專利名稱：Flt3受體的配體的制作方法
技術領域：
本發明涉及哺乳動物的flt3-配體、編碼此類配體的核酸、生產重組flt3-配體的過程、含此類配體的藥品以及它們在各種不同的療法中的應用等。
背景技術：
血細胞起源于造血干細胞，造血干細胞沿著確定的系譜即紅血球、巨核細胞、粒性白細胞、單核白細胞和淋巴細胞進行分化。促進細胞前體增殖和成熟的細胞素被稱為“集落刺激因子”(CSFs)。T-淋巴細胞可以產生幾類CSFs，包括白細胞介素3(IL-3)、粒性白細胞-單核白細胞CSF(GM-CSF)、粒性白細胞CSF(G-CSF)和單核白細胞CSF(M-CSF)。這些CSFs既能夠影響成熟細胞又能影響干細胞，但迄今尚未發現能夠主要對干細胞產生影響的因子。
酪氨酸激酶受體(TKRs)是調節很多細胞增殖和分化的生長因子受體(Yarden，Y.和Ollrich，A.Annu.Rev.Biochem.，57，443—448，1988；以及Cadena DL和Gill GN，FASEB J.，6，2332—2337，1992)。在造血系統中某些TKRs在發揮功能。例如，通過集落刺激因子1型(CSF-1)發出信號，受體c-fms調節單核白細胞的存活、生長和分化(Stanley等，J.Cell Biochem.，21，151—159，1983)。“鋼因子”(SF，也被認為是肥大細胞生長因子，干細胞因子或成套配體)，通過c-kit來進行作用，促進髓樣區和淋巴樣區細胞的增殖。
flt3(Ronsnet等，Oncogene，6，1641—1650，1991)和flk-2(Matthews等，Cell，65，1143—1152，1991)是與c-fms和c-kit的受體有關的TKR的不同形式，flk-2的基因產物被表達于造血細胞和祖代細胞，而flt3的基因產物分布于更加廣泛的組織中。flt3和flk-2的受體蛋白在氨基酸順序上相類似，但在細胞外區域中二者在兩個氨基酸殘基上具有差異，并且在近C-末端的一個具有31個氨基酸的片段上二者具有趨異性(Lyman等，Oncogere，8，815—822，1993)。
flt3-配體(flt3-L)還被發現可以調節祖代細胞和干細胞的生長和分化，似乎在治療造血功能紊亂上具有臨床應用的價值，尤其是治療再生障礙性貧血和髓組織再生障礙性綜合癥。此外，對于受到細胞減少以及細胞擴展療法的病人在進行同源的、異源的或自身骨髓移植時，flt3-L是有用的。同樣，flt3-L在進行基因治療以及祖代細胞和干細胞的動員系統中也上有用的。
癌癥通常是采用電離輻射和化學毒素來殺死迅速分裂的細胞的細胞減少療法來治療的。由于對正常細胞的細胞毒性作用而帶來了典型的副作用限制了細胞減少療法的應用。常見的副作用是骨髓抑制，或者損害了產生紅細胞、白細胞和血小板的骨髓細胞。而骨髓抑制的結果，將使病人產生血細胞減少癥，或血細胞缺乏，這些將增加感染和出血紊亂的危險。
血細胞減少癥會增加發病率及死亡率，并導致在癌癥治療中的低劑量服藥。許多臨床調查者已經使用按照計劃來服藥的細胞減少療法來增加癌癥治療的服藥量，同時又可以限制其對骨髓的損害。一種辦法是進行骨髓或外緣的血細胞移植，其中骨髓或循環造血的祖代細胞或干細胞在進行細胞減少療法之前被移去，然后在治療之后被重新注入以恢復其造血機能。美國專利5,199,942號及其文獻描述了一種方法，在自體的移植治療方案中使用了GM-CSF，IL-3，SF，GM-CSF/IL-3融合蛋白，促紅細胞生成素(“FPO”)及其組合。
高劑量服藥的化學治療在治療上是有益的，因為與標準劑量治療法相比較，它可以提高患轉移癌癥尤其是乳腺癌病人的目標應答頻率。它可導致一些甚至預后不良病人的長期無病緩解。然而，高劑量服藥的化學治療具有毒性，很多會導致與感染、出血紊亂、其它與長期骨髓再生障礙相聯系的影響等有關的臨床并了癥。
骨髓再生障礙性綜合癥是干細胞發生紊亂，其特征為細胞成熟受損，進行性的各類血細胞減少癥和成熟細胞的功能失常。其特征還表現為不同程度的血細胞減少癥，無效的紅細胞生成和伴有正常或數量增加以及具有特殊形態的骨髓細胞的骨髓細胞生成。Bennett等(Br.J.Haematol.1982，51，189—199)將這些紊亂癥狀劃分成5種亞型頑固性貧血，具有環狀成高鐵紅細胞的頑固性貧血，具有過量未成熟細胞的頑固性貧血，具有過量轉型未成熟細胞的頑固性貧血和慢性骨髓單核細胞白血病。雖然這些病人中的大部分會發展成急性白血病，絕大多數死亡是緣于感染或出血的并發癥。使用視黃酸、維他命D和阿糖胞苷治療這些綜合癥并不成功。具有這些綜合癥的大多數病人年齡較大且不適于進行骨髓移植或具有損害的抗白血病的化學療法。
再生障礙性貧血上另一種疾病，其特征表現為骨髓受損和嚴重的血細胞減少癥。與骨髓的再生障礙性綜合癥不同，在這類疾病中骨髓是無細胞或細胞減少的。如今的治療包括從一組織相容性供體進行骨髓移植或用抗胸腺細胞球蛋白(ATG)進行免疫抑制處理。與骨髓再生障礙性綜合癥相類似，具有這些綜合癥的大多數病人年齡較大且不適于進行骨髓移植或具有損害的抗白血病的化學治療。由于感染或出血的并發癥，這類病人的死亡率特別高。
在具有獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)的病人中貧血是很常見的。在接受Zidovudine治療的病人中貧血通常更嚴重。很多重要的還原病毒藥物，抗感染藥和抗腫瘤藥抑制紅細胞生成。重組EPO已顯示能夠使病人的血細胞比容和血紅蛋白水平變正常，但無論如何，通常需要高劑量的服藥。一種能夠促進紅血球譜系增殖的生長因子可以單獨、或與EPO一起或與其它生長因子一起使用來治療這類病人并降低所需的輸血量。一種生長因子也可以提高T細胞的數量并在治療AIDS病人上可能有特殊的用處。發明綜述本發明是關于分離的或均一的蛋白形式的具有生物活性的flt3-配體(flt3-L)。并且，本發明涉及編碼flt3-L的DNA和包含編碼flt3-L的cDNA的表達載體。已被包含編碼flt3-L的cDNA表達載體轉染或轉化的宿主細胞，和將這種宿主細胞培養在導致flt3-L表達的條件下來生產flt3-L的方法也均在本發明的范圍之內。
flt3-L可被用于制備藥物用于同源、異源或自體的移植方法。藥物可以包含單獨的flt3-L或與其它生長因子合用，如白細胞介素、集落刺激因子、蛋白酪氨酸激酶和細胞素。
本發明包括使用flt3-L進行基因治療和對其它一些病患者進行治療的方法。這些病包括骨髓再生障礙性綜合癥，再生障礙性貧血、HZV感染(AIDS)和癌癥如乳腺癌、淋巴瘤、小細胞肺癌、多發性骨髓瘤、成神經細胞瘤、急性白血病、睪丸瘤和卵巢癌。
本發明也涉及抗體尤其是與flt3-L進行免疫反應的單克隆抗體。本發明還包括含有flt3-L的可溶部分及免疫球蛋白蛋白質的恒定區域的融合蛋白。
本發明也涉及在外緣血祖代細胞或干細胞的移植過程中使用flt3-L。典型地，將外緣血祖代細胞或干細胞在進行骨髓抑制的細胞減少治療之前從病人身上移去，然后再與細胞減少治療的同時或在其后重新輸回，以反作用于這類治療所引起的骨髓抑制作用。本發明按以下的至少一種方式提供了有效量flt3-L以供使用(i)在收集祖代細胞或干細胞以增加或動員這類循環細胞的數目之前給病人服用flt3-L；(ii)在收集病人的祖代細胞或干細胞之后，在體外情況下使用flt3-L來擴展這類細胞；(iii)在獎所收集的祖代細胞或干細胞移植后，給病人服用flt3-L以促進植入。本發明的移植方法還進一步包括按順序使用或與flt3-L同時使用有效量的細胞素。這類細胞素包括但并不局限于白細胞介素(IL)IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14或，IL-15，由一組包含G-CSF，GM-CSF，M-CSF或GM-CSF/IL-3的融合物，或其它生長因子如CSF-1，SF，EPO，白血病抑制因子(LIF)或成纖維細胞生長因子(FGF)中所篩選出的一種CSF。flt3-L以同樣方式對于同源或異源移植也是有用的。
本發明還進一步包括一種祖代細胞或干細胞的擴展培養基，該培養基包括細胞生長培養基，自體的血清，單獨使用或與以上所列的一種細胞素共同使用的flt3-L。
本發明還進一步包括通過使用flt3-L來擴展由臍帶血液中所收集的祖代細胞和干細胞。其擴展可通過單獨使用、順序使用或與以上所列的一種細胞素共同使用flt3-L來實現。
本發明還進一步包括在基因療法中flt3-L的應用。flt3-L能夠使被外源DNA轉染的用于基因治療的早期造血祖代細胞或干細胞增殖和被培養。另一種種辦法可將編碼flt3-L的cDNA轉染入細胞以便最終將其基因產物傳送至靶細胞或組織。
并且，本發明還包括通過使用flt3-L促進體內紅血球產生來治療貧血病。這類應用包括在與細胞減少療法連同在其后需要促進紅血球生成時給病人服用flt3-L。這種治療可包括與以上所列的細胞素中所選的一種生長因子共同服用。在這類治療中優選的細胞素包括EPO，IL-3，G-CSF和GM-CSF。這類治療對于AIDS病人，尤其是在接受AZT治療的AIDS病人特別有用。
由于flt3-L促進干細胞的產生，其他帶有flt3受體的非造血干細胞可被本發明的flt3-L所影響。flt3-L在體外受精過程中是有用的，并且可在體內用于對不育條件和處理。在消化道中，flt3-L可被用于對輻射和化學治療所引起的腸損傷的治療。flt3-L也可被用于對由人免疫缺陷病毒(HZV)感染的病人的處理。這類處理包括通過服用flt3-L來促進T細胞和紅血球的體內產生及體外擴展。這類處理可阻止T細胞尤其是CD4陽性的T細胞的缺陷，并且可能增高病人對病毒的免疫反應，從而改善病人的生命質量。flt3-L可被用于促進干細胞來導致發囊的發育，從而促進毛發生長。
并且，flt3-L可被結合于一種固相基質上并用于通過親和法來純化或分離能夠在細胞表面表達flt3的細胞。本發明包括由溶液中的細胞混合物分離在其表面具有flt3受體的細胞，包括使混合物中的細胞與上面有flt3-結合分子的接觸表面接觸，以及將接觸表面和溶液分離。一旦被分離后，細胞可被用flt3-L體外擴展并被病人服用。
關于本發明的詳細描述已分離到一種編碼小鼠的flt3-L的cDNA并揭示于序列SEQID NO1。也已分離到一種編碼人的flt3-L的cDNA并揭示于序列SEQ ZD NO5。這些關于編碼小鼠和人的flt3-L的cDNA的發現使得能夠構建含有編碼flt3-LcDNA的表達載體；用表達載體轉染或轉化的宿主細胞；以均一蛋白質形式存在的具有生物活性的小鼠和人的flt3-L；以及可與小鼠和人的flt3-L發生免疫反應的抗體。
flt3-L對于能夠表達flt3受體的細胞(包括非造血細胞)的增強、促進、增殖或生長是有用的。由于flt3受體已被發現存在于腦、胎盤、神經組織、造血器官組織中，以及被發現分布于睪丸，卵巢，淋巴結，脾，胸腺和胎兒的肝臟中，與那里的組織損害相聯系的各種條件的治療是可能的。雖然不僅僅局限于此，以下將描述flt3-L的特殊應用。
此處所用的術語“flt3-L”是指在祖代細胞和干細胞中所發現的能夠與flt3受體獨立結合或復合的一類多肽。術語“flt3-L”包含具有氨基酸順序SFQ ID NO2的1至231或氨基酸順序SEQ IDNO6的1至235的蛋白質，以及與氨基酸順序SEQ ID NO2的1至231和氨基酸順序SEQ ID NO6的1至235具有高度相似性或高度同一性的蛋白質。并且，此術語指具有生物活性的序列SEQ IDNO1或SEQ ID NO5的DNA基因產物。此術語更進一步包括膜結合蛋白質(包括其細胞內區域、膜區域和細胞外區域)，以及基本含有蛋白質的細胞外部分，保留有生物活性并能被分泌出去的可溶的或被截短的蛋白質。這類可溶蛋白質的特殊例子是具有氨基酸順序SEQ ID NO2的28至163和氨基酸順序SEQ ID NO6的28至160的蛋白質。
與flt3-L有關的術語“生物活性”是指flt3-L能夠與flt3-L結合。或者說，“生物活性”指flt3-L能夠通過膜結合的flt3-L白細胞傳送促進信號。
“分離的”指flt3-L沒有與其他蛋白質或多肽結合，例如，flt3-L可作為一種重組子宿主細胞培養的純化產物或純化的抽提物。
此處所指的“flt3-L變種”，指基本與天然的flt3-L同源但又由于一個或更多的氨基酸的缺失、插入或替換而具有與天然的flt3-L(來源于人、小鼠或其他哺乳動物)不同的氨基酸順序的一類多肽。變種的氨基酸順序一般至少在80％上與天然的flt3-L全同，更佳為至少90％相同。通過使用如 Devereux等(Nucl.Acids.Res 12387，1984)所描述的GAP計算機程序6.0版來比較順序資料可以確定其同源性的百分比，此程序可由威斯康辛大學遺傳學計算機組(Uni-vesity of Wiscousin Genetics Computer Gronp(UWGCG))得到。GAP程序使用了被Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2482，1981)修訂過的Needleman和(J.Mol.Biol.48443，1970)的排列方法。對于GAP程序較好的缺失參數包括(1)對核苷酸的一元比較矩陣(包含數值1指同一和數值0指非同一)，以及如Schwartz和Daylofl所描述的(Atlas of Protein Sequence andStructure，Natioual Biomedical Research Foundation，PP.353—358，1989)Gribskov和Burgess的加權比較矩陣；(2)對每一個缺隙有3.0及對每一個缺隙中的每一個符號有附加的0.10的罰分；(3)對末端缺隙沒有罰分。變種可以包含保守地替換順序，這指一個氨基酸殘基可以被一個具有相似和物理化學性質的氨基酸殘基所替換。保守替換的例子包括將一個脂肪族氨基酸用另一個替換。例如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或丙氨酸相互替換，或將一個極性氨基酸替換成另一個。如賴氨酸和精氨酸之間的替換，谷氨酸和天冬氨酸之間的替換以及谷氨酰胺和天冬酰胺之間的替換。其他這類保守性替換，例如，具有相似的疏水性的整個區域的替換，也是已知的。本發明也包括天然產生的flt3-L變種。這類變種的例子有由于交替的mRNA剪接作用造成的或由于flt3-L蛋白的蛋白酶解作用分解而得到的蛋白質，同時仍舊保留有flt3-L的結合性能。交替的mRNA剪接作用可以產生一個截短的但仍具有生物活性的flt3-L蛋白質，例如天然產生的可溶形式的蛋白質。變種可歸因于蛋白水解作用，這包括在不同類型的宿主細胞中在表達上N-或C-末端的區別，以及由于蛋白酶解作用而除去了flt3-L蛋白質的一個或多個末端氨基酸(一般為1至5個末端氨基酸)。
術語“自體移植”見于美國專利第5,199,942號，此處以文獻形式出現。簡單地說，此術語是指進行自體造血的祖代細胞或干細胞移植的方法，包括(1)在進行細胞減少療法之前從病人處收集造血祖代細胞或干細胞；(2)用flt3-L在體外擴展造血祖代細胞或干細胞以提供含有數目增加了的造血祖代細胞或干細胞的細胞制備物；(3)與細胞減少療法一起或隨后給病人施用細胞制備物。祖代細胞和干細胞可由收集的外周血液或骨髓外植體獲得。任選地，由以上所列的細胞素中選擇一種或多種與flt3-L一起合用來增殖特定類型的造血細胞或影響增殖的造血細胞群的細胞動能。在前述中，SF，IL-1，IL-3，EPO，G-CSF，GM-CSF和GM-CSF/IL-3融合物是極好的，尤以G-CSF，GM-CSF和GM-CSF/IL-3為更佳。術語“異源移植”指從一種哺乳動物移得骨髓或外周血液祖代細胞或干細胞，注入同種的另一哺乳動物的方法。術語“同源移植”指在2個遺傳學背景全同的哺乳動物之間進行骨髓移植。
本發明以上所描述的移植方法任選地包括一個體內的預備過程，該過程包括在收集造血細胞之前給病人單獨服用flt3-L或與一種補充生長因子順序地或同時合用以補充造血細胞至外圍血液。合適的補充因子如上所列，較佳的補充因子為flt3-L，SF，IL-1和IL-3。
本發明以上所描述的方法任選地包括一個體內的后續過程，該過程包括在移植細胞制備物之后給病人單獨服用flt3-L或與一種移入生長因子順序地或同時地合用以利于從細胞制備物中移入和加強增殖移入的造血祖代細胞或干細胞。合適的移入因子如上所列，較佳的移入因子為GM-CSF，G-CSF，IL-3，IL-1，EPO和GM-CSF/IL-3融合物。
本發明進一步包括一種祖代細胞或干細胞擴展培養基，該培養基包括細胞生長培養基，自體血清，以及單獨使用或與以上所列的一種細胞素生長因子一起使用的flt3-L。較佳的生長因子為SF，GM-CSF，IL-3，IL-1，EPO和GM-CSF/IL-3融合物。
特別地，flt3-L可被用于促進造血和非造血干細胞的增殖。當某些組織出現特定的組織損害時這類促進是有益的。flt3-L可被用于治療神經損害并可作為神經細胞的一種生長因子。flt3-L也可能被用于體外受精過程和不育的體內治療。flt3-L在對于由放射或化學治療所引起的消化道損傷的治療中可能是有用的。由于flt3受體分布于可導致發囊發育的干細胞，flt3-L或許可被用于促進毛發的生長。
由于flt3-L已表現出能夠促進T細胞和紅細胞的增殖(見下面的例子)，flt3-L可被用于對人免疫缺陷病毒(HZV)感染的病人的治療。這類治療包括施用flt3-L來促進T細胞的體內產生以及體外擴展。并且，flt3-L可以阻止CD4陽性T細胞的缺乏。這類治療可以增強或維持病人對病毒的免疫反應，從而改善或維持病人的生命力。而且，這類體內處理可以促進紅血球譜系的細胞，從而提高病人的血細胞比容和血紅蛋白的水平。flt3-L可被單獨給藥或與以上所列的細胞素中所選擇出的細胞素順序地或一起服用。
由于flt3-L對祖代細胞和干細胞的專一性，它可被用于基因療法。基因療法包括給病人使用已被外源DNA轉染的，可以被移入的細胞。見Boggs，International J.Cell Cloning，880—96，(1990)；kohn等，Cancer Invest.，7(2)179—192(1989)；Lehn，Bone Mar-row Transpl..，5287—293(1990)；和Verma，Scientific American，PP.68—84(1990)。使用在專業領域中已知的基因療法，將基因轉移入哺乳動物的過程包括(a)在培養基中培養早期造血細胞，其中含有單獨的flt3-L或與從以上所列的細胞素中選出的細胞素順序地或一起合用的flt3-L；(b)用外源DNA轉染步驟(a)中的培養細胞；(c)給哺乳動物應用轉染過的細胞。此方法是一個含有以上步驟(a)和(b)的用一個基因轉染祖代細胞或干細胞的新方法。更進一步地，通過使用相同或類似的方法，可將編碼flt3-L的cDNA轉染入這類傳送細胞以將flt3-L基因產物傳送至靶組織。
實施例1描述了用于篩選flt3-L的一種新的flt3-LFc融合蛋白的構建。其他抗體Fc區域可用實施例1中所描述的人IgGlFc區域取代。其他合適的Fc區域有可被蛋白質A和蛋白質G以高度親和性結合的人IgGl的Fc區域或人或小鼠的IgGlFc區域的片段，例如至少包含了絞鏈區域以使鏈間二硫鍵能夠形成的區域。flt3Fc融合蛋白有個優點即可被容易地純化。而且，在2個分離的融合蛋白的Fc區域之間形成的二硫鍵可以產生二聚物。鑒于所尋找的配體有是多聚物的可能性，選擇二聚的flt3Fc受體是由于有高親和結合flt3-L的潛在優點。
如上所述，本發明的一個方面是可溶性的flt3-L多肽。可溶性的flt3-L多肽包括天然的flt3-L的全部或部分的細胞外區域，但沒有使多肽保持在細胞膜上的跨膜區域。可溶性的flt3-L多肽有個優點是包含天然的(或異源的)信號肽在初始合成時以促進分泌，但當flt3-L被從細胞分泌出后信號肽被切除。本發明的可溶性的flt3-L保留了結合flt3受體的能力。事實上，可溶性的flt3-L也可包含部分的跨膜區或部分的細胞質區或其他順序，如果可溶性的flt3-L可被分泌的話。
可溶性的flt3-L可以通過從培養基中分離能夠表達所期望的蛋白質的完整細胞來鑒定(并且與其非溶解性的膜結合的flt3-L區分開)，例如通過離心，檢測培養基(上清液)中所期望的蛋白質的存在。培養基中flt3-L的存在表明了蛋白質已被從細胞中分泌出來因而是所期望蛋白質的溶解形式。
可溶性的flt3-L較之天然的結合的flt3-L蛋白質具有很多優點。由于可溶性蛋白質被從細胞中分泌出來，所以可以由重組宿主細胞中純化此蛋白質。更進一步，可溶性蛋白質一般更適合于進行靜脈注射。
可溶性的flt3-L多肽的例子包括那些含有天然flt3-L蛋白質的細胞外區域的基本部分的蛋白質。這類可溶性的哺乳動物flt3-L蛋白質包括氨基酸順序SEQ ID No2的28至188或氨基酸順序SEQID No6的28至182氨基酸。并且，本發明也包含少于完整細胞外區域的縮短的可溶性flt3-L蛋白質。這類縮短的可溶性蛋白質的代表是氨基酸順序SEQ ID No2的28至163和氨基酸順序和SEQID No6的28到160氨基酸。當在宿主細胞內最初表達時，可溶性的flt3-L蛋白質可能另外還含有一種如下所描述的異源的信號肽，它在所用的宿主細胞中具有功能。或者，蛋白質中可包含天然的信號肽，哺乳動物flt3-L包含氨基酸順序的SEQ ID No2的1到188和氨基酸順序SEQ ID No6的1到182的氨基酸。在本發明的一個具體例子中，可溶性的flt3-L被表達為一個融合蛋白質，它包括(從N-端到C-末端)酵母α因子信號肽，一種如下所描述和在美國專利第5,011,092號的FLAG肽和包括氨基酸順序SEQ ID No2的28到188氨基酸的可溶性flt3-L。這種重組融合蛋白在酵母細胞內表達并被分泌出來。FLAG肽能夠便于此蛋白質的純化，并隨后可用牛粘膜腸激酶將其從可溶性的flt3-L上切除。分離的編碼可溶性flt3-L蛋白質的DAN序列也在本發明的范圍之內。
包括可溶性多肽的縮短的flt3-L可通過任何一種傳統方法而制備。一種所期望的DNA序列可通過已知的“本身”技術而化學合成。DNA片段也可通過對全長的克隆的DNA序列進行限制性內切酶消化而得到，然后通過瓊脂糖凝膠電泳來分離。可以利用含有限制性內切酶酶切位點的連接頭將所期望的DNA片段插入至表達載體，或者該片段可在天然存在的酶切位點上進行消化。眾所周知的聚合酶鏈式反應(PCR)方法也可被用于擴增編碼所期望的蛋白質片段的DNA序列。更進一步地，已知的誘變技術可在所期望的位點插入一個終止密碼子，例如在細胞外區域的最后一個氨基酸的下游立刻插入一個終止密碼子。
在另一個嘗試中，酶切處理(如用Bal31核酸外切酶)可用于從具有特定的所期望末端的DNA片段中缺失末端的核苷酸。在所能得到的市售的連接頭中有那些可被連接至由Bal31消化后所產生的平頭末端上并含有限制性內切酶酶切位點的。或者那些用于改造DNA片段的N-末端或C-末端以達到所期望位點的寡聚核苷酸可被人工合成并連接至DNA片段上。所人工合成的寡聚核苷酸可在所期望的編碼序列上游含有一個限制性內切酶酶切位點并在編碼序列的N-末端設置一個起始密碼子(ATG)。
如以上所述，本發明提供了分離的或均一的flt3-L多肽，二者均為重組體和非重組體。保存所希望的生物活性(如能夠與flt3結合)的天然flt3-L的變種或衍生種類可以通過編碼天然flt3-L多肽的核苷酸順序的突變而獲得。天然氨基酸順序的變化可通過任何一種傳統方法來實現。通過合成含有突變序列的寡聚核苷酸可將突變引入至特定的位點，通過二端鄰接的限制酶切位點可以將這類寡聚核苷酸連接至天然序列的片段上。連接后，所得的改造了的順序具有所期望的氨基酸插入，替換或缺失的類似序列。
另一種辦法是，通過寡聚核苷酸定向及位點專一性突變方法可以提供變化了的基因，其預定的密碼子可以通過替換、缺失或插入而發生改變。對以上進行突變的典型例子被揭示于Walder等，(Gene42133，1986)；Bauer等，(Gene3773，1985)；Graik(Bio Tech-niqus，January 1985，12—19)；Smith等(Gerefic Engineering；Principles and Methods，Planam Press，1981)；Kunkel(Proc.Natl.Acad.Sci.USA82488，1985)；Kunkel等(Methods in Enzy-mol 154367，1987)和美國專利第4,518,584號及4,737,462號。
flt3-L通過與其他化學部分形成共價的或聚集的接合物而被改造以產生flt3-L衍生物，這類化學部分如糖基團，脂類，磷酸基，乙酰基等等。flt3-L的共價衍生物可以通過將化學部分連接至flt3-L氨基酸側鏈的功能團或flt3-L多肽的N-末端或C-末端以及flt3-L的細胞外區域來制備。在本發明的范圍之內的flt3-L的其他衍生物包括flt3-L的共價的或聚集的接合物以及含有其他蛋白質或多肽的片段，例如在重組體培養中所合成的N-末端或C-末端融合蛋白。例如，聚合物可以包含一個信號多肽或前導多肽順序(例如Saccha-romyces的α-因子前導順序)，這些順序位于flt3-L多肽的N-末端。信號肽和前導肽在共翻譯過程中或翻譯后引導聚合物從其合成位點轉移至細胞膜或細胞壁的內部或外部。
flt3-L的融合多肽可以包含便于純化和鑒定flt3-L的附加肽。這類肽包括，例如，聚組氨酸或由美國專利第5,011,912號及Hopp等(Biol Techuology 61204，1988)所描述的抗原鑒定肽。
本發明還進一步包括和或不和天然模式的糖基化聯系的flt3-L多肽。根據選用的表達系統的不同，在酵母或哺乳動物表達系統例如COS—7細胞)中所表達的flt3-L與天然的flt3-L在分子量和糖基化模式方面可以相似或具有很大不同。
在細菌表達系統如E.coli(大腸桿菌)中所表達的flt3-L多肽是沒有糖基化的分子。
本發明還進一步包括特多構建物，這類構建物編碼氨基酸殘基或順序的各種不同的增加或替換，對其生物活性及結合不是必需的末端或內部殘基或順序的缺失。例如，flt3-L的細胞外區域N-端的糖基化位點可以通過修飾而阻止糖基化作用的進行，從而可在酵母或哺乳化動物表達系統中表達減少了碳水化合物的類似物。真核多肽的糖基化位點的特征為一個氨基酸三聯體。天冬酰胺-X-Y，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸，Y是絲氨酸或蘇氨酸。在小鼠和人的flt3-L蛋白質中，分別包含有兩個這樣的氨基酸三聯體，分別在氨基酸順序SEQ ID No2的127到129和152到154以及氨基酸順序SEQ ID No2的126到128和150到152。對編碼這些氨基酸三聯體的核苷酸序列做適當的替換，增加或缺失可以導致阻止碳水化合和殘基在天冬酰胺側鏈上的附著。一個單獨的核苷酸的變化，例如選擇使天冬酰胺被另一個不同的氨基酸所取代，足夠失活一個N-端糖基化位點。已知的失活蛋白質中N-端糖基化位點的方法包括那些美國專利第5,071,972號和EP第276,846號所描述的方法。
在另一個實施例中，對于生物活性不是最重要的編碼半胱氨酸殘基的序列可以改變使半胱氨酸殘基缺失或被其他氨基酸所替代，以阻止復性過程中錯誤的分子內二硫鍵橋的開成。通過對鄰近的二堿氨基酸殘基的修飾制備其它相當的變化以增強有KEX2蛋白酶活性存在的酵母系統中的表達。EP第212,914號揭示了通過使用位點專一性突變來失活蛋白質中KEX2蛋白酶的加工位點。通過氨基酸殘基的缺失，增加或替換以失活KEX2蛋白酶的加工位點。這些修飾改變了精氨酸-精氨酸、精氨酸-賴氨酸及賴氨酸-精氨酸對消除了這些相鄰的堿性氨基酸的出現。賴氨酸-賴氨酸結成對被認為對KEX2裂解的敏感性變差，而且精氨酸-賴氨酸或賴氨酸-精氨酸轉變成賴氨酸-賴氨酸代表了一個失活KEX2位點的保守的且較佳的方法。小鼠和人flt3-L分別含有兩個KEX2蛋白酶加工位點，即氨基酸順序SEQ ID No2的216到217和217到218以及氨基酸順序SEQ ID No6的211到212和212到213。
在本發明范圍之內的核苷酸順序包括分離的DNA和RNA序列。這些序列在中等的和十分嚴格的條件下可與天然的flt3-L寡聚核苷酸序列雜交并編碼具生物活性的flt3-L。其中等嚴格雜交條件如Sambrook等所定義(分子克隆實驗手冊(Molecular CloningALaboratory Manual)，2ed.Vol.1.PP.101—104，Cold Spring Har-bor Laboratory Press，1989)，包括使用含5×SSC，0.5％SDS10mM EDTA(PH8.0)的預洗液，雜交條件為約55℃，5×SSC，過夜。十分嚴格的條件包括高溫下的雜交和洗滌。專業技術人員將了解到溫度和洗滌溶液的鹽濃度按照如探針長度等因子的需要而發生改變。
由于已知的遺傳密碼子的簡并性，超過一種密碼子可以編碼同一種氨基酸，與所示的序列SEQ ID No1和SEQ ID No5不同的DNA序列仍能編碼具有與氨基酸順序SEQ ID No2和氨基酸順序SEQ ID No6的flt3-L蛋白質。這類變種DNA序列可能起因于不活動突變(如在PCR擴增過程中發生)或是天然序列的審慎地突變的產物。
本發明提供了編碼具有生物活性的flt3-L的相當的分離的DNA序列，這些序列篩選自(a)由天然哺乳動物的flt3-L基因的編碼區域而得到的DNA；(b)包含如序列SEQ ID No1和SEQ IDNo5所示的核苷酸序列的cDNA；(c)在中等的嚴格條件下能夠與(a)中的DNA雜交并編碼具有生物活性的flt3-L的DNA；(d)由于遺傳密碼子簡并如(a)(b)或(c)中所定義的DNA并編碼具有生物活性的flt3-L的DNA。本發明也包括由這些相當的DNA序列所編碼的flt3-L蛋白。
與DNA序列SEQ ID No1或SEQ ID No5相當的DNA，在中等嚴格的條件下能夠與編碼氨基酸順序SEQ ID No2的28到163和SEQ ID No6的28到160的多肽的天然DNA序列雜交。由這類DNA所編碼的flt3-L蛋白質的例子有(但并不局限于此)flt3-L片段(可溶的或膜結合的)和包括如上所述的失活的N-端糖基化作用位點，失活的KEX2蛋白酶加工位點或保守的氨基酸替換的flt3-L蛋白質。由來自于其他哺乳動物種類的DNA所編碼的flt3-L蛋白質，其中的DNA可以和序列SEQ ID No1或SEQ IDNo5的cDNA雜交，也屬于此范圍。
擁有結合flt3受體的必要能力的變種可以通過任何合適的檢測方法來鑒定。flt3-L的生物活性可以通過，例如競爭性結合至flt3受體的配體結合區域(即競爭性結合檢測)來確定。
一種類型用于flt3-L多肽的競爭性結合檢測使用了一種放射標記的，可溶性的人flt3-L和表達細胞表面flt3受體的完整細胞。除了完整細胞以外，人們可以用融合蛋白的Fc區域替換可溶性的flt3受體(如flt3Fc融合蛋白)，這些受體是通過蛋白質A，蛋白質G，或者flt3分子的或分子的Fc部分的抗體結合在固相載體上的。另一種類型的競爭性結合檢測使用了放射性標記的可溶性flt3受體如flt3Fc融合蛋白和表達flt3-L的完整細胞。或者是可溶性的flt3-L可被結合至固相上以便對表達flt3的細胞進行正篩選。
競爭性結合檢測可以按照傳統方法進行。例如，可用放射標記的flt3-L與假定的flt3-L同源物競爭以檢測其與表面結合的flt3受體的結合活力。通過競爭性放射自顯影板結合檢測可得到定性的結果，或者也可以用Scatchart做圖產生定量結果。
或者，flt3結合蛋白質，如flt3-L和抗flt3拉體，可被結合至固相載體如柱層析基質或適于進行鑒定分離或純化細胞的相似底物，這類細胞在其表面表達flt3受體。flt3結合蛋白結合到固相載體的接觸表面可以通過許多方法來進行，例如，通過構建flt3-LFc的融合蛋白并且通過蛋白質A或蛋白質G的相互作用將其結合至固相載體。各種其他的將蛋白質結合至固相載體的方法對本專業的技術人員是已知的并可用于本發明。例如，可用flt3結合蛋白包被磁性微球體，然后置于孵育容器中通過磁場。含有造血祖代細胞或干細胞的細胞混合物的懸浮液與具有flt3結合蛋白的固相載體相接觸。在其表面具有flt3受體的細胞與固定的flt3結合蛋白結合，而未結合的細胞將被洗掉。這種親和結合法對于從溶液中純化、檢測或分離這類表達flt3的細胞是有用的。從固相載體上釋放正篩選細胞的方法對本專業的技術人員是已知的，并且也包含酶的使用。這類酶較好的為對細胞無毒、無害并且可以裂解細胞表面結合的配偶體，在flt3flt3-L相互作用的情況下，酶最好能夠裂解flt3受體，從而所得的細胞懸浮液不含“外源”flt3-L材料。然后純化的細胞群體在對病人移植前可體外擴展，其數量足夠重建病人的造血和免疫系統。
或者，被懷凝含有flt3的細胞混合物可以首先與生物素化的flt3結合蛋白質保溫。典型的孵育時間至少為1小時以保證對flt3的足夠結合。所得的混合物然后通過被抗生物素蛋白被覆的珠充滿的柱。生物素對抗生物素蛋白的高親和力使得細胞結合于珠上。對抗生物素被覆的珠的使用在專利領域中是已知的。見See Berenson等，J.Cell.Biochem.，10D239(1986)。對非結合材料的洗脫以及結合細胞的釋放可依照傳統方法進行。
在以上所描述的方法中，合適的flt3結合蛋白是flt3-L，抗flt3抗體，和其他能夠與flt3高度親和的蛋白質。較佳的flt3結合蛋白是flt3-L。
如以上所描述的，本發明的flt3-L可以用來分離表達flt3受體的細胞。在另一方法中，flt3-L或細胞外區域或其一個片段可被共軛結合至可檢測的部分如125I上以檢測表達flt3的細胞。用125I做放射性標記可以采用幾種標準的方法中的任一種獲得具有高比活性標記的有功能的125I-flt3-L分子。或使用對flt3區域或分子的Fc區域的碘化的或結合了生物素的抗體。可以使用另一種可檢測的部分例如可催化比色或熒光光度反應的酶，可使用生物素和抗生物素蛋白。對于欲檢測其flt3受體表達的細胞可與標記的flt3-L接觸，在保溫之后，移去未結合的標記的flt3-L并用可檢測的部分來測定結合。
在與以上所描述的相類似的競爭性檢測方法中使用接合的可溶性的flt3受體(例如125I-flt3Fc)也可以確定flt3-L(包括其變種)的結合特性。但在這種情況下，表達flt3受體的完整細胞或結合在固體底物上的可溶性的flt3受體，被用來測量含有假定的flt3-L變種的樣品中與接合的可溶性的flt3競爭性結合到flt3-L上的程度。
其他用來檢測flt3-L的方法包括抗flt3-L抗體的使用，為應答flt3-L而增殖的細胞系，或在flt3-L存在的情況下表達flt3受體并增殖的重組細胞系。例如，BAF/BO3細胞系缺乏flt3受體且為IL-3依賴型(見Hatakeyama等，Cell，59837—845(1989))。當BAF/B03細胞系被含有flt3受體基因的表達載體轉染后，對IL-3或flt3-L發生反應而增殖。一個轉染flt3的合適表達載體的例子為pCAV/NOT質粒，見Mosley等，Cell，59335—348(1989)。
flt3-L多肽可以寡聚體的形式存在，如共價連接或非共價連接的二聚體或三聚體。寡聚體可通過在不同的flt3-L多肽上的半胱氨酸殘基間形成的二硫鍵來連接。在本發明的一個具體例子中，flt3-L二聚體是通過一種方式將flt3-L融合至一種抗體例如IgGl)的Fc區域產生的，該融合方式不影響flt3-L對flt3配體結合區域的結合。Fc多肽更佳的為融合至可溶性的flt3-L的C-末端(僅包含細胞外區域)。一般制備含有異源的與抗體衍生的多肽的不同部分融合的多肽的融合蛋白質的方法已的描述，例如Ashkenazi等(PNAS DSA8810535，1991)和Byrn等(Nature 344677，1990)及那里的引文。一種編碼flt3-LFc融合蛋白質的基因融合被插入至一個適當的表達載體。flt3-LFc融合蛋白質的裝配很像抗體分子，在Fc多肽間形成的鏈間的二硫鍵產生了二價的flt3-L。如果融合蛋白質由一種抗體的重鏈和輕鏈組成，就有可能形成帶有多至4個flt3-L細胞外區域的flt3-L寡聚物。或者，人們可以用一個肽接頭來連接兩個可溶性的flt3-L區域。
可以通過已熟知的方法來制備含有編碼flt3-L的DNA的重組表達載體。表達載體包括將flt3-L的DNA序列可操作地連接至合適的轉錄或翻譯調節核苷酸序列，如那些由哺乳動物，微生物，病毒或昆蟲基因衍生的序列。調節序列的例子包括轉錄啟動子、操縱子、或增強子，一個mRNA的核糖體結合位點，和合適的控制轉錄和翻譯起始和終止的序列。當調節序列與flt3-L DNA序列功能上相關連時，核苷酸序列是一種“可操作的連接”。例如，一個啟動子核苷酸序列被可操作地連接至flt3-L的DNA序列如果這個啟動子核苷酸序列能夠控制flt3-L的DNA序列的轉錄。在所期望的宿主細胞內的復制能力通常由一個復制起始區所決定，用于鑒定轉化子的篩選基因，可以共同插入至表達載體。
并且，編碼適當的信號肽不是與flt3-L天然聯系的基因可插入表達載體。例如，一個信號肽(分泌前導)的DNA序列，可以融合至flt3-L的序列的閱讀框內，以便flt3-L被初始翻譯為含有信號肽的融合蛋白形式。在預期的宿主細胞中具有功能的信號肽可以增強fIt3-L多肽的細胞外分泌。在flt3-L被從細胞中分泌出來后信號肽可被從flt3-L從肽上剪切去。
用于表達flt3-L多肽的合適的宿主細胞包括原核生物，酵母或高等真核細胞。用于細菌、真菌、酵母和哺乳動物細胞宿主的合適的克隆和表達載體已被描述，例如，Pouwels等，Cloning VectorsAl-aboratory Manual，Elsevier，New York(1985)。也可以使用本文所揭示的DNA構建物所衍生的RMA，和無細胞翻譯系統來生產flt3-L多肽。
原核生物包括革蘭氏陰性和革蘭氏陽性有機體，例如，E.coli或Bacilli。用于轉化的合適的原核生物宿主細胞包括，例如，E.coli，Bacillus subtilis，Salmonella typhimurium，和Pseuclomonas，Streptomyces和Staphylococcus屬的各種其他種類。在原核宿主細胞中，例如E.coli，flt3-L多肽可以包括一個N-末端的甲硫氨酸殘基以便于重組多肽在原核宿主細胞內的表達。N-末端的甲硫氨酸可從表達的重組flt3-L多肽上被剪切。
用于原核宿主細胞的表達載體一般含有一個或多個表型選擇標記基因。一個表型選擇標記基因可以是，例如，一個編碼抗生素抗性蛋白或支持營養需求的基因。對于原核生物宿主細胞有用的表達載體的例子包括那些由如克隆載體pBR322(ATCC 37017)等市售質粒所衍生的載體。pBR322包含氨芐青霉素和四環素抗性基因以提供鑒定轉化細胞的簡單方法。用pBR322來構建一個表達載體，將一個合適的啟動子和flt3-L DNA序列插入至pBR322載體上。其他的市售載體包括pKK233—3(pharmacia Fine chemicals，Uppsala，Sweden)和pGEMI(Promega Biotec，Madision，WI，USA)。
一般用于重組原核宿主細胞表達載體的啟動子序列包括β-內酰胺酶(青霉素酶)、乳糖啟動子系統(Chang等，Nature 275615，1978)；Goeddel等，Nature 281544，1979)，色氨酸啟動子系統(trp)(Goeddel等，Nucl.Acids.Res，8405)，1980；EP-A-36776)和tac啟動子系統(Maniatis，Molecular CloningA LaboratonyMauual，Cold Spring Harbor Laboratory，p.412，1982)。一個特別有用的原核生物宿主細胞表達系統使用一個噬菌體λPL啟動子和cI857ts不耐熱阻遇物序列。由American Type Culture Collection可得到的包括有λPL啟動子衍生物的質粒載體包括質粒pHUB2(保存于E.coli菌株JMB9(ATCC37092))和pPLc28(保存E.coli RRI(ATCC 53082))。
flt3-L多肽同樣可在酵母宿主細胞內表達，較好是Saccha-romyces屬(如S.cerevisiae)。其他酵母的屬，如Pichia，K.lactis或Kluyveromyces也可被使用。酵母載體經常包含一個來自2μ酵母質粒的復制序列的起始區，一個自主復制序列(ARS)，一個啟動子區域，多聚腺苷酸化序列，轉錄終止序列和一個選擇標記基因。對酵母載體的合適的啟動子序列包括金屬硫蛋白的啟動子，3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等，J.Biol.Chem.2552073，1980)或其他糖酵解酶(Hess等，J.Adv.Enzyme Reg.7149，1968；Holland等，Biochem，174900，1978)，例如磷酸丙酮酸水合酶，甘油醛-3-磷酸脫氫酶，己糖激酶，丙酮酸脫羧酶，酸果糖激酶，葡萄糖-6-磷酸異構酶，3-磷酸甘油酸變位酶，丙酮酸激酶，丙糖磷酸異構酶，磷酸葡萄糖異構酶，和葡糖激酶的啟動子。其他的用于酵母表達的合適的載體和啟動子被進一步描述于Hitzman，EPA—73,657或Fleer等，Gene，107285—195(1991)；Vam den Berg等，Bis/Technology，8135—139(1990)。另一個選擇是如Russell等和Beier等所描述的葡萄糖可阻遏的ADH2啟動子(J.Biol.Chem，2582674，1982；和Nature 300724，1982)。能夠在酵母和E.coli中復制的穿梭載體可以通過將在大腸桿菌(Ecoli)中用于得篩選和復制(氨芐青酶素抗性基因和復制起始區)的pBR322的DNA序列插入至以上所描述的酵母載體中而構建。
酵母α因子的導序列可以利用來指導flt3-L多肽的分泌。α因子前導序列經常被插入至啟動子序列和結構基因序列之間例如見Kurjan等，Cell 30933，1982；Bitter等，Proc.Natl.Acad.SciUSA815330，1984；美國專利第4,546,082號和EP324,274號。其他的便于將重組的多肽從酵母宿主分泌出來的合適的前導序列對于本領域的專業人員是已知的。一個前導序列可以被改造成在其3’端附近含有一個或更多的限制性酶切位點。這將有利于將前導序列融合至結構基因上。
酵母轉化方法對本專業的技術人員是已知的。其中一個是Hin-nem等所描述的方法(Proc.Matl Acad.Sci，USA 751929，1978)。Hinnen等的方法是在選擇培養基上篩選色氨酸陽性的轉化體，其中選擇培養基由以下幾部分組成0.67％酵母氮源基質，0.5％酪蛋白水解物，2％葡萄糖，10μg/ml腺嘌呤和20μg/ml尿嘧啶。
被含有ADH2啟動子序列的載體轉化的酵母宿主細胞可在豐富培養基上生長以誘導表達。豐富培養基的一個例子由以下幾部分組成1％酵母浸出物，2％蛋白胨，和1％葡萄糖并附加80μg/ml腺嘌呤和80μg/ml尿嘧啶。ADH2啟動子的除阻遏出現在當培養基中的葡萄糖被耗盡時。
哺乳動物和昆蟲細胞培養系統也可用于表達重組的flt3-L多肽。Luckow和Summers綜述了用桿狀病毒系統在昆蟲細胞中生產異種蛋白質(Bio/Technology 647(1988)。也可使用所建立的哺乳動物來源的細胞系。合適的哺乳動物宿主細胞系的例子包括猴腎細胞的COS—7系(ATCC CRL 1651)(Gluzman等，Cell23175，1981)，L細胞，C127細胞，3T3細胞(ATCC CCL 163)，中國倉鼠卵巢細胞(CHO)，HeLa細胞，和BHK(ATCC CRL 10)細胞系，以及由McMahan等(EMBO J.102821，1991)所描述的非洲綠猿腎細胞系CVI(ATCC CCL 70)衍生的CV-1/EBNA-1細胞系。
哺乳動物宿主細胞表達載體的轉錄和翻譯控制序列可由病毒基因組切得。通用的啟動子序列和增強子序列來源于多瘤病毒，腺病毒2，猿猴病毒40(SV40)和人巨大細胞病毒。由SV40病毒基因組得到的DNA序列，例如SV40起始區，早期和晚期啟動子，增強子，剪接和多聚腺苷酸化位點可用于提供其它的遺傳元件以在哺乳動物宿主細胞中表達結構基因順序。由于病毒的早期和晚期啟動子可以容易地以一個片段從病毒基因組中獲得所以特別有用。此片段也可以含有病毒的復制起始區(Fiers等，Nature 273113，1978)。小些的或大些的SV40片段也可被使用，倘若位于SV40病毒復制起始區從HindIII位點至BglI位點的大約250bp的DNA序列被包括在內的話。
用于哺乳動物宿主細胞的示范性表達載體可以如Okayama和Berg(Mol.Cell.Biol.3280，1983)所揭示的來構建。一個在C127小鼠乳皮細胞中穩定高表達哺乳動物cDNA的有用系統可以通過基本上如Cosman等(Mol.lmmunol.23935，1986)所揭示的方法進行構建。一個有用的高表達載體，PMLSV N1/N4已如Cosman等(Nature 312768，1984)所描述的被保存編號為ATCC 39890。另外的有用的哺乳動物表達載體在EPA-0367566和美國專利應用系列第07/701,405號，生效于1991年5月16日中有描述。載體可以由還原病毒得來。不用天然信號順序，可以增加一種異源的信號順序，例如在美國專利第4,965,195號所描述的IL-7用的信號順序；如Cosman等(Nature 312768，1984)所描述的IL-2受體用的信號序列；EP第367,566所描述的IL—4的信號肽；美國專利第4,968,607號所描述的I型IL-1受體信號和EP460,846號所描述的II型IL-1受體信號肽。
按照本發明做為分離的或均一的蛋白質的flt3-L可以用如上所描述的重組表達系統來生產或從天然存在的細胞中純化。flt3-L可被純化至基上均一，如在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電脈(SDS-PAGE)分析中呈現單一的蛋白質條帶所表明的。
生產flt3-L的一個過程包括培養一種被表達載體轉化的宿主細胞，該載體含有在足以啟動flt3-L表達的條件下的編碼flt3-L的DNA序列。依據所使用的表達系統，flt3-L可由培養基或細胞抽提物中回收。正如對本專業的技術人員所了解的，純化一個重組蛋白質的方法將根據所使用的宿主細胞的類型以及重組蛋白質是否被分泌至培養基而不同。
例如，當使用能分泌重組蛋白質的表達系統時，培養基首先可用市售的蛋白質濃縮濾器進行濃縮，例如，可用Amicon或MilliporePellicon超濾裝置。在濃縮步驟之后，濃縮物可被加到如凝膠過濾介質等純化基質上進行純化。或者可使用陰離子交換樹脂，例如，具有二乙胺乙基側基的底物或基質。這些基質可以是丙烯酰胺，瓊脂糖，葡聚糖，纖維素或其他廣泛用于蛋白質純化的類型。或者，可使用一陰離子交換步驟。合適的陽離子交換劑包括各種不同的不溶性的基質，這些基質含有硫代丙基或羧基甲基基團。硫代丙基基團是較好的。最后，一個或更多的反相高效液相色譜(RP-HPLC)(使用疏水性的RP-HPL介質例如具有甲基或其它脂肪族側基基團的硅膠凝膠)步驟可用來進一步純化flt3-L。上述的一些或所有純化步驟以各種不同方式聯合是人們熟知的并且可用來提供一種基本均一的重組體蛋白質。
有可能使用一種含有flt3受體的配體結合區域的親和柱來親和純化所表達的flt3-L蛋白質。可以用傳統的方法將flt3-L多肽從柱中移去，例如在一高鹽洗脫緩沖液中然后透析至一低鹽緩沖液以供使用或通過改變pH值或其它組分依據所使用的親和基質來決定。或者，親和柱可包含一種結合flt3-L的抗體。實施例6描述了一種使用本發明的flt3-L來產生flt3-L的單克隆抗體的方法。
細菌培養中所產生的重組蛋白質的分離通常通過起始的破碎宿主細胞、離心，從細胞沉淀物中(如果是一種不溶性的多肽)的抽提，或從上清液中抽提(如果是一種可溶性的多肽)，然后是一次或更多次的離心，鹽析出，離子交換，親和純化或大小排阻色譜法。最后，可用RP-HPLC做最終的純化步驟。可以通過任何方便的方法來破碎微生物細胞，如循環凍融法，超聲處理，機械裂解或使用細胞襲解制劑。
轉化的酵母宿主細胞可以較好的用來表達分沖多肽形式的flt3-L以簡化純化過程。從發酵的酵母宿主細胞分泌的重組多肽可采用如Urdal等(J。Chromatog 296171，1984)所揭示的類似方法進行純化。Urdal等描述了兩個順序的、反相HPLC步驟以從制備型HPLC柱中純化重組的人IL-2。
按照本發明含有單鏈核酸順序的(DNA或RNA)反義或正義寡聚核苷酸可與靶flt3-L mRNA序列結合形成一個二聚體，或與雙鏈DNA螺旋的flt3-L序列結合形成三螺旋。按照本發明的反義或正義寡聚核苷酸，包含一個flt3-L的編碼區cDNA的片段。這樣的一個片段一般至少含有的14個核苷酸，較好的為14至30個核苷酸。根據一給定蛋白質的cDNA序列能夠制成反應或正義寡聚核苷酸如Stein和Cohen，(Cancer Res.482659，1988)和Vam der Krol等(Bio Techniques 6958，1988)所描述的。
反義或正義寡聚核苷酸與靶核酸序列的結合(通過幾種方法的其中之一)導致了阻止轉錄(DNA)和翻譯(RNA)的復合物的形成，這包括增強了雙鏈分子的降解，轉錄或翻譯的不到期終止或其它方法。反義寡聚核苷酸于是可用于阻止flt—3蛋白質的表達。反義或正義寡聚核苷酸更進一步包括具有被修飾了的糖-磷酸二酯骨架(或其它的糖連鍵，如WO91/06629所描述)的寡聚核苷酸，此類糖鍵能抵御內切核酸酶的作用。這類具有抗性糖連鍵的寡聚核苷酸在體內是穩定的(即能夠抵御酶的降解)，但其保留與靶核苷酸序列結合的順序特異性。正義或反義核苷酸的其它例子還包括那些與有機部分共價連接(如WO 90/10448中所描述的)的寡聚核苷酸，以及能提高寡聚核苷酸對靶核酸序列親和力的其它部分，如聚-(L-賴氨酸)。更進一步地，嵌入試劑，如橢園霉素(ellipticine)和烷化劑或金屬復合物可被吸附至正義或反義寡聚核苷酸上以修飾反義或正義寡聚核苷酸對靶核苷酸序列的結合專一性。
反義或正義寡聚核苷酸可以通過任何基因轉移方法被引入含有靶核酸序列的細胞，這些方法包括，例如，磷酸鈣(CaPO4)介導的基因轉染，電激法或通過使用如Epstein—Barr病毒(非洲淋巴瘤病毒)的基因轉移載體。通過將反義或正義寡聚核苷酸序列插入至一合適的還原病素載體，然后在體內或體外使細胞與含有插入序列的還原病素載體接觸，可以較好地將反義或正義寡聚核苷酸序列引入含有靶核酸序列的細胞。合適的還原病毒載體包括，但并不局限于此，小鼠還原病毒M-MuLV，N2(由M-MuLV得來的一種還原病毒)，或雙考貝載體DCT5A，DCT5B和DCT5C(見PCT應用美國US90/02656)。
如WO 91/04753所述，反義或正義寡聚核苷酸也可以通過與配體結合分子形式接合物而被引入含有靶核酸序列的細胞。合適的配體結合分子包括，但并不局限于此，細胞表面受體，生長因子，其他細胞素，或其他能夠與細胞表面受體結合的配體。更佳地，配體結合分子的接合實質上不影響配體結合分子與其對應的分子或受體的結合能力，也不會阻止正義或反義寡聚核苷酸或其接合物進入細胞。
或者，如WO90/10448所描述的，一種正義或一種反義寡聚核苷酸可以通過形成寡聚核苷酸一脂質復合物而被引入含有靶核酸序列的細胞。正義或反義寡聚核苷酸復合物可以通過細胞內的內源脂酶而很好地解離。
本發明的flt3-L多肽可以按照已知的通常制備有用的藥物復方的方法做成處方。flt3-L可被結合至混合物，以單獨的活性材料或與其它已知的活性物質，與藥用的合適稀釋液如Tris—HCl，乙酸，磷酸)，防腐劑(例如乙基汞硫代水楊酸鈉，苯甲醇，parabens)，乳代劑，溶解劑，輔劑和/或攜帶劑。適合的攜帶劑及其配方可見Remington’s制藥科學，16th ed.1980，Mack出版社。并且，這類復方可包含與聚乙二醇(PEG)、金屬離子構成復合物的flt3-L，或與聚乙酸、聚羥基乙酸、水凝膠等復合形成的聚合物，或復合形成脂質體，微乳膠微團，單片層或多片層的小泡，紅細胞空殼或球狀體，這些復方將影響flt3-L的物理狀態、溶解度、穩定度、體內的釋放速率和清除速率。flt3-L也可與抗組織專一性的受體、配體或抗原的抗體接合，或與組織專一的受體的配體偶聯。在發現有flt3受體的腫瘤細胞中，可將flt3-L與一種毒素接合，用flt3-L把毒素運送至特定的位點，或用于致敏這些腫瘤細胞以利后來服用抗腫瘤藥物。
flt3-L可被通過表面的、非腸胃道的或經吸入給藥。“非腸胃道的”一詞包括皮下注射，靜脈內、肌肉內或腦池內注射，或灌輸技術。這些復方將典型地包含有效量的flt3-L，單獨或與有效量的其他活性物質合用。包含于復方中的這類藥的劑量和濃度可依賴很多因子而發生變動，這些因子包括預計的用途、病人的體重和年齡以及給藥途徑。預示的劑量可以根據動物測試而確定，對于人服用的劑量范圍可按照本專業領域一般所接受的實踐來進行。記住以上的描述，典型的flt3-L的劑量范圍約為每平方米10微克至1000微克。較好的劑量范圍為每平方米100微克至300微克。
除了以上所述，下面給出實施例做具體說明，并且不限于本發明范圍。
實施例1Flt3-受體Fc融合蛋白的制備本實施例描述了小鼠flt3的cDNA的克隆，以及用于檢測編碼flt3-L的cDNA克隆的編碼可溶性的鼠flt3-受體Fc融合蛋白的表達載體的構建。通過使用寡聚核苷酸引物和Lyman等(Oncogene 8815—822，1993)所描述的方法由小鼠的T細胞進行了flt3 cDNA的聚合酶鏈式反應(PCR)克。小鼠的flt3受體的cDNA序列和編碼的氨基酸順序由Rosnet等提出(Oncogene，61641—1650，1991)。小鼠的flt3蛋白質含有一個542個氨基酸的細胞外區域，一個21個氨基酸的跨膜區域和一個437個氨基酸的細胞質區域。
在將鼠的flt3的cDNA融合至編碼人的IgG1分子的Fc部分的N-末端之前，擴增的鼠flt3 cDNA片段先插入至pCAV/NOT的Asp718-NotI位點(其描述見PCT應用WO 90/05183)。編碼一條單鏈多肽(該多肽含有人的IgG1拉體的Fc區域)的DNA被克隆至pBLUESCRIPT SK載體的SpeI位點，該載體可購自Stratagene克隆系統，La Jolla，California。這個質粒載體可在大腸桿菌內復制并含有一個包括21個單一限制酶切位點的多聚合接頭片段。一個單一的Bgl II位點被引入至所插入的Fc編碼序列的5′端附近，從而使Bgl II位點包含了Fc多肽的氨基酸的密碼3和4。
被編碼的Fc多肽從N-未端絞鏈區域延伸至天然的C-末端，即是一個基本上全長抗體Fc區域。Fc區域的片段，例如那些C-末端縮短的片段，也可以被使用。這些片段最好含有多個半胱氨酸殘基(至少半胱氨酸殘基位于絞鏈反應中)以允許兩個分離的flt3Fc融合蛋白在兩個Fc多肽部分之間形成鏈間的二硫鍵，形成如以上所討論的二聚物。
一個Asp 718限制性內切酶酶切位點被引入flt3編碼區域的上游。鼠flt3的cDNA的一個Asp718-NcotI片段(包括全部的細胞外區域，跨膜區域和胞漿區域的一小部分)被分離。以上所描述的Asp718-NcoI flt3的部分cDNA被克隆至含有Fc的cDNA的pBLUESCRIPT SK載體中，以使flt3的cDNA位于Fc的cDNA的上游。通過基因融合所得的單鏈DNA以Kunkel(Proc.Natl.A-cad.Sci.USA 82488，1985)和Kunkel等(Methods in Enzymol.154367，1987)所描述的方法進行突變，以更好地將flt3的全部細胞外區域融合至Fc序列。突變的DNA經測序后以證實適當的核苷酸已被移去(即跨膜區域和部分細胞質區域被缺失)，并且flt3和Fc序列在同一閱讀框內。融合的cDNA然后被剪切并插入至哺乳動物表達載體sfHAV-EO409，此載體用SalI—NcoI消化，而且SalI和Asp718位點被填平。sfHAV-EO載體(也作pDC406)見于McMa-han等(EMBO J.，10；No.102821—2832，1991)的描述。
flt3Fc融合蛋白最好在重組體哺乳動物細胞培養物中被合成。含有flt3Fc融合的表達載體被轉化入CV-1細胞(ATCC CCL70)和COS-7細胞(ATCC CRT 1651)，都來自于猴腎。flt3Fc的表達水平在CV-1和COS-7細胞中較低。因此，對在293細胞(轉化的初級人胚胎腎細胞，ATCC CRL 1573)中的表達也進行了嘗試。
用sfHAV-EO/flt3Fc載體轉染的293細胞被培養于旋轉瓶中以允許融合蛋白質的瞬間表達，它可通過flt3的信號肽而分泌入細胞培養基中。融合蛋白在蛋白質A瓊脂糖柱上純化，洗脫并且用于篩選具結合flt3Fc能力的細胞如實施例2和3所述。
實施例2篩選對flt3Fc結合細胞大約100種不同的初級細胞和細胞素歸入以下的范疇初級鼠胎腦細胞，鼠胎肝細胞系，大鼠的胎腦細胞系，人肺癌(成纖維細胞樣的)細胞系，人和鼠骨髓和淋巴細胞系被用于fh3∶Fc結合的檢測。細胞系與flt3∶Fc孵育，然后加以生物素化的抗人Fc抗體，然后再加入(Streptavidin)鏈霉抗生物素蛋白-藻紅蛋白(BectanDickinson)。生物素化的抗體購自Jackon lmmunoresearch實驗室。鏈霉抗生物素蛋白結合至吸附有抗人Fc抗體的生物素分子，抗人Fc抗體再依次結合至flt3∶Fc融合蛋白的Fc部分。藻紅蛋白是一種有熒光的藻膽蛋白，可作為檢測的標記。通過使用一種FASScam流式細胞計來測定每種細胞類型的熒光信號水平。被認為是flt3∶Fc結合陽性的細胞被鑒定出來。
實施例3flt3的cDNA從鼠T細胞cDNA庫中分離和克隆細胞系P7B-0.3A4的一種鼠T細胞cDNA文庫被選作為flt3-L的cDNA的可能來源。P7B—0.3A4是一種鼠的T細胞克隆即胸腺嘧啶1.2陽性，CD4陰性，CD8陰性，TCRab陰性/陽性，CD44陽性。它起初在rHulL-7和固定化的抗CD3 MAb存在的條件下被以0.33細胞穴的密度克隆，并在超過1年的連續培養中生長，在含有15納克/ml rHulL—7的培養基中每星期傳代一次。親本細胞來自用懸于不完全弗氏助劑中的50nmol PLP 139—151多肽和100微克肺結核分支桿菌H37Ra免疫的SJL/J小鼠的淋巴結細胞。PLP是中央神經系統的髓磷脂的脂蛋白的蛋白組分。以前所示的由139-151氨基酸組成的多肽是在實驗的自動免疫腦脊髓炎(EAE的腦源多肽，一種在SJL/J小鼠中多發硬化癥小鼠模型(Touhy，V.K.，Z.Lu，R.A.Sobel，R.A.Lauren和M.B.Lees；1989.SJL鼠髓磷脂脂蛋白蛋白的腦源決定子的鑒定J Immunol 1421523)。在抗原存在的情況下經過起始培養之后，來自PLP7的親本細胞系，在進行克隆前已經與rHulL—7(及不含抗原)進行了超過6個月的連續培養。
P7B—0.3A4的增殖只有在對很高濃度的PLP139-151多肽應答時(存在有照射過的同源的脾細胞)才發生，并且是腦源的或同種反應性的。此克隆在對固定化的抗CD3 MAb，IL-2和IL-7應答而增殖，但對IL-4不會因應答增殖。
flt3∶Fc的結合可在鼠的T細胞和人的T細胞中觀察到，因而一種鼠的T細胞(0.3A4)因其易于生長而被選擇。如McMaham等(EMBO J.，10No.102821-2832，1991)所述的方法制備了在sfHAV-EO中的鼠的0.3A4的cDNA庫。sfHAV-EO是一種也能在大腸桿菌中復制的哺乳動物表達載體。sfHAV-EO包含由SV40而來的復制起始區，非洲淋巴瘤病毒和pBR322，并且是如Dower等(J.Immunol.1424314，1989)所述的HAV-EO的衍生物。sfHAV-EO與HAV-EO的區別在于HAV-EO中腺病毒2三部分的前導序列中的內含子缺失了。簡短地說，通過使用與Haymerle等(Nucl.Acids Res.148615，1986)所述的相似的連接順序的方法將T細胞cDNA克隆至sfHAV-EO的SalI位點，使用了以下的一對寡聚核苷酸連接順序SEQ ID NO35′TCGACTGGAACGAGACGACCTGCT3′SEQ ID NO43′GACCTTGCTCTGCTGGACGA5′通過基本如Gubler和Hoffman(Gene，25263-269，1983)的方法從0.3A4聚(A+)RNA制備了雙鏈、平頭末端、隨機引物的cDNA，使用了Pharmacia DNA試劑盒。上述的連接順序加入至cD-NA，上述的連接順序加入至cDNA中如Haymerle等所述。通過在65℃過Sephacryl S—1000柱來移去低分子量物質，并且cDNA被連接至sfHAV-EO410，該載體已預先被SalI酶切并被連接至同樣的寡聚核苷酸對上。此載體被標示為sfHAV-EO410。DNA被電激進入大腸桿菌DH10B(Dower等，Nucleic Acicls Res.，6127—6145，1988)，在37℃培養1小時后，轉化細胞被凍存在含有20％甘油的1毫升SOC培養其中(Hanaham等，J.Mol.Biol，166557—580，1983)。取一份用于測定氨芐青霉素抗性克隆的數目。所得的0.3A4庫含有1.84百萬個克隆。
用在sfHAV-EO中的cDNA庫轉化大腸桿菌DH10B菌株，每平板大約可得到1600克隆。從每個平板中挖下菌落，合并一起，并從每個合并的菌中制備質粒DNA。通過使用DEAE-葡聚糖，然后再以氯奎處理，大約1600合并的菌落的DNA被用來轉染一個含有亞匯合的CV-1/EBNA-1細胞層。與Luthman等(Nucl.Acids.Res，111295，1983)和McCutchan等(J.Natl.Cancer Inst，41351，1986)所描述的方法相類似。CV-1/EBNA-1細胞系(ATCC CRL10478)組成型地表達EBV核抗原由CMC的最早期增強子/啟動子帶動。如McMahan等所述(EMBOJ，102821，1991)，CV1-EB-VA-1來自于非洲綠猴腎細胞系CV-1(ATCC CCL70)。
為了用cDNA庫轉化CV-1/EBNA-1細胞，細胞被維持完全培養基(Dulbecco的改良的Eagle培養基DMEM)，含有10％(v/v)胎牛血清(FCS)，50單位/ml青霉素，50單位/ml鏈霉素，2mM L-谷氨酰胺)以大約2×105個細胞/穴的密庫涂于單穴的有室載玻片上(Lab-Tek)。載片先用1ml溶于PBS中的10mg/ml的人粘連蛋白預處理30分鐘，然后用PBS洗一次。培養基從粘附著的細胞層上移去后，用含有66.6μM硫酸氯奎的1.5ml完全培養基代替。然后將十分之二毫升的DNA溶液(2微克DNA，0.5毫克/毫升DEAE-葡聚糖于含有氯奎的完全培養基中)加于細胞中并孵育5小時。在孵育之后，移去培養基，并通過添加含有10％DMSO的完全培養基來休克細胞2.5至20分鐘，然后再用新鮮的完全培養基來替換此溶液。培養細胞2—3天以使插入序列瞬間表達。
被轉染的CV-1/EBNA-1的細胞單層通過基本如Gearing等(EMBO J83667，1989)所述的玻片放射自顯影法來檢測flt3-L的表達。被轉染的CV-1/EBNA-1(粘附在有室的載玻片上)用含有脫脂奶粉(BM-NFDM)的結合培養基洗一次(RPM1培養基1640包含25mg/ml小牛血清白蛋白(BSA)，2mg/ml疊氮化鈉，20mM HEP-ES，pH7.2和50毫克/毫升脫脂奶粉)。然后細胞與在BM-NFDM中的flt3∶Fc在室溫下孵育1小時。在孵育后，在有室載玻片中的單層細胞用BM-NFDM洗滌三次以移去未結合的flt3∶Fc融合蛋白，然后與40ng/ml125I-鼠抗人Fc抗體(見以下描述)(1∶50稀釋)在室溫下孵育1小時。細胞用BM-NFDM洗滌三次，然后用磷酸-鹽緩沖溶液洗滌2次來移去未結合的125I-鼠抗人Fc抗體。細胞通過與溶于PBS中的2.5％戊二酸pH7.3在室溫下孵育30分鐘而被固定，在PBS中洗2次，空氣干燥。含有細胞的有室載玻片在磷影像儀(Molecular Dynamics)上暴露過夜，然后浸于Kodak GYNB-2照相乳膠液(在水中6倍稀釋)并于暗盒中在4℃曝光3—5天。然后將載玻片在Kodak D19顯影液中(40克/500毫升水)顯影大約4分鐘，用水漂洗后在Agfa G433C固定液中固定。用25—40倍放大倍數的顯微鏡單獨鏡檢每個載玻片，通過在光背景下有放射自顯影的銀顆粒的存在來鑒定表達flt3-L的陽性細胞。
鼠抗人Fc抗體來自于Jackson實驗室。這個抗體顯示了對結合在Fcr受體上的Fc蛋白質的最小結合。此抗體用氯胺T方法來標記。簡短地說，按照廠商說明來制備一個葡聚糖G-25柱。用含有1％牛血清白蛋白的10柱體積的PBS來預處理柱以減少抗體對柱和樹脂的非專一性吸附。用不含牛血清白蛋白的5倍體積的PBS洗滌，以從柱中去作非結合牛血清白蛋白。在一試管中，分別加入10微克抗體(溶解于10微升PBS中)，50微升50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.2)，和2.0mCi無攜帶劑的Na125I，將溶液混合均勻。然后加入15微升新制備的氯胺-T溶液(2mg/ml于磷酸鈉緩沖液(pH)7.2)中)，將混合物在室溫下孵育30分鐘，再立刻將混合物加至葡聚糖G-25柱上。然后通過收集100—125微升一部分的洗脫液，放射性標記的抗體被從柱中洗脫下來。將牛血清白蛋白加至含有放射性標記抗體的洗脫物中，終濃度為1％。放射碘化作用產生的比活性在5—10×1015cpm/mmol蛋白質范圍。
通過使用載玻片放射自顯影法，大約1,600個cDNA庫中的1,840,000個cDNA被檢測，直到一個轉染子庫的檢測清楚表明了對flt3∶Fc結合的明顯陽性。這個庫然后被分隔成500個庫，再通過載玻片經過放射自顯影檢測，鑒定到一個陽性庫。這個庫再被分隔成100個庫，并再次進行篩選。這個庫中的100個單個群落被檢測，直到鑒定出一個克隆(克隆#6C)，它指導帶有flt3Fc結合活力的表面蛋白的合成。分離出這個克隆，對其0.88kb的插入cDNA測了序。
克隆#6C的鼠flt3-配體cDNA的編碼區域的核苷酸和編碼的氨基酸順序見SEQ ID NOs1和2。插入cDNA的長度為0.88kb。在此序列內的開放閱讀框架可編碼一個231個氨基酸的蛋白質。231個氨基酸開放閱讀框架的DNA和編碼的氨基酸順序見SEQ IDNOs1和2。SEQ ID NO2的蛋白質是I型跨膜蛋白，它帶有一個N-末端的信號肽(1至27氨基酸)，一個細胞外區域(28至188氨基權)，一個跨膜區域(氨基酸189至211)和肥漿區域(212至231氨基酸)。緊接信號順序裂解位點的天然蛋白質的預計分子量為23,164道爾頓。成熟蛋白質具有一個9.372的計算的pI。在編碼區域兩側，有56堿基的5′非編碼區和126堿基的3′非編碼區，包括添加的cD-NA連接順序。上述的克隆過程也產生了一個鼠flt3配體克隆#5H，它從SEQ ID NO1中的核苷酸49至545(對應的氨基酸為163)與#6C克隆全同。從那個位點向上，#5H克隆完全不同，代表了另一個剪接結構。
在大腸桿菌中含有flt3-L的cDNA的sfHAV-EO410載體被于1993年3月20日保存于American Type Culture Collection，Rockville，MD，USA，并且接受號為ATCC 69286。保存物是按照布達配斯談判的條款做的。
實施例4編碼人的flt3-L的cDNA的克隆一個編碼人flt3-L的cDNA被從人克隆22T細胞λgt10隨機引物合成的cDNA庫中克隆出，按Sim等(PNAS，868946—8950，1989)所描述的片斷。cDNA庫用與鼠flt3-L(SEQ ID NO1的核苷酸103至516)的細胞外區域相對應的41 3堿基對的Ple I片段來篩選。片段是隨機引物合成的，并在寡聚預雜交緩沖液中與cDNA庫濾膜在55℃雜交過夜。此片段然后在2×SSC/0.1％SDS中于55℃洗滌1小時，然后于1×SSC/0.1％SDS中1小時及0.5×SSC/0.1％SSC中洗滌1小時。抽提陽性噬菌斑中的DNA，用對噬菌體臂專一的寡核苷酸通過PCR法來擴增插入的DNA。擴增的DNA被測序，克隆#9的序列見SEQ ID NO5。通過如以上所描述的用含有與SEQ ID NO1的核苷酸128至541基本對應的cDNA序列的鼠克隆#5H的cDNA的細胞外區域的一個片段來檢測cDNA庫，由相同的λgt10隨機引物cDNA庫分離了另外一個人flt3-L cDNA。
克隆#9 988堿基對的cDNA的測序表明一個705堿基對的開放閱讀框架被一個29堿基對的5′非編碼區和一個250堿基的3′非編碼區包圍。3′非編碼區不含多聚A尾巴。在起始蛋氨酸的上游沒有符合框的終止密碼子。開放閱讀框架編碼一個如順序SEQ IDNO6中氨基酸1至235所示的235個氨基酸的I型跨膜蛋白。蛋白質含有一個26或27個氨基酸的信號肽。有個較大的可能性是N-末端信號肽在長度上是26個氨基酸而不是27個氨基酸。緊跟信號肽的是一個156或155個氨基酸的細胞外區域(分別對于26或27個氨基酸的信號肽來說)；一個23個氨基酸的跨膜區域和一個30個氨基酸的胞漿區域。人flt3-L與鼠flt3-L有72％的氨基酸同一性和78％的氨基酸相似性。包含克隆#9的人flt3-L的cDNA的載體pBLUESCRIPT SK(—)被于1993年8月6日保存至AmericanType Culture Collection，Rockville，Maryland，USA(ATCC)，并且接受號為ATCC 69382。保存物是按照布達配斯談判條款制做的。
實施例5flt3-L在酵母中的表達為了在酵母中表達可溶性的flt3-L，人工合成的寡聚核苷酸引物被用于通過PCR(Mullis和Faloona，Meth.Enzymol.155335—350，1987)來擴增信號肽末端和跨膜區域起始點之間的flt3-L的完整細胞外編碼區域。5′引物(5′-AATTGGTACCTTTGGATAAAAGAGACTACAAGGACGACGATGACAAGACACCTGACTGTTACTTCAGCCAG-3′)SEQ ID NO7編碼了α因子先導順序和一部分和一個抗原性八肽，以符號框方式與預計的成熟的flt3-L的N-末端融合的FLAG序列。3′寡聚核苷酸(5′-ATATGGATC-CCTACTGCCTGGGCCGAGGCTCTGGGAG-3′)SEQ ID NO8產生了一個谷氨酰胺-189之后的終止密碼子，正好位于推測的跨膜區域。PCR產生的DNA被連接至酵母表達載體(為了在K.lactis中表達)，該載體可指導將重組產物分泌至酵母培養基中(Fleer等，gene，107285—195，1991；和Van der Berg等，Bio/Technology，8135—139，1990)。用如前述的親和層析法從酵母液體培養基中純化出FLAGflt3-L融合蛋白質(Hopp等，Bio/Technology，61204—1210，1988)
實施例6flt3-L的單克隆抗體本實施例說明制備flt3-L的單克隆抗體的方法。flt3-L在哺乳動物宿主細胞如COS-7或CV-1/EBNA-1細胞中表達并用flt3Fc親和層析法純化。純化的flt3-L，一個如細胞外區域的片段，人工合成的多肽或表達flt3-L的細胞可用于通過傳統方法來產生對flt3-L的克隆抗體，例如于美國專利第4,411,993號所描述的技術。簡短地說，鼠用flt3-L免疫，flt3-L于完全Freund輔劑中乳化用做免疫抗原存在，并以10—100微克的數量范圍皮下或腹腔內注射。10—12天后，免疫過的鼠用另一份于完全Ferund輔劑中乳化的flt3-L強化。以后鼠周期性地按一周至二周的免疫程序加強。定期則眶后放血或尾尖切傷取出血清樣品以檢測flt3-L的抗體，檢測方法可用斑點檢測。ELISA(酶聯免疫吸附劑檢測)法或flt3結合的抑制法。
在測定了一個抗體的效價之后，用flt3-L的鹽溶液最后一次靜脈注射陽性動物。3至4天后，殺死動物，收集脾臟細胞。并且脾細胞被融合至一促鼠骨髓瘤細胞系，如NS1或更佳的為P3×63Ag8.653(ATCC CRL1580)。融合會產生雜交瘤細胞，將其置于含有HAT(次黃嘌呤、氨基喋呤、胸腺苷)篩選培養基的多個微效價平板上以抑制非融合細胞、骨髓瘤雜交細胞和脾細胞雜交細胞的增殖。
通過改進的Engvall等(Immunochem，8871，1971和美國專利第4,703,004號)所揭示的技術，以測定對純化的flt3-L的反應活力的ELISA法來檢測雜交瘤細胞。一個較好的檢測方法是如Beck-mam等(J.Immunol.1444212，1990)所述的抗體捕捉技術。陽性雜交瘤細胞可被通過腹膜內注射進同源的BALB/C鼠，以產生含高濃度的抗flt3-L單克隆抗體的腹水。或者，雜交瘤細胞可在體外以各種不同的方法在三角瓶或旋轉瓶中生長。在鼠腹水內產生的單克隆抗體可通過硫酸銨沉淀，然后再通過凝膠排阻層析來純化。同樣地，也可使用基于抗體與蛋白質A或蛋白質B結合的親和層析，如同基于同flt3-L結合的親和層析。
實施例7flt3-L單獨或與IL-7或IL-3聯合使用本實施例展示了通過含有flt3-L和IL-7的復方對AA4.1陽性胎兒肝細胞的促進和增殖；以及通過含有flt3-L和IL-3的復方對C-Kit陽性(C-Kit+)細胞的促進和增殖。
AA4.1-陽性(AA4.1+)表達細胞通過在Optilux100毫米塑料培養皿(Falcon NO.1001，Dxnard，CA)中的細胞平移，從14天C57BL/6鼠胎肝中被分離。平板在PBS中4℃被包被過夜，PBS中加有1％含有10微克/毫升AA4.1抗體(McKeran等，J.Im-munol.，132332—339，1984)的胎兒牛血清(FBS)，然后在使用前用加有1％FBS的PBS洗滌干凈。肝細胞的單細胞懸浮液以107細胞/皿的密度加入附加1％FBS的PBS中，然后在4℃使粘附到平板上2小時。然后仔細洗滌平板，通過刮取來收集粘附的細胞，以進行分析或在以下所描述的血細胞生成檢測中進一步使用。通過使用AA4.1抗體的FACS分析證明了有一個大于95％AA4.1+的細胞群體。
C-kit+多能性干細胞被從成年鼠骨髓中純化(de Vries等，J.Exp.Med.1761503—1509，1992；和Visser和de Vries，Methdsin Cell Biol.，1993)。對外源凝集素小麥胚凝集素陽性和對被B220識別的抗原陰性的低密度細胞(≤1.078克/cm3)和15—1.4.1(Visser等，Meth，in Cell Biol.，33451—468，1990)單克隆抗體，通過使用生物素化的Steer因子可被分成表達和不表達C-kit的細胞亞群。C-kit+部分已被證明含有多能性造血干細胞(de Vries等，Science 255989—991，1992；Visser和de Vries，Metheds in CellBiol.，1993；和Ware等，1993已投稿)。
AA4.1+胎兒肝細胞被培養在重組的100納克/毫升的IL-7(美國專利第4,965,195號)和培養在重組的250納克/毫升的fh3-L中。在實驗中flt3-L被以三個不同的形式使用(1)以存在于固定的，flt3-L轉染的CV1/EBNA細胞上的形式；(2)作為來自這些相同的flt3-L轉染的CV1/EBNA細胞和濃縮的培養上清液；和(3)作為從如實施例5所描述的上清液中純化和分離的多肽制劑。血細胞生成檢測C-kit+干細胞、胎兒肝AA4.1+細胞的增殖通過基本如de Vries等(J.Exp.Med.，1731205－1211，1991)所述的[3H]-胸腺苷參入檢測方法來進行檢測。純化的C-kit+干細胞在37℃，于一空氣中含有6.5％二氧化碳和7％氧氣的完全濕潤環境中培養96小時。鼠的重組IL-3以100納克/毫升的終濃度來使用。然后，細胞用每穴2μCi的[3H]-胸腺苷脈沖(81Ci/mmol；Amershan.Corp.，Arling-ton Heights，IL)標記并且再孵育24小時。AA4.1+細胞(大約20，000細胞/穴)在IL-7，flt3-L和flt3-L＋IL-7中孵育48小時。然后用[3H]-胸腺苷脈沖標記6小時。所得到的flt3-L和IL-7結果見表I，所得的flt3-L和IL-3結果見表II。
表Iflt3-L和IL-7對AA4.1+胎兒肝細胞增殖的影響對照 flt3-L IL-7flt3-L＋IL-7[3H]-胸腺苷 10010001004200參入(CPM)flt3-L和IL-7合用產生的反應大約超過單獨使用flt3-L時的四倍和超過單獨使用IL-7時的大約40倍。
表IIflt3-L和IL-3對C-kit+細胞增殖的影響對照(單獨載體) flt3-LIL-3flt3-L＋IL-3[3H]-胸腺苷 10001800 3000 9100參入(CPM)用flt3-L的cDNA轉化的CV1/EBNA細胞的培養上清液較用單獨表達載體轉染的CV1/EBNA細胞的培養上清液在促進C-kit+的增殖上大約高出18倍。含有flt3-L的上清液中添加IL-3表現出了協同作用，所觀察的增殖強度在約兩倍于如果其作用是相加的結果。
實施例8flt3-L∶Fc融合蛋白的構建本實施例描述一種含有flt3-L的細胞外區域和人免疫球蛋白的Fc區域的融合蛋白的構建方法。其方法基本上類似于實施例1中所描述的flt3-L∶Fc融合蛋白的構建。
在將flt3-L的cDNA融合至編碼人IgG1分子的Fc部分的cD-NA的N-末端前，flt3-L的cDNA片段被插入至pCAV/NOT的Asp718—NcotI位點，其描述見PCT應用WO 90/05183。編碼含有人IgG1抗體的Fc區域的一條單鏈多肽的DNA被克隆至pBLUE-SCRIPT SK載體的SpeI位點，該載體可購自Stratagene克隆系統，La，Jolla，California。這個質粒載體可在大腸桿菌內復制并含有一個包括21個單一限制酶切位點的多接頭片段。一個單一的Bgl II位點被引入至所插入的編碼序列的5′端附近，從而使Bgl II位點包含了Fc多肽的第3和第4氨基酸的密碼子。
被編碼的Fc多肽從N-末端絞鏈區域延伸至天然的C-末端，即基本上是一個全長抗體Fc區域。Fc區域的片段，例如那些C-末端被縮短的片段，也可以被使用。這些片段最好含有多個半胱氨酸殘基(至少半胱氨酸殘基位于絞鏈反應中)以允許對于兩個分離的flt3∶Fc融合蛋白在兩個Fc多肽部分之間可形成鏈間的二硫鍵，從而形成二聚物。
一個pCAV/NOT中flt3-L的Asp718—StuI部分cDNA可被克隆至含有Fc的cDNA的pBLUESCR1PT SK載體的Asp710—SpeI位點，以使flt3-LDNA位于Fc cDNA的上游。由基因融合所得的單鏈DNA以Kunkel(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488，1985)和Kunkel(等Methods in Enzymol 154367，1987)所描述的方法進行突變，以完善地將flt3的全部細胞外區域融合至Fc序列。突變的DNA經測序膈以證實適當的核苷酸已被移去(即跨膜區域和部分的胞漿區域被缺失)，并且flt3-L和Fc序列在同一閱讀框內。融合的cDNA然后被剪切并通過傳統方法插入至哺乳動物表達載體pCAV/NOT，此載體用Asp718/NOT消化。
flt3-LFc融合蛋白最好在重組體哺乳動物細胞培養物中被合成。含有flt3-LFc融合物的表達載體被轉染入CV-1細胞(ATCCCCL70)或COS-7細胞(ATCC CRL 1651)。在293細胞(轉化的初級人胚胎腎細胞，ATCC CRL1573)中表達也是可能的。
用pCAV/NOT/flt3-LFc載體轉染的293細胞被培養在旋轉的瓶中以允許融合蛋白的瞬間表達，它可通過flt3-L的信號肽而分泌入細胞培養基中，融合蛋白可在蛋白質A瓊酯糖柱上純化。
實施例9過量表達flt3-L的轉基因鼠的產生本實施例描述一種用于產生過量表達flt3-L的轉基因鼠的方法。研究過量表達flt3-L的鼠以確定過量表達的生物學影響。按照如Gordan等(science 2141244—1246，1981)所描述的方法將flt3-L DNA微注射進鼠(B16/J)原核。一般地，具有可見的原核的鼠受精卵首先被放在注射室內并用一根小吸管固定，然后用注射吸管將編碼flt3-L的基因少射入卵的原核。受精卵然后(i)被轉移入一個假孕0.5天的母鼠的輸卵管中或(ii)在體外培養至二細胞階段(過夜)并被轉移入一個假孕0.5天的母鼠的輸卵管中或(iii)體外培養至胚泡階段，再被轉輸入一個假孕2.5天的母鼠的子宮中。較佳地，前2個方法的任一個由于避免了長時間的體外培養而可使用，并且更佳地，應當轉移大約20—30個微注射過的受精卵以避免產生小的同窩仔。
實施例10flt3-L促進脾臟中紅血細胞增殖本實施例描述了在轉基因鼠中flt3-L對脾臟紅血細胞中產生的影響。軒基因鼠的產生按照實施例9中的方法。殺死鼠并將每一個完整的脾臟制成單細胞懸浮液。懸浮細胞被離心后再重懸于含有PBS和1％胎兒牛血清的10毫升培養基中。通過用血球計數板進行細胞計數。按照以下的公式，用臺盼藍染色法對每個樣品進行細胞計數以獲得每毫升培養基中的活細胞總數，公式為(RBC＋WBC)/ml，其中RBC是紅細胞的細胞數，WBC是白細胞的細胞數。然后用Turk染色對每個樣品計數以獲得每毫升培養基中白細胞總數。每個樣品的每毫升培養基中紅細胞總數的計算通過以每毫升的活細胞總數減去每毫升中白細胞的總數來進行。結果崢以下表III。
表III在flt3-L過量表達的轉基因鼠脾臟中血紅細胞的增殖鼠 活細胞總數 白細胞總數 紅細胞總數(百萬細胞/毫升)(百萬細胞/毫升)(百萬細胞/毫升)對照1 29.7 27 2.7對照2 3124.6 6.4轉基因144.7 25.6 19.1轉基因237.3 28.4 8.9
從表III中的數據可見，每毫升中白細胞數與對照鼠大體相同。但是，由2個轉基因鼠脾臟得到的紅細胞數大體為對照鼠中所觀察到的2－3倍。flt3-L促進了紅血球譜系細胞的增加，可能通過促進紅血球祖代細胞，通過促進產生促紅細胞生成蛋白的細胞，或阻斷了限制紅細胞中生成作用的機制。
實施例11flt3-L促進T細胞和早期B細胞的增殖從按照實施例10所獲得的9周的轉基因鼠所獲得的骨髓用于篩選各種T細胞和B細胞表型標記的存在，其檢測通過使用能與這些標記發生免疫反應的抗體。檢測了以下標記B220標記，它對B細胞譜系是專一的；對成熟B細胞專一的表面IgM標記(sIgM)；是一種早期B細胞標記的S7(CD43)標記；是活化的T細胞和B細胞的一種標記的干細胞抗原-1(SCA-1)標記；是輔助T細胞和某些干細胞的一種標記的CD4；對巨噬細胞專一的Mac-1標記，通過使用眾所周知)的對這些標記的抗體進行篩選。下面的表IV顯示了從骨髓篩選中所獲得的數據。對由同一窩幼仔，得到的2只轉基因鼠進行了分析以來自于同一窩的一正常鼠做對照(對照1)和另一無關的正常鼠做對照(對照2)。
表IV轉基因鼠中flt3-L過量表達的影響標記無關對照同窩鼠轉基因#1 轉基因#2對照B220 30.64 27.17 45.84 48.78sIgM 3.542.41 1.941.14S7(CD43) 54.43 45.44 46.11 50.59SCA-110.92 11.74 19.45 27.37
CD4 6.94 8.72 12.21 14.05Mac-136.8027.15 21.39 18.63上述數據表明鼠中flt3-L的過量表達導致了B細胞數目的增加，如B220+細胞和SCA-1+細胞的增加所示。B220+細胞的FACS分析表明proB細胞(HSA-，ST+)的增加。CD4+細胞的增加表明了T細胞和干細胞大約增加2倍。這些數據表明flt3-L增加了具有T細胞、干細胞或早期B細胞表型的細胞，但不促進成熟B細胞或巨噬細胞的增加。實施例12對過量表達flt3-L鼠胸腺的分析本實施例描述了從按照實施例10所得的轉基因鼠胸腺的分析。6個成年鼠，每個約有3個月年齡，被殺死后取出每只鼠的胸腺并制備單細胞懸浮液。
FACS分析表明在現有的細胞總數中沒有變化并且通過使用一些標記證明，鼠胸腺細胞的成熟比例上沒有改變，這些標記有CD4vs.CD8；CD3vs.αβTCR(T細胞受體)；和CD3vs.γδTCR(細胞受體)。但是，在確定的細胞類型CD4-和CD8-分隔室中(即與發育有關的早期細胞；它們代表了全部胸腺細胞的2％—3％)中出現了變化。特別地，在胸腺發育三個階段的CD4-和CD8-細胞。階段1代表具有Pg-1++，HSA+和IL-2受體陰性(“IL-2R”)的細胞。在階段1后，胸腺發育至含有具有Pgp-1+，HSA++，和IL-2R++標記的細胞的階段2，然后為階段3，其特征為細胞具有Pgp-1+/-，HSA++，和IL-2R-標記。轉基因鼠中處于階段2的胸腺細胞減少了50％，同時階段3的細胞群都成正比地增加。這些數據表明flt3-L促進胸腺細胞從階段2至階段3的發育，表明flt3-L對早期細胞有活性。
實施例13flt3-L在外周干細胞移植中的應用本實施例描述了一種使用flt3-L在自體外周干細胞(PSC)或外周血祖代細胞(PBPC)移植的方法。典型地，PBPC和PSC移植對一些病人施用，這些病人的骨髓由于，例如，骨髓異常或惡性腫瘤而不適于收集。
在收集細胞前，可能希望動員或增加循環著的PBPC和PSC的數目。動員可提高PBPC和PSC收集，這可通過在收集這些細胞前給病人靜脈的注射flt3-L達到。其他生長因子如CSF-1，GM-CSF，SF，G-CSF，EPO，IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，GM-CSF/IL-3融合蛋白，LIF，FGF和這些因子的合用可以與flt3-L順序使用或同時合用。通過使用本專業已知的apheresis方法來收集被動員的或非被動員的PBPC和PSC細胞。例如見Bishop等，Blood，Vol.83，NO.2，PP.610一616，1994。簡短地說，PBPC和PSC可通過傳統設備來收集，例如一種Haemonetics型號V50apheresis裝置(Haemonet-ics，Braintree，MA)。典型的為每周至少5次的四小時收集直至收集到大約6.5×108單核細胞(MNC)/公斤病人。收集的PBPC和PSC取樣用于檢測粒性白細胞-巨噬細胞集落形成單位(CFU-GM)的量，其檢測通過用不含鈣和鎂的Hank平衡鹽溶液(HBSS)來大體以1∶6稀釋并且于淋巴瘤分離培養基(Organon Tekuika，Durham，North Carolina)上涂薄層而進行。離心后，收集界面上的MNC，用HBSS洗滌后重懸于HBSS中。1毫升一份溶液包含大體300，000MNC，改良的McCoy 5A培養基，0.3％瓊脂，200單位/毫升重組人GM-CSF，200u/ml重組人IL-3，200u/ml重組人G-CSF，于37℃，5％CO2，完全濕潤空氣中培養14天。任選地，flt3-L或GM-CSF/IL-3融合分子(PIXY321)可加于培養物中。這些培養物通過賴氏染劑染色，并且，CFU-GM集落可通過解剖顯微鏡來記錄(Ward等，Exp，Hematol.，16358，1988)。或者，CFU-GM可通過使用CD34/CD33流式細胞光度方法來檢測，崢siena等(Blood，Vol77，NO.2，PP400—409，1991)或本專業中其它的已知方法。
包含CFU-GM的培養物在一控制速度的冷凍器中凍牢(如CryoMed，Mt.Clemens，MI)，然后儲存在于液氮的汽相中。10％的二甲基亞楓可用做低溫保護劑。在從病人處的所有收集完成后，包含CFU-GM的培養物被解凍并合在一道。解凍的細胞收集物可以或是重新靜脈輸入病人或在重輸入前進行體外擴展，合并的細胞和體外擴展可以在使用flt3-L作為生長因子(單獨使用、順序使用或與以上所列的細胞素結合使用)來完成。這類體外擴展法在本專業中是熟知的。擴展或未擴展的細胞被重新靜脈輸入回病人。為便于移植細胞移入，flt3-L在重輸入時同時或稍后注入。flt3-L的注入在單獨、順序或與以上所列的細胞素結合使用的情況下進行。
實施例14用flt3-L純化造血祖代細胞和干細胞本實施例描述從含有細胞混合物的懸浮液中純化造血祖代細胞和干細胞的方法。通過常規方法收集骨髓和外周血液的細胞。將細胞懸浮于標準培養基并離心除去紅細胞和中性白細胞。位于兩相之間界面的細胞(在本專業中已知為淡黃色)被分離并重新懸浮。這些細胞主要是單核并且代表了絕大部分的早期造血祖代細胞和干細胞。所得的細胞懸浮液然后與生物素化的flt3-L孵育足夠長的時間以允許flt3∶flt3-L的相互作用。典型地，至少1小時的孵育時間是足夠的。孵育后，細胞懸浮液在重力條件下，經過用抗生物素蛋白包被的珠充塞的柱。這類柱在本專業中是熟知的，見Brernson等，J，CellBiochem.，10D239，1986.用PBS洗滌柱以除去未結合的材料。可能用常規方法使靶細胞從珠及flt3-L上釋放。
序列單(1)一般資料
(i)申請人Lymwm，Stewart DNcckmam，M.Patricia(ii)發明名稱flt3受體的配體(iii)序列數目8(iv)通信地址(A)地址Stephen L.Malaska，Immunex Corporation(B)街51 University Street(C)城市Seattle(D)州Washington(E)國家美國(F)郵編98101(v)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機Apple Macintosh(C)操作系統Macintosh 7.0.1(D)軟件Microsoft word.Version #5.1(vi)現在申請數據(A)申請號待定(B)文件日期1994年3月7日(C)分類(vii)以前申請數據(A)申請號08/162,407(B)文件日期1993年12月3日(C)分類(vii)以前申請數據(A)申請號08/111,758(B)文件日期1993年8月25日
(C)分類(vii)以前申請數據(A)申請號08/106,463(B)文件日期1993年8月12日(C)分類(vii)以前申請數據(A)申請號08/068,394(B)文件日期1 993年5月24日(C)分類(viii)代理人資料(A)姓名Malaska，Stephen L.
(B)登記號32,665(C)編號2813-D(iX)通訊資料(A)電話(206)587一0430(B)傳真(206)233-0644(C)電傳756822(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度879堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲學線狀(ii)分子類型cDNA至mRNA(iii)假設的無(iv)反義無(ix)性質
(A)名misc-feature(B)位置1..25(ix)性質(A)名misc-feature(B)位置855..879(ix)性質(A)名CDS(B)位置57..752(xi)序列描述SEQ ID NO1GTCGACTGGA ACGAGACGAC CTGCTCTGTC ACAGGCATGA GGGGTCCCCG GCAGAG 56ATG ACA GTG CTG GCG CCA GCC TGG AGC CCA AAT TCC TCC CTG TTG CTG104Met Thr Val Leu Ala Pro Ala Trp Ser Pro Asn Ser Ser Leu Leu Leu1 5 10 15CTG TTG CTG CTG CTG AGT CCT TGC CTG CGG GGG ACA CCT GAC TGT TAC152Leu Leu Leu Leu Leu Ser Pro Cys Leu Arg Gly Thr Pro Asp Cys Tyr20 25 30TTC AGC CAC AGT CCC ATC TCC TCC AAC TTC AAA GTG AAG TTT AGA GAG200Phe Ser His 5er Pro Ile Ser Ser Asn Phe Lys Val Lys Phe Arg Glu35 40 45TTG ACT GAC CAC CTG CTT AAA GAT TAC CCA GTC ACT GTG GCC GTC AAT248Leu Thr Asp His Leu Leu Lys Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Val Asn50 55 60CTT CAG GAC GAG AAG CAC TGC AAG GCC TTG TGG AGC CTC TTC CTA GCC296Leu Gln Asp Glu Lys His Cys Lys Ala Leu Trp Ser Leu Phe Leu Ala65 70 75 80CAG CGC TGG ATA GAG CAA CTG AAG ACT GTG GCA GGG TCT AAG ATG CAA344Gln Arg Trp Ile Glu Gln Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln85 90 95ACG CTT CTG GAG GAC GTC AAC ACC GAG ATA CAT TTT GTC ACC TCA TGT392Thr Leu Leu Glu Asp Val ASn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Ser Cys100 105 110ACC TTC CAG CCC CTA CCA GAA TGT CTG CGA TTC GTC CAG ACC AAC ATC 440Thr Phe Gln Pro Leu Pro Glu Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile115 120 125TCC CAC CTC CTG AAG GAC ACC TGC ACA CAG CTG CTT GCT CTG AAG CCC 488Ser His Leu Leu Lys Asp Thr Cys Thr Gln Leu Leu Ala Leu Lys Pro130 135 140TGT ATC GGG AAG GCC TGC CAG AAT TTC TCT CGG TGC CTG GAG GTG CAG 536Cys Ile Gly Lys Ala Cys Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Val Gln145 150 155 160TGC CAG CCG GAC TCC TCC ACC CTG CTG CCC CCA AGG AGT CCC ATA GCC 584Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Leu Pro Pro Arg Ser Pro Ile Ala165 170 175CTA GAA GCC ACG GAG CTC CCA GAG CCT CGG CCC AGG cAG CTG TTG CTC 632Leu Glu Ala Thr Glu Leu Pro Glu Pro Arg Pro Arg Gln Leu Leu Leu180 185 190CTG CTG CTG CTG CTG CCT CTC ACA CTG GTG CTG CTG GCA GCC GCC TGG 680Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Thr Leu Val Leu Leu Ala Ala Ala Trp195 200 205GGC CTT CGC TGG CAA AGG GCA AGA AGG AGG GGG GAG CTC CAC CCT GGG 728Gly Leu Arg Trp Gln Arg Ala Arg Arg Arg Gly Glu Leu His Pro Gly210 215 220GTG CCC CTC CCC TCC CAT CCC TAGGATTCGA GCCTTGTGCA TCGTTGACTC 779Val Pro Leu Pro Ser His Pro225230AGCCAGGGTC TTATCTCGGT TACACCTGTA ATCTCAGCCC TTGGGAGCCC AGAGCAGGAT 839TGCTGAATGG TCTGGAGCAG GTCGTCTCGT TCCAGTCGAC 879
(2)序列SEQ ID NO2資料(i)序列特征(A)長度231氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓樸學線狀(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Thr Val Leu Ala Pro Ala Trp Ser Pro Asn Ser Ser Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Leu Ser Pro Cys Leu Arg Gly Thr Pro Asp Cys Tyr20 25 30Phe Ser His Ser Pro Ile Ser Ser ASh Phe Lys Val Lys Phe Arg Glu35 40 45Leu Thr Asp His Leu Leu Lys Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Val Ash50 55 60Leu Gln Asp Glu Lys His Cys Lys Ala Leu Trp Ser Leu Phe Leu Ala65 70 75 80Gln Arg Trp Ile Glu Gln Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln85 90 95Thr Leu Leu Glu Asp Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Ser Cys100 105 110Thr Phe Gln Pro Leu Pro Glu Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile115 120 125Ser His Leu Leu Ly5 Asp Thr Cys Thr Gln Leu Leu Ala Leu Lys Pro130 135 140Cys Ile Gly Lys Ala Cys Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Val Gln145 150 155 160Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Leu Pro Pro Arg Ser Pro Ile Ala165 170 175Leu Glu Ala Thr Glu Leu Pro Glu Pro Arg Pro Arg Gln Leu Leu Leu180 185 190Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Thr Leu Val Leu Leu Ala Ala Ala Trp195 200 205Gly Leu Arg Trp Gln Arg Ala Arg Arg Arg Gly Glu Leu His Pro Gly210 215 220Val Pro Leu Pro Ser His Pro225 230
(2)序列SEQ ID NO3資料(i)序列特征(A)長度24堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓樸學線狀(iii)假設無(iv)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO3TCGACTGGAA CGAGACGACC TGCT(2)序列SEQ ID NO4資料(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓樸學線狀(iii)假設無(iv)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO4AGCAGGTCGT CTCGTTCCAG(2)序列SEQ ID NO5資料(i)序列特征(A)長度988堿基對(B)類型核酸
(C)鏈單鏈(D)拓樸學線狀(ii)分子類型cDNA至mRNA(iii)假設無(iv)反義無(ix)性質(A)名CD3(B)位置30..734(xi)序列描述SEQ ID NO5CGGCCGGAAT TCCGCCGCCC CCGGCCGAA ATG ACA GTG CTG GCG CCA GCC TGG53Met Thr val Leu Ale Pro Alo Trp1 5AGC CCA ACA ACC TAT CTC CTC CTG CTG CTG CTG CTG AGC TCG GGA CTC 101Ser Pro Thr Thr Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Ser Gly Leu10 15 20AGT GGG ACC CAG CAC TCC TCC TTC CAA CAC AGC CCC ATC TCC TCC GAC 149Ser Gly Thr Cln Asp Cya Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp25 30 35 40TTC CCT GTC AAA ATC CGT GAG CTG TCT GAC TAC CTG CTT CAA GAT TAC 197Phe Ala Vel Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr45 50 55CCA GTC ACC GTG GCC TCC AAC CTG CAG GAG GAG GAG CTC TGC GGG GGC 245Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cye Gly Gly60 65 70CTC TGG CGG CTG GTC CTG GCA CAG CGC TGG ATG GAG CGG CTC AAG ACT 293Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr75 80 85GTC GCT GGG TCC AAG ATG CAA GCC TTG CTG GAG CGC GTG AAC ACG GAG 341Val Ala Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu90 95 100ATA CAC TTT GTC ACC AAA TGT CCC TTT CAG CCC CCC CCC AGC TGT CTT 389Ile Mls Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu105 110 115 120CGC TTC GTC CAG ACC AAC ATC TCC CGC CTC CTG CAG GAG ACC TCC GAG 437Arg Phe Val Gln Thr Arn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Clu Thr Ser Glu125 136 135CAG CTG GTG GCG CTG AAG CCC TGG ATC ACT CGC CAG AAC TTC TCC CGG405Gln Leu Val Als Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gln Aen Phe ser Arg140 145 150TGC CTG GAG CTG CAG TGT CAG CCC GAC TCC TCA ACC CTG CCA CCC CCA533Cys Leu Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser Scr Thr Leu Pro Pro Pre155 160 165TGG AGT CCC CGG CCC CTG GAG GCC ACA GCC CCG ACA GCC CCG CAG CCC583Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Thr Ala Pro Gln Pro170 175 180CCT CTG CTC CTC CTA CTG CTG CrG CCC GTG GGC CTC CTG CTG CTG GCC629Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Val Gly Leu Leu Leu Leu Ala185 190 195 200GCT GCC TGG TGC CTG CAC TGG CAG AGG ACG CGG CGC ACC ACA CCC CGC677Als Ala Trp Cys Leu His Trp Gln Arg Thr Arg Arg Arg Thr Pro Arg205 210 215CCT GGG GAG CAG GTG CCC CCC GTC CCC AGT CCC CAG GAC CTG CTG CTT725Pro Gly Glu Gln Val Pro Pro Val Pro Ser Pro Gln Asp Leu Leu Leu220 225 230GTG GAG CAC TGACCTGGCC AAGGCCTCAT CCTGCCGACC CTTAAACAAC774Val Glu His235GCAGTGAGAC AGACATCTAT CATCCCATTT TACAGGGGAG GATACTGAGG CACACAGAGG 834GGAGTCACCA GCCAGAGGAT GTATAGCCTG GACACAGAGG AACTTGGCTA GAGGCCGGTC 894CCTTCCTTGG GCCCCTCTCA TTCCCTCCCC AGAATGGAGG CAACGCCAGA ATCCAGCACC 954GGCCCCATTT ACCCAACTCT GAACAAAGCC CCCG 988
(2)序列SEQ ID NO6資料(i)序列特征(A)長度235氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓樸學線狀(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO6Met Thr Val Leu Ala Pro Ala TrP Ser Pro Thr Thr Tyr Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Ser Ser Gly Leu Ser Gly Thr Gln Asp Cys Ser Phs20 25 30Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala Val Lys Ile Arg Glu Leu35 40 45Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu50 55 60Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln65 70 75 80Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln Gly85 90 95Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Lys Cys Ala100 105 110Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile Ser115 120 125Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu Val Ala Leu Lys Pro Trp130 135 140Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Leu Gln Cys Gln Pro145 150 155 160Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala165 170 175Thr Ala Pro Thr Ala Pro Gln Pro Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu180 185 190Pro Val Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Trp Cys Leu His Trp Gln195 200 205Arg Thr Arg Arg Arg Thr Pro Arg Pro Gly Glu Gln Val Pro Pro Val210 215 220Pro Ser Pro Gln Asp Leu Leu Leu Val Glu His225 230 235
(2)序列SEQ ID NO7資料(i)序列特征(A)長度71堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓樸學線狀(ii)分子類型cDNA至mRNA(iii)假設無(iv)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO7AATTGGTACC TTTGGATAAA AGAGACTACA AGGACGACGA TGACAAGACA CCTGACTGTT60ACTTCAGCCA C 71(2)序列SEQ ID NO8資料(i)序列特征(A)長度37堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓樸學線狀(ii)分子類型cDNA至mRNA(iii)假設無(iv)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO8ATATGGATCC CTACTGCCTG GGCCGAGGCT CTGGGAG
權利要求
1.一個多肽，其特征在于是一個分離的flt3-配體(flt3-L)多肽。
2.一個如權利要求1所述的多肽，其特征在于是小鼠的flt3-L。
3.一個如權利要求1所述的多肽，其特征在于是人的flt3-L。
4.一個如權利要求要求3所述的多肽，其特征在于包含SEQ10NO6中的1-235氨基酸。
5.一個如權利要求1所述的多肽，其特征在于是可溶性的flt3-L。
6.一個如權利要求5所述的多肽，其特征在于包含SEQ10NO6中的28～160或28～182氨基酸。
7.一個如權利要求3所述的多肽，其特征在于它由具有接受號碼ATCC69382的大腸桿菌DH10B細胞中載體sfHAVEO410上的插入cDNA編碼。
8.一個DNA序列，其特征在于是編碼一種flt3-L多肽的分離的DNA序列。
9.一個如權利要求8所述的分離的DNA序列，其特征在于它編碼一個小鼠flft3-L多肽。
10.一個如權利要求8所述的分離的DNA序列，其特征在于它編碼一個人flt3-L多肽。
11.一個如權利要求8所述的分離的DNA序列，其特征在于它編碼SEQ10NO6的氨基酸順序28～160或28～182。
12.一個如權利要求8所述的DNA，其特征在于它選自以下組(a)由一個flt3-L基團的編碼區域衍生來的cDNA；(b)由SEQ ID NO1和SEQ ID NO5所選出的cDNA序列；(c)于中等嚴格條件下可與(a)或(b)中的cDNA雜交的DNA序列，此DNA序列編碼flt3-L；(d)由于遺傳密碼的簡并性，編碼具有如(a)，(b)或(c)的DNA序列所編碼的氨基酸順序的flt3-L多肽的DNA序列。
13.包含如權利要求8的DNA序列的一個表達載體。
14.包含如權利要求9的DNA序列的一個表達載體。
15.包含如權利要求10的DNA序列的一個表達載體。
16.包含如權利要求11的DNA序列的一個表達載體。
17.包含如權利要求12的DNA序列的一個表達載體。
18.用如權利要求13的表達載體轉染或轉化的一種宿主細胞。
19.用如權利要求14的表達載體轉染或轉化的一種宿主細胞。
20.用如權利要求15的表達載體轉染或轉化的一種宿主細胞。
21.用如權利要求16的表達載體轉染或轉化的一種宿主細胞。
22.用如權利要求17的表達載體轉染或轉化的一種宿主細胞。
23.一種產生flt3-L多肽的方法，其特征在于包括在促進表達條件下培養如權利要求18的宿主細胞并從培養基中回收多肽。
24.一種產生flt3-L多肽的方法，其特征在于包括在促進表達條件下培養如權利要求19的宿主細胞并從培養基中回收多肽。
25.一種產生flt3-L多肽的方法，其特征在于包括在促進表達條件下培養如權項要求20的宿主細胞并從培養基中回收多肽。
26.一種產生flt3-L多肽的方法，其特征在于包括在促進表達條件下培養如權項要求21的宿主細胞并從培養基中回收多肽。
27.一種產生flt3-L多肽的方法，其特征在于包括在促進表達條件下培養如權項要求22的宿主細胞并從培養基中回收多肽。
28.與flt3-L多肽發生免疫反應的一種抗體。
29.如權利要求28所述的抗體，其特征在于是一種單克隆抗體。
30.一種復方藥，其特征在于它含有有效量如權利要求1的flt3-L多肽以及一種可接受的藥用攜帶劑、賦形劑和稀釋劑。
31.一種復方藥，其特征在于它包含有效量如權利要求3的flt3-L多肽以及一種可接受的藥用攜帶劑、賦形劑或稀釋劑。
32.一種對接受細胞減少療法進行包體移植的方法，其特征在于包括(a)在進行細胞減少療法前，從病人收集造血祖代細胞和干細胞；并且(b)在以后的細胞減少療法時給病人輸入所收集的細胞；本方法至少包括一個以下步驟(i)在收集細胞前給病人服用有效量的flt3-L以增加循環著的祖代細胞或干細胞的數目；(ii)通過與有效量的flt3-接觸，體外擴展祖代細胞或干細胞；并且(iii)給病人服用有效量的flt3-以便于病人對移植祖代細胞或干細胞的吸入。
34.如權利要求33的一種方法，其特征在于其中flt3-L與以下所列的細胞素中所選出的一種順序或同時聯合使用，細胞素包括CSF-1，GM-CSF，SF，G-CSF，EPO，IL-，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，GM-CSF/IL-3融合蛋白，LIF和FGF。
35.如權利要求34的一種方法，其特征在于其中flt3-L與以下所列的細胞素中所選出的一種聯合使用，細胞素包括GM-CSF，SF，G-CSF，EPO，IL-3和GM-CSF/IL-3融合蛋白。
36.一種造血細胞糖展培養基，其特征在于包括細胞生長培養基，和有效量的如權項要求1的flt3-L多肽。
37.一種將外源基因轉染入早期造血細胞的方法，其特征在于包括以下步驟(a)在含有效量flt3-L多肽的培養基中培養早期造血細胞，并且(b)用基因轉染步驟(a)中的培養細胞。
38.一種將外的基因轉染入哺乳動物的方法，其特征在于包括以下步驟(a)在含有效量flt3-L多肽的培養基中培養早期造血細胞；并且(b)用基因轉染(a)中的培養細胞；并且(c)給哺乳動物注入轉染的細胞。
39.一種促進哺乳動物T細胞增殖的方法，其特征在于包括給哺乳動物注入有效量如權項要求1的flt3-L多肽。
40.一種促進哺乳動物中脾臟紅血球譜系的細胞增殖的方法，其特征在于包括給哺乳動物注入有效量如權利要求1的flt3-L多肽。
41.如權利要求40的一種方法，其特征在于更進一步包括注入一定有效量的EPO。
42.一種治療具有骨髓形成綜合癥癥狀的病人的方法，其特征在于包括給病人注入一定有效量根據權利要求1的flt3-L多肽以及一個或更多由下列組中所選的生長因子CSF-1，GM-CSF，SF，G-CSF，EPO，IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，GM-CSF/IL-3融合蛋白，LIF和FGF。
43.一種治療具有貧血癥癥狀的病人的方法，其特征在于包括給病人注入一定有效量根據權利要求1的flt3-L多肽以及一個或更多由下列組中所選的生長因子CSF-1，GM-CSF，SF，G-CSF，EPO，IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，GM-CSF/IL-3融合蛋白，LIF和FGF。
44.一種治療具有獲得性免疫缺陷綜合癥癥狀的病人的方法，其特征在于包括給病人注入一定有效量根據權利要求1的flt3-L多肽以及一個或更多由下列組中所選的生長因子CSF-1，GM-CSF，SF，G-CSF，EPO，IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-1 3，IL-14，IL-15，GM-CSF/IL-3融合蛋白，LIF和FGF。
45.根據權利要求44的一種方法，其特征在于其中病人正接受AZT治療。
46.一種轉基因非人哺乳動物，其特征在于其所有的胚和體細胞包含有根據權利要求8的基因被轉入所說的哺乳動物，或所說的哺乳動物的祖先，在胚階段。
47.一種從懸浮細胞混合物中分離表面具有flt3受體的細胞的方法，其特征在于包括用具有flt3結合蛋白的接觸表面來接觸混合物中的細胞，然后分離接觸表面和懸浮液。
48.根據權利要求47的一種方法，其特征在于其中的flt3結合蛋白是flt3-L。
全文摘要
揭示了flt3受體的配體能夠傳輸更新信號來調節祖代細胞和干細胞的生長，增殖或分化。本發明涉及作為一分離蛋白質的flt3-L，編碼flt3-L的DNA，用編碼flt3-L的cDNA轉染的宿主細胞，含有flt3-L的復方，使用flt3-L提高轉送基因至哺乳動物的方法，以及通過使用flt3-L提高移植的方法。flt3-L可在治療有貧血病，AIDS和其他不同的癌癥病人中有用。
文檔編號A61K38/00GK1125479SQ94192225
公開日1996年6月26日 申請日期1994年5月12日 優先權日1993年5月24日
發明者S·D·萊曼, M·P·貝克曼 申請人:依默耐克斯有限公司