專利名稱：一種抗腫瘤活性物質(zhì)及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗腫瘤活性物質(zhì)及其制備方法和應(yīng)用，屬微生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腫瘤(癌癥)在全球范圍內(nèi)是僅次于心血管疾病的第二大“殺手”。據(jù)美國癌癥研究院(NCI)2003年的統(tǒng)計(jì)資料，美國男子約有一半、女子約有三分之一將在他(她)們的生命過程中患上癌癥；全美每年新診斷腫瘤病例超過100萬人，每年死于這類疾病的人數(shù)超過50萬。我國的腫瘤發(fā)病率同樣十分驚人，每年新增腫瘤病人200萬人，死亡130多萬人，目前全國癌癥病人總數(shù)估計(jì)在500萬以上。隨著全球老齡化社會的到來和腫瘤發(fā)病率的不斷提高，抗腫瘤藥物市場也在不斷地增長。據(jù)中國東方健康市場研究中心2001年的《中國抗腫瘤藥物市場研究報(bào)告》，1999年中國抗腫瘤藥物市場增長了17％，達(dá)6.03億美元，估計(jì)到2006年此類藥品的銷售額可達(dá)17億美元。
隨著腫瘤發(fā)病率的日趨升高，人們對抗腫瘤藥物的研究也在不斷加強(qiáng)和深入。目前所用的抗腫瘤藥物中，多數(shù)對人體副作用較大，特異性不強(qiáng)，迫切需要開發(fā)活性高、特異性強(qiáng)的新型抗腫瘤藥物造福于人類。
三七是中國的傳統(tǒng)名貴藥材，利用微生物轉(zhuǎn)化的方法，對三七進(jìn)行二次開發(fā)，產(chǎn)生新的具有抗腫瘤活性的發(fā)酵物，是進(jìn)一步利用中草藥，實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化的有利手段。
國內(nèi)外文獻(xiàn)檢索表明，未見有關(guān)利用微生物轉(zhuǎn)化三七產(chǎn)生抗腫瘤活性物質(zhì)的公開文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用紅色紅曲霉發(fā)酵三七及其在抗腫瘤活性方面的應(yīng)用。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的生產(chǎn)菌株是紅色紅曲霉(Monascus ruber)3081，該菌株已于2005年2月28日保存于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏號CGMCCNo.1319。
紅色紅曲霉屬子囊菌亞門(Ascomycotina)，不整囊菌綱(Plectomyhcetes)，散囊菌目(Eurotiales)，紅曲科(Monascaceae)，紅曲霉屬(Monascus)。3081菌株在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，菌絲初為白色，老熟后變?yōu)轸骷t色。菌落的結(jié)構(gòu)呈絨氈狀。能形成紅色色素，故使培養(yǎng)物的背面著色。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的將三七用Monascus ruber 3081菌株通過固體培養(yǎng)，提取有抗腫瘤活性的代謝產(chǎn)物，制備成抗腫瘤的制劑。
實(shí)驗(yàn)表明三七紅色紅曲霉發(fā)酵物對人白血病細(xì)胞株K562和人肺癌細(xì)胞株A549顯示了明顯的抑制活性；對致癌基因Raf1和c-Myc的潛在靶點(diǎn)酪氨酸磷酸酯酶cdc25a和cdc25b具有顯著的抑制作用。
本發(fā)明將以三七為底物的Monascus ruber 3081發(fā)酵物作為制備抗腫瘤制劑的應(yīng)用。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，利用了微生物自身獨(dú)特的代謝體系以三七為底物生產(chǎn)具有抗腫瘤活性的代謝物質(zhì)，并通過人工培養(yǎng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)控制。
具體實(shí)施例方式一、本發(fā)明化合物的發(fā)酵生產(chǎn)方法實(shí)施例11、將紅色紅曲霉(Monascus ruber)3081接種到試管固體培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為麥芽汁培養(yǎng)基，20℃下培養(yǎng)8天，獲得試管種；2、將試管種接種到250ml三角瓶中(每瓶裝50ml)固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為三七須根粉末20％，水80％，自然pH，培養(yǎng)溫度30℃，最適25-28℃，靜置培養(yǎng)20天，直到菌絲長滿。
3、將固體培養(yǎng)物冷凍干燥。用90％的乙醇室溫浸提2天，減壓濃縮，蒸干溶劑后即得活性物質(zhì)。
實(shí)施例2基本同實(shí)施例1。不同之處為試管固體培養(yǎng)的溫度28℃、時(shí)間為下培養(yǎng)6天；固體培養(yǎng)基配方為三七須根粉末25％，水75％，培養(yǎng)溫度25℃，靜置培養(yǎng)18天；用95％的乙醇室溫浸提。
實(shí)施例3基本同實(shí)施例1。不同之處為試管固體培養(yǎng)的溫度30℃、時(shí)間為下培養(yǎng)4天；固體培養(yǎng)基配方為三七須根粉末30％，水70％，培養(yǎng)溫度20℃，靜置培養(yǎng)15天；用92％的乙醇室溫浸提。
二、本發(fā)明化合物抗腫瘤活性的藥效試驗(yàn)1、對人腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用將對數(shù)生長期細(xì)胞調(diào)整為適當(dāng)濃度后加入96孔培養(yǎng)板，90ul/孔。受試濃度為100ug/ml，設(shè)3個(gè)平行孔，10ul/孔。陰性對照為等體積培養(yǎng)液，陽性對照為抗癌藥物順鉑(DDP)。同時(shí)設(shè)相應(yīng)濃度的DMSO溶媒對照和有色樣品顯色濃度的平行對照，以消除有色樣品顏色的干擾。貼壁生長的細(xì)胞(A549)接種后培養(yǎng)24小時(shí)待其貼壁后加藥，懸浮生長細(xì)胞(K562)接種后即加藥，加藥后細(xì)胞置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)一定時(shí)間(A549培養(yǎng)72小時(shí)，K562培養(yǎng)48小時(shí))后加入MTT(5mg/ml)，20ul/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后加入三聯(lián)液(10％SDS-5％異丁醇-0.012mol/L HCl，W-V-V)，100ul/孔，放置過夜后，用酶標(biāo)儀在570nm，630nm雙波長下測定各孔的OD值。
2、對致癌基因Raf1和c-Myc的潛在靶點(diǎn)酪氨酸磷酸酯酶cdc25a和cdc25b的抑制作用將20ml酪氨酸磷酸酯酶cdc25a或cdc25b加入含有20mlDDT(100mM)的Tris緩沖液中(50mM Tris，pH8，50mM NaCl，1mM EDTA，1mM DTT)，再加入140mlTris緩沖液。平板預(yù)先在37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)保持15分鐘，然后加入20mL500mM的發(fā)酵物，37℃反應(yīng)30分鐘后，在405nm波長下測定OD值。
實(shí)施1發(fā)酵物對人腫瘤細(xì)胞的生長抑制將0.5mg三七發(fā)酵物溶于少量二甲亞砜，用無菌蒸餾水稀釋為100ug/ml溶液，二甲亞砜的終濃度不超過2％。
按上述試驗(yàn)方法1進(jìn)行藥效試驗(yàn)。
表1三七發(fā)酵物對人腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用K562％ A549％DMSO control 1.98 0DDP control 0.1ug/ml32.000.871.0ug/ml41.4134.1710ug/ml 100.00 100.00Extract fermented by M.rubber 308178.5722.71結(jié)果表明，三七紅色紅曲霉發(fā)酵物對人白血病細(xì)胞株K562的抑制率達(dá)到78.57％，對人肺癌細(xì)胞株A549的抑制率達(dá)到22.71％，顯示了明顯的抑制活性。
實(shí)施2發(fā)酵物對酪氨酸磷酸酯酶cdc25a和cdc25b的抑制將0.5mg三七發(fā)酵物溶于少量二甲亞砜，配制為50ug/ml的水溶液，待測溶液中二甲亞砜的終濃度不超過2％。
按上述試驗(yàn)方法2進(jìn)行藥效試驗(yàn)。
表2 三七發(fā)酵物對酪氨酸磷酸酯酶cdc25a和cdc25b的抑制作用編號 cdc25a抑制率％ cdc25b抑制率％DMSO Control 2.012.972.22 2.54XXX Control 93.10 98.30 95.1191.88Extract fermented by M.rubber 308179.70 79.40 64.5462.01結(jié)果表明，三七紅色紅曲霉發(fā)酵物對致癌基因Raf1和c-Myc的潛在靶點(diǎn)酪氨酸磷酸酯酶cdc25a的抑制率為79.55％，對cdc25b的抑制率為63.28％，具有顯著的抑制作用。
實(shí)施3發(fā)酵物對人腫瘤細(xì)胞的生長抑制活性的增強(qiáng)實(shí)施例3方法同實(shí)施例1，不同之處為分別將0.5mg三七發(fā)酵物，0.5mg三七乙醇提取物，和0.5mg紅色紅曲霉自然發(fā)酵物各溶于少量二甲亞砜，用無菌蒸餾水稀釋為100ug/ml溶液，二甲亞砜的終濃度不超過2％。
表3三七發(fā)酵物對人腫瘤細(xì)胞的生長抑制活性的增強(qiáng)K562A549DMSO control1.980DDP control 0.1ug/ml 32.00 0.871.0ug/ml 41.41 34.1710ug/ml100.00 100.00P.notoginseng control 69.46 1.16M.rubber 3081 control 2.9010.26Extract fermented by M.rubber 3081 78.57 22.71結(jié)果表明，三七經(jīng)紅色紅曲霉發(fā)酵之后，可以提高對人腫瘤細(xì)胞的生長抑制活性，提高率為13.11％。
權(quán)利要求
1.一種抗腫瘤活性物質(zhì)，由生產(chǎn)菌株經(jīng)試管培養(yǎng)、固體培養(yǎng)及冷凍干燥工序后制成，其特征在于生產(chǎn)菌株為紅色紅曲霉(Monascus ruber)3081，該菌株已于2005年2月28日保存于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No.1319。
2.權(quán)利要求1所述活性物質(zhì)的制備方法，包括試管培養(yǎng)、固體培養(yǎng)及冷凍干燥工序，其特征在于2.1試管培養(yǎng)為將紅色紅曲霉(Monascus ruber)3081接種到試管固體培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為麥芽汁培養(yǎng)基，在20-30℃下培養(yǎng)4-8天，獲得試管種；2.2固體培養(yǎng)基組成為三七須根粉末20％-30％，水70％-80％，自然pH。2.3固體培養(yǎng)中溫度20-30℃，靜置培養(yǎng)15-20天，直到菌絲長滿；2.4冷凍干燥工序?yàn)橛?0～95％的乙醇在室溫浸提2天，減壓濃縮后蒸干溶劑后即得活性物質(zhì)。
3.權(quán)利要求1所述的抗腫瘤活性物質(zhì)，其特征在于該活性物質(zhì)對人腫瘤細(xì)胞的生長、對酪氨酸磷酸酯酶cdc25a和cdc25b具有抑制作用，可以用以制備抗腫瘤制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗腫瘤活性物質(zhì)及其制備方法和應(yīng)用，屬微生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。該活性物質(zhì)采用常規(guī)方法制備，其中生產(chǎn)菌株為紅色紅曲霉(Monascus ruber)3081，保藏號CGMCC No.1319。試管種采用常規(guī)的麥芽汁培養(yǎng)基，于20－30℃下培養(yǎng)4－8天。固體發(fā)酵培養(yǎng)基為三七須根粉末20％－30％，水70％－80％，自然pH。固體培養(yǎng)溫度20－30℃，靜置培養(yǎng)15－20天后，用90～95％的乙醇在室溫浸提2天，減壓濃縮后蒸干溶劑后即得活性物質(zhì)。本發(fā)明得到的活性物質(zhì)對人白血病細(xì)胞株K562的抑制率達(dá)到78.57％，對人肺癌細(xì)胞株A549的抑制率達(dá)到22.71％；對致癌基因Raf1和c－Myc的潛在靶點(diǎn)酪氨酸磷酸酯酶cdc25a的抑制率為79.55％，對cdc25b的抑制率為63.28％，該活性物質(zhì)具有顯著的抑制作用，可作為制備抗腫瘤制劑的應(yīng)用。
文檔編號A61P35/00GK1682771SQ200510010690
公開日2005年10月19日 申請日期2005年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月16日
發(fā)明者劉亞君, 張克勤 申請人:云南大學(xué)