夏草對鎘致大鼠腎毒性有明顯的改善作用，聯合核酸和V。效果更佳，機制可能與促進鎘排出有關(朱萍萍，廖惠珍，尤夏洪等.復方冬蟲夏草對大鼠鎘致腎毒性的改善作用，福建醫科大學學報，2007 (6) :11)。采用大鼠亞急性鎘暴露損傷模型，觀察花粉與枸杞聯合使用對鎘性損傷的拮抗作用，結果表明花粉枸杞可拮抗鎘所致脂質過氧化，增強抗氧化功能，花粉枸杞干預后，染鎘大鼠腎鎘明顯降低，尿鎘排出差值有增高趨勢，提示花粉枸杞可能具有一定的促排鎘作用 [朱萍萍，王文祥，廖惠珍等.花粉枸杞對亞急性鎘中毒拮抗作用.中國公共衛生，2008， 24(3) :354-355] 腫瘤治療藥物順鉬可明顯升高腎組織氧化應激水平并嚴重損傷腎臟的結構和功能引起中毒性腎病，研究表明姜黃素有較弱的直接抗順鉬腎毒性作用，并且用姜黃素預處理上調HO-I蛋白表達及活力能顯著增強其抗順鉬腎毒性作用[張英，黃維義，王順蓉等·姜黃素抗順鉬腎毒性作用及其機制研究.時珍國醫國藥，2007，18(7) :1673-167 。銀杏葉提取物能顯著誘導腎內HO-I的表達并減輕HgCl2所致的急性腎損傷，其作用機制與 HO-I增強腎組織抗氧化能力有關[張英，曾維誠，陳蓉等.銀杏葉提取物抗氯化汞急性腎損傷的實驗研究.中國現代醫學雜志，2006，16 (8) :1167-1170]。王飛等觀察了沙棘油和五味子乙素對大鼠染鎘致腎損傷的影響，結果表明二者對鎘染毒致大鼠腎損傷的恢復有一定的促進作用[王飛，徐兆發，馮雪英.沙棘油和五味子乙素對鎘致大鼠腎損傷的影響.中國毒理學會第五次全國學術大會論文集.2009 :165-169] 0重金屬引起的腎臟損害的可能機制有以下3方面1)直接細胞毒性作用。多數重金屬有直接毒性作用，當含有重金屬的原尿流經近曲小管時，使腎小管上皮細胞發生空泡、 變性甚至壞死。2)免疫損傷。某些重金屬如汞、金等，可損傷腎組織，使其抗原性發生改變， 產生自身抗體，引起腎小球免疫性損傷。3)腎缺血。重金屬的直接毒性作用造成腎小管功能障礙或急性腎小管壞死，或其溶血作用引起溶血尿毒癥綜合征，使流經致密斑的尿流減慢，尿鈉增高，激活腎素、血管緊張素系統，導致腎血管痙攣，腎缺血，并通過細胞內鈣離子積聚、磷酸酯酶激活、花生四烯酸產物生成、氧自由基產生等環節造成腎損傷。重金屬對腎細胞的直接毒性作用是腎損傷的主要原因且研究較多。重金屬進入人體后，血液中腎毒性物質經腎小球濾過到達腎小管，首先抵達近曲小管，蓄積于細胞內的有毒藥物及其代謝產物可通過降低線粒體功能和ATP的合成、增加氧化應激反應、降低谷胱甘肽和其他抗氧化物質的排出、抑制磷脂代謝以及炎性介質腫瘤壞死因子TNF-α的升高增加i-NOS表達，啟動N0/i-N0S途徑、破壞蛋白質合成等途徑損傷腎小管細胞，腎小管細胞壞死主要在近曲小管。氧化損傷是重金屬直接細胞毒性的重要機制之一。研究表明腎損傷與重金屬引起的氧自由基生成有關[Wat jen, W. and Beyersmann，D.，2004. Cadmium-induced apoptosis in C6glioma cells :influence of oxidative stress. Biometals 17，65-78]，已證明在重金屬中毒時有氧自由基的生成過多和脂質的過氧化反應存在。例如大鼠染鎘后可使腎臟的SOD的活性受到抑制并可增加肝腎的脂質過氧化反應。染鎘后2h，大鼠腎皮質的鎘含量達到峰值，開始出現超微結構改變，氧自由基的生成及丙二醛均較對照組升高[Joseph， Pius. Cadmium-Induced Cell Transformation and Tumori2 genesis Are Associated with Transcriptional Activation of c_fos，c_jun，and c-myc Proto-Oncogenes :Role of Cellular Calcium and Reactive Oxygen Species[J]. Toxicological sciences， 2001,16(2) J95-303;楊光，仲來福.鎘所致腎毒性及氧化性損害機制.毒理學雜志， 2005，19(3) :233]。SOD和GSH、CAT的活力降低，使細胞抗氧化的能力減弱，從而細胞膜的穩定性明顯降低細胞更易受損[Singhal, R. K.，Anderson, Μ. Ε. and Meister，Α.，1987.Glutathione, a first line of defense against cadmium toxicity. FASEB J 1， 220-223 ；Chelikani, P. , Fita, I.and Loewen, P. C. ,2004.Diversity of structures and properties among catalases. Cellular and Molecular Life Sciences 61，192-208]。因此提高抗氧化能力和減少脂質過氧化是減小細胞損傷的兩個重要途徑。能量障礙是細胞損傷的重要病理環節，重金屬中毒時腎細胞內ATP水平下降使 Na+-K+-ATP 酶活性降低[Wilson, P. D.，Devuyst, 0.，Li，X.，Gatti, L，Falkenstein, D.，Robinson，S.，Fambrough, D.and Burrow, C. R. , 2000.Apical plasma membrane mispoIariζation of NaK-ATPase in polycystic kidney disease epithelia is associated with aberrant expression of the beta2 isoform. Am J Pathol 156， 253468]，導致細胞膜功能和通透性改變，細胞容量調節功能受損，細胞內鈉、氯積聚， 攝入水增多致細胞水腫，甚至壞死[Dobrota, D.，Matejovicova, M.，Kurella, E. G. and Boldyrev, Α. Α. ,1999. Na/K-ATPase under oxidative stress :molecular mechanisms of injury. Cell Mol Neurobiol 19，141-149]。ATP合成減少和離子泵失靈對于重金屬對腎細胞損傷甚至壞死的發生發展過程中扮演著重要的角色。具有兩個或兩個以上配位原子的多齒配體化合物和同一個金屬離子可以形成螯合反應，具有多齒配體的化合物為螯合劑，產物為金屬螯合物(或螯合物)。配體多具有氮、 氧、硫等強給電子基團，化合物的金屬鏊合作用可以用于重金屬解毒，例如乙二胺四乙酸可以與重金屬形成胺羧絡合物促進重金屬排出，半胱氨酸、二巰基丙醇和D-青霉胺等可以競爭性的和重金屬結合減小機體蛋白的解毒壓力，從而減小重金屬對機體的損害。TNF- α被認為是激活細胞因子級聯反應的初級因子，具有廣泛的生物效應，是重金屬腎組織損傷中重要的介質，TNF-α可進一步激活磷脂酶Α2，誘發IL_1、IL_8等多種細胞因子和炎癥介質的大量釋放，促進白細胞粘附、聚集在微血管床，導致腎小管內皮細胞和微循環的一系列炎癥改變，在腎組織局部可出現“無再灌流”現象，加重腎細胞的能量障礙， 使Na+-K+-ATP酶活性進一下降。此外TNF- α還可在分子水平使iNOSmRNA轉錄并翻譯為 iNOS，進一步產生高濃度的N0，通過NO與超氧陰離子的作用，破壞DNA結構及抑制細胞呼吸和DNA復制有關酶的活性而直接造成腎細胞毒性損傷。重金屬中毒后，腎組織TNF-α和NO 均升高，且二者呈顯著正相關關系，而與反映機體能量代謝的指標——Na+-K+-ATP酶活性呈顯著負相關關系，證明了炎癥介質和能量障礙相互交織參與重金屬中毒后腎損傷的發生。此外，重金屬導致腎細胞凋亡的主要原因是大量自由基產生造成氧化損傷。鎘引起的中毒性腎病動物模型是一種典型的中毒性腎病動物模型，該模型不但可以用于評價其它重金屬引起的中毒性腎病動物模型，而且可以用于評價其它有機或無機化學物質引起的中毒性腎病動物模型。杜仲為杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的樹皮，又名思仙(《本經》)， 木綿、思仲(《別錄》)，石思仙(《本草衍義補遺》)。味甘微辛，性溫入肝、腎經。具有補肝腎，強筋骨，安胎的功效。用于治療腰脊酸疼，足膝痿弱，小便余浙，陰下濕癢，胎漏欲墮，胎動不安，高血壓。鑒于杜仲良好的效果，藥物學家對其化學成分進行了廣泛的研究。目前從杜仲中分離的生物活性成分主要有三類，木質素類，環烯醚萜類和黃酮類等化學成分。現代藥理研究表明，杜仲的降壓作用與松脂醇二葡萄糖苷、生物堿、綠原酸、桃葉珊瑚苷和糖類有關。抗腫瘤作用與木質素、苯丙素和環烯醚萜有關。其水煎液和醇提液均有補腎、增強免疫作用。 杜仲藥材還有抗氧化、抗衰老、抗肌肉骨骼老化、抗菌、抗病毒的作用。現有技術尚未見有關于杜仲特別是其提取物，更特別地是其單體化學成分具有例如腎臟保護劑的作用。因此，對杜仲化學基礎進行進一步的研究，探尋具有生理活性的組成，這對于為臨床上相關疾病的治療提供新的途徑而言具有重要意義。

發明內容
本發明的目的是對杜仲化學基礎進行進一步的研究，探尋具有生理活性的組成， 為臨床上相關疾病的治療提供新的途徑。本發明人對杜仲進行系統的植物化學分離，令人意外地發現，中藥材杜仲，特別是其提取物，更特別地是從杜仲中提取的某些單體化學成分具有有效的腎臟保護劑的作用。本發明基于上述發現而得以完成。為此，本發明第一方面提供了杜仲在制備用于治療和/或預防中毒性腎病的藥物中的用途。根據本發明第一方面任一項的用途，其中所述的中毒性腎病選自急和/或慢性中毒性腎病、急和/或慢性腎功能衰竭、重金屬引起的中毒性腎病、化學物質引起的中毒性腎病、鎘引起的中毒性腎病、腎病綜合征及其并發癥。根據本發明第一方面任一項的用途，其中所述藥物給予哺乳動物，其給藥劑量為所述哺乳動物每天每kg體重服用量相當于杜仲藥材l_40g，優選2-20g，更優選5-10g。本發明第二方面提供了杜仲提取物在制備用于治療和/或預防中毒性腎病的藥物中的用途。根據本發明第二方面任一項的用途，其中所述的中毒性腎病選自急和/或慢性中毒性腎病、急和/或慢性腎功能衰竭、重金屬引起的中毒性腎病、化學物質引起的中毒性腎病、鎘引起的中毒性腎病、腎病綜合征及其并發癥。根據本發明第二方面任一項的用途，其中所述的杜仲提取物中包含至少一種選自以下的成分京尼平、京尼平苷。根據本發明第二方面任一項的用途，其中所述的杜仲提取物中包含京尼平和京尼平苷。在一個實施方案中，所述杜仲提取物中的京尼平與京尼平苷的重量比為0. 1 10 1，優選0.5 2 1，優選1 2 1。根據本發明第二方面任一項的用途，其中所述的藥物的劑量為所述哺乳動物每天每kg體重服用量相當于杜仲藥材l_40g，優選2-20g，更優選5-10g。根據本發明第二方面任一項的用途，其中所述的杜仲提取物是經如下步驟制備的將杜仲用含水乙醇溶液提取得提取物；或者進一步使所得醇提取物用乙酸乙酯或正丁醇萃取，將萃取物分別回收溶劑后得固形物，即為提取物；或者將杜仲用含水乙醇溶液提取得提取物后，回收溶劑所得提取濃縮液上大孔吸附樹脂，20-80 %乙醇洗脫，洗脫液濃縮干燥得提取物。根據本發明第二方面任一項的用途，其中所述的杜仲提取物是經如下步驟制備的a)將杜仲用2 20倍量(優選5 15倍量，更優選8 12倍量，例如10倍量) 的60 98% (優選70 98%，更優選80 98%，例如80%、85%、90%、95%或98%)乙醇浸泡1 M小時(優選1 18小時，更優選8 15小時)；b)回流提取0.5 10小時(優選0.5 8小時，更優選0.5 6小時，更優選
0.5 4小時，更優選1 4小時，例如1小時、2小時、3小時、4小時)，傾出提取液；c)任選地使步驟b)的藥渣重復進行步驟a)和步驟b) 1 3次(例如1次、2次、 3次)；d)合并步驟b)和步驟C)的提取液，過濾，濾液回收乙醇至在室溫下的密度約為
1.15-1. 20的濃縮液，即可作為本發明的杜仲提取物，其可進一步進行干燥。在一個實施方案中，以上步驟d)的杜仲提取物可進一步用乙酸乙酯或正丁醇萃取，將萃取物分別回收溶劑后得固形物，即為提取物。或者，在一個實施方案中，以上步驟d) 的杜仲提取物可以進一步上大孔吸附樹脂(例如D101)，用20-80%乙醇洗脫，將洗脫液濃縮干燥得提取物。上述方法所得的提取物的化學組成可通過本發明下文所述的純化步驟知曉，或者直接進行色譜分析測得該提取物中包含至少一種選自以下的成分京尼平、京尼平苷。優選的是包含京尼平、京尼平苷兩者。本發明第三方面提供了京尼平和/或京尼平苷在制備用于治療和/或預防中毒性腎病的藥物中的用途。根據本發明第三方面任一項的用途，其中所述的中毒性腎病選自急和/或慢性中毒性腎病、急和/或慢性腎功能衰竭、重金屬引起的中毒性腎病、化學物質引起的中毒性腎病、鎘引起的中毒性腎病、腎病綜合征及其并發癥。根據本發明第三方面任一項的用途，其中所述藥物給予哺乳動物，以所述哺乳動物每天每kg體重計，其中所述各成分單獨或任意組合時的劑量可以相互獨立地分別為
成分劑量(mg/kg體重/天)京尼平0. OOl-IOOmg(優選 I-IOmg)京尼平苷0. OOl-IOOmg(優選 I-IOmg)根據本發明第三方面任一項的用途，其中所述京尼平和/或京尼平苷各自獨立地是化學合成獲得的或者是植物提取獲得的。在一個實施方案中，所述京尼平和/或京尼平苷各自獨立地是植物提取獲得的。在一個實施方案中，所述京尼平和/或京尼平苷各自獨立地是植物提取獲得的，所述植物選自杜仲、桅子。在一個實施方案中，所述京尼平和/或京尼平苷各自獨立地是從杜仲提取獲得的，并且所述藥物的劑量為所述哺乳動物每天每kg 體重服用量相當于杜仲藥材l_40g，優選2-20g，更優選5-10g。根據本發明第三方面任一項的用途，其中從杜仲中提取京尼平和/或京尼平苷的步驟如下將杜仲用含水乙醇溶液提取；使所得醇提取物依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，將各萃取物分別回收溶劑后得各萃取溶劑部分的固形物；氯仿部分經過硅膠柱層析(石油醚-丙酮洗脫)后，33 36餾分經反復硅膠柱層析后分別得到白樺脂酸，43 56餾分以氯仿-丙酮進行硅膠柱層析，所得餾分經聚酰胺柱層析后分別得到漢黃芩素和千葉素A ；乙酸乙酯部分通過硅膠柱層析，采取氯仿甲醇溶劑系統梯度洗脫，所得49 55 餾分通過乙酸乙酯-甲醇、氯仿-甲醇溶劑系統反復硅膠柱層析后，得到粉末狀物質為京尼平(EUE-3)；正丁醇部分經過DlOl大孔吸附樹脂后，30%乙醇水溶劑洗脫部分過硅膠柱層析 (乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫)，18 20流分以氯仿甲醇H2O系統進行硅膠柱層析，所得 8 14流分中析出白色粉末為京尼平苷(EUB30-1)。本發明第四方面提供了一種用于治療和/或預防哺乳動物(特別是人)中毒性腎病的藥物組合物，其中包含治療和/或預防有效量的杜仲提取物以及任選的藥學可接受的賦形劑。根據本發明第四方面任一項的藥物組合物，其中所述的杜仲提取物中包含至少一種選自以下的成分京尼平、京尼平苷。在一個實施方案中，所述的杜仲提取物包含京尼平和京尼平苷，并且京尼平與京尼平苷的重量比為0.1 10 1，優選0.5 2 1，優選1 2 I0根據本發明第四方面任一項的藥物組合物，其中所述京尼平、京尼平苷的總量占所述提取物總重量的50-90% (w/w，即重量百分數，下同)，優選10 80% (w/w)，更優選 10 60% (w/w)。根據本發明第四方面任一項的藥物組合物，其中所述的藥物組合物給予所述哺乳動物的劑量為所述哺乳動物每天每kg體重服用量相當于杜仲藥材l_40g，優選2-20g，更優選 5-10g。根據本發明第四方面任一項的藥物組合物，其中所述的杜仲提取物是經如下步驟制備的將杜仲用含水乙醇溶液提取得提取物；或者進一步使所得醇提取物用乙酸乙酯或正丁醇萃取，將萃取物分別回收溶劑后得固形物，即為提取物；或者將杜仲用含水乙醇溶液提取得提取物后，回收溶劑所得提取濃縮液上大孔吸附樹脂，20-80%乙醇洗脫，洗脫液濃縮干燥得提取物。制備所述提取物的進一步優選的步驟參見本發明第二方面所提及的。本發明第五方面提供了一種用于治療和/或預防哺乳動物(特別是人)中毒性腎病的藥物組合物，其中包含治療和/或預防有效量的京尼平和/或京尼平苷，以及任選的藥學可接受的賦形劑。根據本發明第五方面任一項的藥物組合物，其中包含治療和/或預防有效量的京尼平和京尼平苷，以及任選的藥學可接受的賦形劑。本發明第六方面提供了一種在有需要的哺乳動物(特別是人)中治療和/或預防中毒性腎病的方法，所述方法包括給所述哺乳動物施用治療和/或預防有效量的杜仲，或者施用治療和/或預防有效量的杜仲提取物，或者施用治療和/或預防有效量的至少一種選自下列的成分京尼平、京尼平苷。根據本發明第六方面任一項的方法，其中所述的中毒性腎病選自急和/或慢性中毒性腎病、急和/或慢性腎功能衰竭、重金屬引起的中毒性腎病、化學物質引起的中毒性腎病、鎘引起的中毒性腎病、腎病綜合征及其并發癥。本發明任一方面或該任一方面的任一項或任一實施方案所具有的特征同樣適用于其它任一方面或該其它任一方面的任一項或任一實施方案，只要它們不會相互矛盾；當然在相互之間適用時，必要的話可對相應特征作適當修飾。在本發明中，例如，提及“本發明第一方面任一項”時，該“任一項”是指本發明第一方面的任一子方面或者任一實施方案；在其它方面以類似方式提及時，亦具有相同含義。發明詳述下面對本發明的各個方面和特點作進一步的描述。本發明所引述的所有文獻，它們的全部內容通過引用并入本文，并且如果這些文獻所表達的含義與本發明不一致時，以本發明的表述為準。此外，本發明使用的各種術語和短語具有本領域技術人員公知的一般含義，即便如此，本發明仍然希望在此對這些術語和短語作更詳盡的說明和解釋，提及的術語和短語如有與公知含義不一致的，以本發明所表述的含義為準。如本文所述的，術語“杜仲”符合2005年版《中華人民共和國藥典一部》“杜仲 (Cortex Eucommiae)，，項下的規定。本文中使用的術語“約”，例如在修飾制備產物的產率時，其通常是指本領域允許的誤差范圍，例如士 10%，例如士5%，例如士2%。本文中使用的短語“中毒性腎病”具有本領域技術人員公知的一類疾病或癥狀，并且通常包括但不限于急和/或慢性中毒性腎病、急和/或慢性腎功能衰竭、重金屬引起的中毒性腎病、化學物質引起的中毒性腎病、鎘引起的中毒性腎病、腎病綜合征及其并發癥， 等等，還包括這些病癥的。術語“并發癥”，例如在指中毒性腎病的并發癥時，是指隨各種原因所致中毒性腎病而同時產生的其它臨床病理和/或癥狀，例如疲乏、腰痛、水腫、蛋白尿、 血尿、尿量減少或增力卩、尿比重降低、尿鈉增多、血尿素氮、肌酐升高、輕度腎功能不全、重度腎功能衰竭、尿毒癥。術語“腎變病綜合征”(nephrotic syndrome,NS)簡稱腎綜，是指由多種病因引起的，以腎小球基膜通透性增加伴腎小球濾過率降低等腎小球病變為主的一組綜合征。腎病綜合征不是一獨立性疾病，而是腎小球疾病中的一組癥候群。腎病綜合征典型表現為大量蛋白尿、低白蛋白血癥、高度水腫、高脂血癥。本文中使用的術語“劑量”，例如在指杜仲提取物給予哺乳動物以治療和/或預防中毒性腎病的劑量，是指足以達到有效的治療和/或預防的劑量。在本發明的一個實施方案中，達到有效的治療和/或預防的劑量，不論給予的是杜仲，還是杜仲提取物，或者是京尼平和/或京尼平苷(這兩種化學單體不論是否是從植物杜仲提取獲得)，此劑量折算成杜仲藥材，相當于杜仲藥材l_40g/kg體重/天，優選2-20g/kg體重/天，更優選5-10g/kg體重/天。在本發明的一個實施方案中，達到有效的治療和/或預防的劑量，當以化學單體京尼平和/或京尼平苷(這兩種化學單體不論是否是從植物杜仲提取獲得)，此劑量對于京尼平和京尼平苷可以各自獨立地是0. OOl-lOOmg/kg體重/天，優選0. Ol-lOOmg/kg體重/天， 或者優選0. l-100mg/kg體重/天，或者優選0. 001-10mg/kg體重/天，或者優選0. 001-lmg/ kg體重/天，或者優選0. Ol-lOmg/kg體重/天，或者優選0. 1-lmg/kg體重/天，或者優選 l-10mg/kg體重/天。此外，臨床醫生會根據諸多因素來確定具體的使用劑量，這些因素例如年齡、性別、一般健康狀況、疾病的種類和嚴重程度等。無論如何，本領域技術人員根據本發明公開可以容易地確定具體情況下的使用劑量。本文中使用的術語“杜仲提取物”，是指由植物藥材杜仲經提取而得到的提取物，
9其中至少包含京尼平和京尼平苷中的一種化學成分，特別地，該杜仲提取物中包含京尼平和京尼平苷兩者。需要說明的是，該杜仲提取物中還可以包含杜仲中原本存在的其它物質， 例如但不限于白樺脂酸、桃葉珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷、丁香脂素單葡萄糖苷、漢黃芩素、千葉素A、黃芩素、二氫查耳酮3-0-β-D-葡萄糖苷、α-氧-β-D-葡萄吡喃糖基-4，2'，4'-三羥基二氫查耳酮。然而，在特別優選的實施方案中，本發明杜仲提取物中包含京尼平和京尼平苷，并且京尼平與京尼平苷的重量比為0.1 10 1，優選0.5 2 1，優選1 2 1。在本發明的一個實施方案中，本發明杜仲提取物中基本上不包含白樺脂酸。在本發明的一個實施方案中，本發明杜仲提取物中基本上不包含桃葉珊瑚苷。在本發明的一個實施方案中，本發明杜仲提取物中基本上不包含松脂醇二葡萄糖苷。在本發明的一個實施方案中，本發明杜仲提取物中基本上不包含丁香脂素二葡萄糖苷。在本發明的一個實施方案中，本發明杜仲提取物中基本上不包含松脂醇單葡萄糖苷。在本發明的一個實施方案中，本發明杜仲提取物中基本上不包含丁香脂素單葡萄糖苷。在本發明的一個實施方案中，本發明杜仲提取物中基本上不包含漢黃芩素。在本發明的一個實施方案中，本發明杜仲提取物中基本上不包含千葉素Α。在本發明的一個實施方案中，本發明杜仲提取物中基本上不包含黃芩素。在本發明的一個實施方案中， 本發明杜仲提取物中基本上不包含二氫查耳酮3-0-β-D-葡萄糖苷。在本發明的一個實施方案中，本發明杜仲提取物中基本上不包含α-氧-β-D-葡萄吡喃糖基_4，2' ,4'-三羥基二氫查耳酮。在本發明中，術語“基本上不包含”，例如在提及“在本發明的一個實施方案中，本發明杜仲提取物中基本上不包含白樺脂酸”時，是指白樺脂酸的重量占該杜仲提取物重量10%以下，特別是7. 5%以下，特別是5%以下，特別是2. 5%以下，特別是2%以下。在本發明的一個實施方案中，本發明杜仲提取物中任選含有下列成分的一種或多種白樺脂酸、桃葉珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷、丁香脂素單葡萄糖苷、漢黃芩素、千葉素Α、黃芩素、二氫查耳酮3-0-β-D-葡萄糖苷、 α-氧-β-D-葡萄吡喃糖基-4，2' ,4'-三羥基二氫查耳酮；并且在該杜仲提取物中，這些成分任一種比京尼平的重量百分比小于20%，優選小于15%，優選小于10%，優選小于 5%，優選小于2.5%。在本發明的一個實施方案中，本發明杜仲提取物中任選含有下列成分的一種或多種白樺脂酸、桃葉珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷、丁香脂素單葡萄糖苷、漢黃芩素、千葉素Α、黃芩素、二氫查耳酮3-0-β-D-葡萄糖苷、 α-氧-β-D-葡萄吡喃糖基_4，2' ,4'-三羥基二氫查耳酮；并且在該杜仲提取物中，這些成分任一種比京尼平苷的重量百分比小于20%，優選小于15%，優選小于10%，優選小于5%，優選小于2. 5%。本文中使用的術語“重金屬引起的中毒性腎病”是指由包括但不限于下列的一種或多種重金屬引起的中中毒性腎病汞、鉛、金、鎘、銀、錳、鉻、鎳、鉈、鋅、釩、銻、錫、銅、鉬、 鉍、鍺、鐵等。本文中使用的術語“化學物質”是指有機或無機的化學物質以及包含它們的組合物、配制品等。本文中使用的術語“化學物質引起的中毒性腎病”是指由包括但不限于下列的一種(類)或多種(類)化學物質引起的中毒性腎病洗滌劑、食品添加劑、化妝品、家用殺蟲劑、吸煙、酒精、麻醉劑、致幻劑、藥物、抗生素、解熱鎮痛藥、金屬制劑、造影劑、利尿劑、中草藥、關木通雷公藤等。本領域技術人員已知，測定杜仲藥材、杜仲提取物中的京尼平和/或京尼平苷含量，以及測定京尼平產品或京尼平苷產品中主成份的純度，這些測定方法是容易獲得的，例如可以參考文獻(例如參見曹晶萍等，反相高效液相色譜法測定桅子中京尼平甙和京尼平的含量，大連醫科大學學報，2001(1) :24;特別是例如參考該論文中的液相色譜條件)中的方法或者作些調整。上述方法所得的提取物的化學組成可通過本發明下文所述的純化步驟知曉，或者直接進行色譜分析測得該提取物中包含至少一種選自以下的成分京尼平、京尼平苷。優選的是包含京尼平、京尼平苷兩者。盡管本發明對所涉及的活性成分作了詳細描述，本發明人仍然愿意在此強調，這些活性成分(其包括，但不限于，京尼平(genipin)、京尼平苷(geniposide))具有本領域技術人員已知的化學結構、物理化學性質。如本文所述的，術語“有效量”是指可在受試者中實現治療、預防、減輕和/或緩解本發明所述疾病或病癥的劑量。如本文所述的，術語“藥物組合物”，是指可用于在受試者中實現治療、預防、減輕和/或緩解本發明所述疾病、病癥、癥狀的物質。如本文所述的，術語“受試者”可以指患者或者其它接受本發明組合物和提取物以治療、預防、減輕和/或緩解本發明所述疾病、病癥、癥狀的動物，特別是哺乳動物，例如人、 狗、猴、牛、馬等。如本文所述的，術語“疾病或癥狀”是指所述受試者的一種身體狀態，該身體狀態與本發明所述疾病或癥狀有關。如本文所述的，“ % ”，如未特別指明，對于總物料是固體時一般是指重量/重量的百分比，對于總物料是液體時一般是指重量/體積的百分比。當然，對于總物料是液體并且溶質是液體時，表征該液態溶質的百分比一般是指體積/體積的百分比。本發明藥物組合物中使用的“藥學可接受的賦形劑”可以是藥物制劑領域中任何常規的賦形劑。特定賦形劑的選擇將取決于用于治療特定患者的給藥方式或疾病類型和狀態。用于特定給藥模式的合適藥物組合物的制備方法完全在藥物領域技術人員的知識范圍內。例如，可以作為藥學可接受的賦形劑包括藥學領域常規的稀釋劑、載體、填充劑、粘合齊U、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體和潤滑劑等。必要時，還可以在藥物組合物中加入香味劑、防腐劑和甜味劑等。本發明的藥物組合物可以制成片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊、口服液、膏劑、霜劑、注射乳劑(注射用無菌粉針)等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學領域的常規方法制備。本發明人發現，含有京尼平和/或京尼平苷的杜仲提取物有顯著的緩解鎘誘導的中毒性腎損傷的作用，杜仲提取物給藥組大鼠血漿中血清尿素氮(BUN)、肌苷(CRE)指標明顯降低，且呈劑量關系。


圖1描繪了杜仲提取物對鎘誘導的大鼠血漿中肌苷的影響，縱坐標表示肌苷濃度(mg/dl)。圖中，N 空白組；Cd 鎘模型組；VE 維生素E(500mg/kg) +鎘處理組；L :125mg/kg 杜仲提取物+鎘處理組；M :250mg/kg杜仲提取物+鎘處理組；H :500mg/kg杜仲提取物+鎘處理組。各棒表示均值士SD。*，P <0.05 ;m，P< 0.01(與鎘模型組比較)。以下各圖均具有類似含義。圖2描繪了杜仲提取物對鎘誘導的大鼠血漿中血清尿素氮量的影響，縱坐標表示尿素氮量濃度(mmol/1)。圖3描繪了杜仲提取物對鎘誘導的大鼠腎組織谷胱甘肽的影響，縱坐標表示腎組織中的蛋白(protein)濃度(mg/g)。圖4描繪了杜仲提取物對鎘誘導的大鼠腎組織過氧化氫酶的影響，圖中縱坐標為腎過氧化氫酶活性，其以每mg蛋白質(protein)每分鐘內消耗的(consumed) H2O2量 (μ mol)計。圖5描繪了杜仲提取物對鎘誘導的大鼠腎組織中Na+-K+-ATP酶的影響。
具體實施例方式通過下面的實施例可以對本發明進行進一步的描述，然而，本發明的范圍并不限于下述實施例。本領域的專業人員能夠理解，在不背離本發明的精神和范圍的前提下，可以對本發明進行各種變化和修飾。本發明對試驗中所使用到的材料以及試驗方法進行一般性和/或具體的描述。雖然為實現本發明目的所使用的許多材料和操作方法是本領域公知的，但是本發明仍然在此作盡可能詳細描述。實施例1 杜仲提取物的制備和含量測定杜仲藥材500g，加入5000ml 70%乙醇回流提取兩次，每次2小時，合并提取液過
濾后濃縮至盡，真空干燥得杜仲提取物。經檢測，該提取物中京尼平和京尼平苷的量分別為0. 214%,0. 488%。另外經檢測，發現該提取物中下列物質的量為京尼平苷酸0.925%，綠原酸 0. 302 %，松脂醇二葡萄糖苷0. 99 %，丁香質素二葡萄糖苷0. 34 %。^MM 2 從ti仲泡丨備iM平禾PiM平苷化合4勿并對 表征將31. 5千克杜仲藥材(購自河南信陽藥材公司)剪成小塊，加入315升95%乙醇浸泡過夜，回流提取2小時，傾出提取液，藥渣再加入315升95%乙醇回流提取2小時，提取液合并后過濾，續濾液回收乙醇，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，分別回收溶劑后得固形物。結果石油醚部分固形物153g，氯仿部分固形物384g，乙酸乙酯部分固形物 126g,正丁醇部分固形物520g。杜仲乙酸乙酯萃取部分，通過硅膠柱層析，采取氯仿甲醇溶劑系統梯度洗脫， 19 27餾分再利用硅膠柱層析，通過石油醚-乙酸乙酯溶劑系統梯度洗脫，得到粉末狀物質，經鑒定為京尼平。杜仲正丁醇部分500g過DlOl大孔吸附樹脂后，30 %部分130g進行硅膠柱色譜分離，KOAc CH30H溶劑系統梯度洗脫，18 20流分以CHC13 CH30H H20系統進行硅膠柱層析，所得8 14流分中有白色粉末析出，標記為EUB30-1，跟文獻值比對后，確定 EUB30-1為京尼平苷。京尼平，白色粉末。1H-WR(CD3ODjOOMHz) δ 4. 18 (1Η, d, J = 8. OHz, H-1)，7. 53 (1H, s, H-3)，3. 14 (1H, m, H-5)，2. 83 (1H, m, H-6)，2. 03 (1H, m, H-6)，5. 83 (1H, s, H-7)， 2. 47 (1H, t, J = 8. 5Hz, Η_9)，4· 25 (2Η, dd, J = 14. 5Hz, Η-10)，3· 71 (3H, s, -0CH3)。京尼平苷，白色針狀結晶(甲醇)，mp為159 160°C，Molish反應顯陽性，酸水解后糖部分經薄層色譜檢識證明僅含有D-葡萄糖。IH-NMR(OT3OD) :7.51(1H，s, H-3), 5. 79(lH,br. s，H_7)，5. 16(lH，d，J = 7. 8Hz，H_l)，4. 70(lH，d，J = 8. 0Hz，H_l' )，4. 19 (2H, q, H-10)，3. 70 (3H, s, H-12)，2. 70 (2H, t, J = 16. OHz, H-6)，2. 10 (1H, q, H-5)。13C-NMR (CD3OD) :98. 2 (C-I), 153. 4 (C_3) ,112. 5 (C_4)，39. 7 (C_5)，36. 6 (C_6)， 128. 3 (C-7) , 144. 8 (C_8) , 47. 0 (C_9) , 6 1. 4 (C-l0) , 169. 5 (C-l 1) , 51. 7 (C-12), 100. 3 (C-I' ) ,74. 8(C-2' )，78.4(C_3' )，71.5(C_4' )，77.8(C_5' )，62.6(C_6')。以上理化數據及波譜數據與文獻一致，鑒定化合物為京尼平苷。實施例3 杜仲提取物拮抗重金屬誘導的中毒件腎病研究在本文中，如未另外特別說明，進行生物學試驗所使用的杜仲提取物是實施例1 獲得的提取物。大鼠48只，EXCEL隨機分成6組，分別為空白組(N)，鎘模型組(Cd)，陽性藥組 (VE)，杜仲提取物低劑量組(L)，杜仲提取物中劑量組(M)，杜仲提取物高劑量組(H)。稱取2. 5g維生素E (犯)置25ml錐形瓶中，25ml 5%阿拉伯膠水溶液溶解，維生素 E 濃度 100mg/ml。高濃度杜仲提取物樣品(100. Omg/ml)稱取杜仲提取物20. Og充分溶解于200ml 5 %阿拉伯膠水溶液中，得高濃度杜仲提取物樣品，濃度100mg/ml。中濃度杜仲提取物樣品(50mg/ml)精密量取高濃度杜仲提取物樣品(IOOmg/ ml) 50ml，5%阿拉伯膠水溶液稀釋1倍，得中濃度杜仲提取物樣品，濃度50mg/ml。低濃度杜仲提取物樣品(25mg/ml)精密量取中濃度杜仲提取物樣品(50mg/ ml) 50ml，5%阿拉伯膠水溶液稀釋1倍，得低濃度杜仲提取物樣品，濃度25mg/ml。CdCl2溶液的配置精密稱取CdCl2 ·5/2Η20固體25mg置于IOml容量瓶中，生理鹽水溶解并定容到刻度，得CdCl2溶液樣品，濃度2. 5mg/ml。模型組大鼠灌胃5%阿拉伯膠水溶液lml/100g(即每IOOg大鼠體重灌胃Iml試藥，下同)，陽性對照組大鼠灌胃維生素E溶液lml/100g，低劑量組大鼠灌胃低劑量杜仲提取物溶液lml/100g，中劑量組大鼠灌胃中濃度杜仲提取物溶液lml/100g，高劑量組大鼠灌胃高濃度杜仲提取物溶液lml/100g。分別灌胃給藥5天。第五天時給藥后lh，腹腔注射CdCl2溶液lml/kg大鼠，造模型。造模后2h，取血1ml，離心后取上清液得血漿樣品待檢；造模后4h，處死動物，取右腎組織置固定液中，左腎組織稱重后生理鹽水制成 10%的勻漿液，4000轉/分鐘離心lOmin，取上清液得腎組織勻漿液樣品待檢。血漿樣品檢測肌苷(CRE)、血清尿素氮(BUN)指標；腎組織勻漿液檢測谷胱胺肽(GSH)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、 丙二醛(MDA)和Na-K-ATP酶(Na-K-ATP)指標。結果見圖1至圖5。由結果可以看出，染隔后模型組實體腎損傷明顯，CRE和BUN升高，而給與抗氧化劑維生素E和杜仲提取物可以明顯減低CRE和BUN的升高，顯現對大鼠實體腎損傷的保護作用。腎組織中GSH、CAT和Na+-K+-ATP酶的檢測結果也支持了杜仲提取物對鎘誘導的急性腎損傷的保護作用。棚列4擺Φ雜成/誠尼啊晾尼平■射嫌使用實施例2獲得的京尼平和京尼平苷進行試驗。按實施例3所述方法，大鼠40只，分成5組。分別時空白組、模型組、陽性藥組、京尼平組、京尼平苷組。稱取2. 5g維生素E (犯)置25ml錐形瓶中，25ml 5%阿拉伯膠水溶液溶解，維生素 E濃度100mg/ml。稱取Ig京尼平、Ig京尼平苷分別置25ml錐形瓶中，25ml 5%阿拉伯膠水溶液溶解，京尼平和京尼平苷的濃度分別為40mg/ml。CdCl2溶液的配置精密稱取CdCl2*5/2H20固體25mg置于IOml容量瓶中，生理鹽水溶解并定容到刻度，得CdCl2溶液樣品，濃度2. 5mg/ml。模型組大鼠灌胃5%阿拉伯膠水溶液lml/100g(即每IOOg大鼠體重灌胃Iml試藥，下同)，陽性對照組大鼠灌胃維生素E溶液lml/100g，京尼平組大鼠灌胃京尼平溶液 lml/100g，京尼平苷組大鼠灌胃京尼平苷溶液lml/100g。分別灌胃給藥5天。第五天時給藥后lh，腹腔注射CdCl2溶液lml/kg大鼠，造模型。造模后2h，取血1ml，離心后取上清液得血漿樣品待檢；造模后4h，處死動物，取右腎組織置固定液中，左腎組織稱重后生理鹽水制成 10%的勻漿液，4000轉/分鐘離心lOmin，取上清液得腎組織勻漿液樣品待檢。血漿樣品檢測肌苷(CRE)、血清尿素氮(BUN)指標；結果如下
CRE(mg/dl)BUN(mmol/1)空白組0. 66±0. 06 *5. 38±0. 20*模型組0. 88 ±0. 096. 30±0. 25陽性組0. 79±0. 02 *5. 85±0. 43京尼平組0. 66±0. 02 *4. 72±0. 15*京尼平苷組0. 69±0. 03 *5. 57±0. 17其中*表示和模型組對比P < 0. 05，有顯著性差異。腎組織勻漿液檢測谷胱胺肽(GSH)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、 丙二醛(MDA)和 Na-K-ATP 酶(Na-K-ATP)指標。
權利要求
1.杜仲在制備用于治療和/或預防中毒性腎病的藥物中的用途。
2.根據權利要求1的用途，其中所述的中毒性腎病選自急和/或慢性中毒性腎病、急和/或慢性腎功能衰竭、重金屬引起的中毒性腎病、化學物質引起的中毒性腎病、鎘引起的中毒性腎病、腎病綜合征及其并發癥。
3.杜仲提取物在制備用于治療和/或預防中毒性腎病的藥物中的用途。
4.根據權利要求3的用途，其中所述的中毒性腎病選自急和/或慢性中毒性腎病、急和/或慢性腎功能衰竭、重金屬引起的中毒性腎病、化學物質引起的中毒性腎病、鎘引起的中毒性腎病、腎病綜合征及其并發癥。
5.根據權利要求3至4任一項的用途，其中所述的杜仲提取物中包含至少一種選自以下的成分京尼平、京尼平苷。
6.根據權利要求3至5任一項的用途，其中所述的杜仲提取物中包含京尼平和京尼平苷。在一個實施方案中，所述杜仲提取物中的京尼平與京尼平苷的重量比為0.1 10 1， 優選0. 5 2 1，優選1 2 1。
7.京尼平和/或京尼平苷在制備用于治療和/或預防中毒性腎病的藥物中的用途。
8.根據權利要求7的用途，其中所述的中毒性腎病選自急和/或慢性中毒性腎病、急和/或慢性腎功能衰竭、重金屬引起的中毒性腎病、化學物質引起的中毒性腎病、鎘引起的中毒性腎病、腎病綜合征及其并發癥。
9.用于治療和/或預防哺乳動物(特別是人)中毒性腎病的藥物組合物，其中包含治療和/或預防有效量的杜仲提取物以及任選的藥學可接受的賦形劑。在一個實施方案中， 所述的杜仲提取物中包含至少一種選自以下的成分京尼平、京尼平苷。在一個實施方案中，所述的杜仲提取物包含京尼平和京尼平苷，并且京尼平與京尼平苷的重量比為0. 1 10 1，優選0.5 2 1，優選1 2 1。
10.用于治療和/或預防哺乳動物(特別是人)中毒性腎病的藥物組合物，其中包含治療和/或預防有效量的京尼平和/或京尼平苷，以及任選的藥學可接受的賦形劑。
全文摘要
本發明涉及杜仲化學成分作為腎臟保護劑的新用途。具體地說，本發明涉及杜仲或杜仲提取物在制備用于治療和/或預防中毒性腎病的藥物中的用途。本發明還涉及京尼平和/或京尼平苷在制備用于治療和/或預防中毒性腎病的藥物中的用途。本發明發現杜仲提取物及其中的一些化學成分可以用作有效的腎臟保護劑，用于治療和/或預防腎臟疾病。
文檔編號A61K31/7048GK102198166SQ20111013393
公開日2011年9月28日 申請日期2011年5月23日 優先權日2011年5月23日
發明者劉二偉, 樊官偉, 王濤, 胡利民, 韓立峰, 高秀梅 申請人:天津中醫藥大學