專利名稱：疫苗的設(shè)計(jì)和生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了確定微生物粘附機(jī)制的方法。微生物粘附基礎(chǔ)的機(jī)制允許鑒別造成粘附的微生物分子，因而可設(shè)計(jì)用于預(yù)防或減少微生物粘附于細(xì)胞、醫(yī)療器械、假體等的疫苗。因此本發(fā)明屬于免疫學(xué)和微生物學(xué)領(lǐng)域。
各種細(xì)菌和其它微生物粘附于特定的細(xì)胞類型以及植入器械例如假體、可植入去纖顫器、心臟起搏器、人工關(guān)節(jié)等，構(gòu)成了治療這類感染的主要臨床障礙，許多這類粘附性生物的抗菌素或抗真菌劑抗藥性使這一問(wèn)題更加混亂。
本發(fā)明包括通過(guò)評(píng)價(jià)粘附性微生物和非粘附性微生物間細(xì)胞表面的差異來(lái)確定微生物粘附性質(zhì)的方法。通過(guò)使用上述確定金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)類粘附于牛乳房上皮細(xì)胞(引起牛乳腺炎)的性質(zhì)來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的可操作性和合乎需要性。本發(fā)明的乳腺炎疫苗(本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案)是本發(fā)明疫苗的例證，它們是根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的。
已知有許多種革蘭氏陽(yáng)性菌引起乳腺炎。革蘭氏陽(yáng)性菌、例如鏈球菌(Streptococci)、葡萄球菌(Staphylococci)和棒狀桿菌(Corynebacteria)屬常作為乳腺炎的引發(fā)劑。微生物引起乳腺炎的傾向與微生物粘附于牛乳房的易變形(ductile)上皮細(xì)胞的能力相關(guān)。A.J.Frost，Infection and Immunity，121554-1556(1975)。
本發(fā)明的乳腺炎疫苗利用了微生物粘附于牛乳房易變形上皮細(xì)胞的能力與由此產(chǎn)生的發(fā)病機(jī)理間的相互關(guān)系。制備并提取細(xì)菌細(xì)胞壁，以確定粘附于易變形上皮細(xì)胞的細(xì)菌和對(duì)易變形上皮細(xì)胞缺乏粘附能力的細(xì)菌中特異蛋白的存在。然后利用存在于粘附性細(xì)菌但不存在于非粘附性細(xì)菌的蛋白產(chǎn)生肽的亞碎片，該碎片是本發(fā)明列舉的乳腺炎疫苗的基礎(chǔ)。
本發(fā)明提供了疫苗設(shè)計(jì)方法，通過(guò)制備細(xì)胞壁或細(xì)胞膜提取物，通過(guò)比較粘附與非粘附性微生物來(lái)確定粘附相關(guān)分子，對(duì)于粘附相關(guān)分子進(jìn)行生化特性測(cè)定，使用這些信息合理設(shè)計(jì)疫苗，該疫苗引發(fā)免疫反應(yīng)，而后干擾微生物的粘附能力。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案提供了與細(xì)菌粘附于易變形的上皮細(xì)胞相關(guān)蛋白的肽亞碎片以及其式I的衍生形式式IR1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-Gly-R10-Gly-R12-R13-Gly-R15-R16-Ala-R18-Arg-Ala-R21-Gln-Gly-R24其中R1是氫或C1-C16羧酸R2是Ala，Gly，Ser或丙酸R3是Val，Ile，Leu或.D-Val；R4是Lys或Arg；R5是Val，Ile或Leu；R6是Ala，Gly或Ser；R7是Ile，Leu或Val；R8是Asp，Asn或Glu；R10是Phe，Tyr或Trp；R12是Arg，Asn，Lys或His；R13是Ile，Leu或Val；R15是Arg，Asn，Lys或His；R16是Leu，Ala，Ile或Val；R18是Phe，Asn，Lys或His；R21是Ile，Ala，Val或Leu；R24是OH，Ala或Ser。本發(fā)明還提供了式II的多抗原遞呈肽式II 其中肽1、肽2、肽3、肽4獨(dú)立地選自式I化合物。
本發(fā)明還提供了制劑中的肽和多抗原肽，該制劑適于對(duì)所述肽和多抗原遞呈肽引發(fā)最強(qiáng)免疫反應(yīng)。
有效控制牛乳腺炎是重要的。患乳腺炎的產(chǎn)乳動(dòng)物須用抗生素治療，使用抗生素治療產(chǎn)乳動(dòng)物導(dǎo)致牛奶中的抗生素濃度超出日前常規(guī)基準(zhǔn)。因此，開(kāi)發(fā)對(duì)牛乳腺炎有效的疫苗具有重要的商業(yè)意義并且為獸醫(yī)管理中消除抗生素治療畜類乳腺炎的需要提供了可能。式I化合物R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-Gly-R10-Gly-R12-R13-Gly-R15-R16-Ala-R18-Arg-Ala-R21-Gln-Gly-R24
其中R1是羥基或C1-C16羧酸R2是Ala，Gly，Ser或丙酸R3是Val，Ile，Leu或D-Val；R4是Lys或Arg；R5是Val，Ile或Leu；R6是Ala，Gly或Ser；R7是Ile，Leu或Val；R8是Asp，Asn或Glu；R10是Phe，Tyr或Trp；R12是Arg，Asn，Lys或His；R13是Ile，Leu或Val；R15是Arg，Asn，Lys或His；R16是Leu，Ala，Ile或Val；R18是Phe，Asn，Lys或His；R21是Ile，Ala，Val或Leu；R24是OH，Ala或Ser；是在確定乳牛的乳腺炎病原劑粘附于乳房易變形上皮細(xì)胞的機(jī)理的廣泛研究中得到的，比較金黃色葡萄球菌菌株粘附于乳房易變形上皮組織的能力，然后再將它們分入粘附菌株與非粘附菌株組。從粘附和非粘附金黃色葡萄球菌中提取外膜制品并比較，發(fā)現(xiàn)存在于粘附菌株但不存在于非粘附菌株的蛋白。有三種蛋白存在于粘附菌株中但不存于非粘附菌株中。這些蛋白的分子量為36KD、47KD和65KD。測(cè)定蛋白的生化特性并選擇36KD蛋白為最有希望作為制備乳腺炎預(yù)防性疫苗的候選者。最終選擇相應(yīng)于36KD蛋白氨基端的22氨基酸肽為乳腺炎疫苗生產(chǎn)的最適致免疫的。為制備疫苗，優(yōu)選22氨基酸N末端的天然序列。因此，式I中優(yōu)選的氨基酸取代基如下R1是氫；R2是Ala；R3是Val；R4是Lys；R5是Val；R6是Ala；R7是Ile；R8是Asp；R9是Gly；R10是Phe；R11是Gly；R12是Arg R13是Ile；R15是Arg；R16是Leu；R18是Phe；R21是Ile；及R24是羥基。式I的其它可能的取代基可根據(jù)的具有相似功能基團(tuán)的氨基酸的已知生化和免疫學(xué)性質(zhì)來(lái)選擇。本發(fā)明還包括式I化合物的致免疫的亞片段。式II的多抗原遞呈肽允許表示式I的多種致免疫的肽，因而可提供了能更有效地引發(fā)免疫應(yīng)答的致免疫的亞單位的較大分子。在式II的多抗原遞呈肽上表示的式I肽，可以是相同的或式I肽的任意組合。
使用如本領(lǐng)域公知的固相蛋白合成法可容易地合成式I的肽。本發(fā)明的固相蛋白合成方案使用普通保護(hù)基團(tuán)和脫保護(hù)方案。無(wú)論目前本領(lǐng)域前沿的固相肽合成法的常規(guī)性質(zhì)如何，本發(fā)明者推薦三篇有關(guān)固相合成的文獻(xiàn)以便于本發(fā)明的實(shí)踐。如果技術(shù)人員不能設(shè)計(jì)出優(yōu)選的條件及合成方案，G.Barany等InternationalJournal of Peptide and Protein Research，30705-739(1987)；J.M.Stewart和J.D.Young，SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESE，Pierce ChemicalCompany，Rockford，Illinois(1984)；和P.D.Bailey，AN INTRODUCTION TOPEPTIDE CHEMISTRY，John Wiley & SonsNew York(1992)可用于查閱常規(guī)保護(hù)基團(tuán)和使用它們的反應(yīng)條件、脫保護(hù)試劑和方案，裂解試劑和推薦的使用它們的條件等。本發(fā)明者使用Applied Biosystems自動(dòng)肽合成儀，它可完全由制造商增補(bǔ)推薦方案、溶劑、試劑等。實(shí)施例中詳述了在固相合成中采用的特定方案。
為確保充分理解，現(xiàn)定義本說(shuō)明書(shū)中使用的某些術(shù)語(yǔ)和縮略語(yǔ)。術(shù)語(yǔ)“Boc”指叔丁氧羰基。術(shù)語(yǔ)“甲苯磺酰基(tosyl)”是對(duì)甲苯磺酰基的縮寫(xiě)。術(shù)語(yǔ)“Chxl”是環(huán)己基的縮寫(xiě)。術(shù)語(yǔ)“2Cl-Z”是2-氯芐氧羰基的縮寫(xiě)。術(shù)語(yǔ)“C1-C16羧酸”指除“氨基端”羧酸外具有1-16個(gè)碳的無(wú)支鏈烴。適宜的式IC1-C16羧酸基團(tuán)僅是氨基端基團(tuán)。因此，出現(xiàn)于C1-C16羧酸中的飽和度和取代度是重要的。適宜的無(wú)環(huán)一元羧酸的例子包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷羧酸、十二烷羧酸。如上面討論的那樣，也可以使用不飽和無(wú)環(huán)一元羧酸及取代的飽和的和不飽和的無(wú)環(huán)一元羧酸。技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到任意結(jié)構(gòu)部分固有的伸展性，它的唯一功能是提供末端。因此本發(fā)明包括C1-C16羧酸和上面討論的變化。
式II的LYS是賴氨酸的縮寫(xiě)。式I化合物的亞單位(R2-R24)除R4位丙酸和R3位D-Val外，通常地是L-氨基酸。因此亞單位之間的鍵是肽鍵。將式I和式II肽的終端(R1-R24)定義為氫或羥基，如果加入另一種氨基酸，它們會(huì)消除肽鍵的形成。所以，當(dāng)R1是H時(shí)，該H不是附加的H，它是各個(gè)氨基酸或R2丙酸的H。同樣，當(dāng)R24是OH時(shí)，該OH不是附加的OH，而是R23的各個(gè)氨基酸的OH。當(dāng)R24是Ala或Ser時(shí)，存在完整的氨基酸，如果式II化合物合乎要求則羧基端羧酸可用于酰胺鍵形成。R2上的丙酸基可以是正丙酸或異丙酸。
優(yōu)選通過(guò)基因工程技術(shù)表達(dá)式I的肽，該肽由L氨基酸組成。利用氨基酸序列和已知的簡(jiǎn)并遺傳密碼通過(guò)基團(tuán)工程技術(shù)構(gòu)成表達(dá)載體，能以低成本表達(dá)大量的肽，從而有效地生產(chǎn)僅含天然氨基酸的式I的肽。無(wú)需瀏覽分子生物學(xué)的進(jìn)展?fàn)顟B(tài)有關(guān)可購(gòu)得的常規(guī)DNA序列和用于細(xì)菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體的長(zhǎng)篇大論。欲實(shí)踐基因工程生產(chǎn)本發(fā)明肽的技術(shù)人員可參閱J.Samrook等，MOLECULAR CLONINGA LABORATORY MANUAL，(第二版，1989)和F.M.Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，(1989)。上述文獻(xiàn)對(duì)所有基因工程論述提供了極好的技術(shù)補(bǔ)充。
適于引發(fā)免疫反應(yīng)的制品是本領(lǐng)域熟知的。完全弗氏佐劑(CFA)或許是最熟知的引發(fā)理想免疫應(yīng)答的佐劑。然而，在完全弗氏佐劑中分枝桿菌的存在和重復(fù)施用CFA引起的炎癥反應(yīng)局限了該佐劑在治療產(chǎn)乳動(dòng)物中的應(yīng)用。可利用許多其它的天然和合成的油基佐劑，也易于符合本發(fā)明的目的。下面簡(jiǎn)要討論佐劑。
佐劑被定義為當(dāng)與抗原同時(shí)施用時(shí)增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的任何制品。抗原是干擾宿主免疫系統(tǒng)并導(dǎo)致對(duì)侵入物質(zhì)(抗原)的免疫應(yīng)答的物質(zhì)。
免疫佐劑的作用機(jī)理尚不完全清楚，據(jù)信它們可吸引免疫反應(yīng)性淋巴細(xì)胞到抗原沉積部位，將抗原固定于炎癥部位(儲(chǔ)庫(kù)作用)，延遲抗原的分解代謝，激活反應(yīng)性細(xì)胞的代謝并刺激淋巴細(xì)胞相互作用。
佐劑也可以通過(guò)幾種其它的機(jī)理起作用，例如與自體抗原結(jié)合并修飾它們，又如弗氏佐劑在水油界面簡(jiǎn)單地改變它們的構(gòu)型，或者通過(guò)對(duì)T或B淋巴細(xì)胞的非特異性刺激。
如果不與特異性抗原一起施用，許多佐劑也會(huì)非特異性地增強(qiáng)免疫反應(yīng)性。有效的佐劑包括油、天然鹽、雙鏈核酸、微生物產(chǎn)物及許多其它試劑。
最為廣為人知的油基佐劑是上面簡(jiǎn)述的完全弗氏佐劑和非完全弗氏佐劑的變型。這些佐劑由油(或蠟)包水或鹽水乳液構(gòu)成。典型地是將可溶性抗原溶于鹽水并在等份油中乳化，所述油例如Bayol FTM(42.5％石蠟，31.4％單環(huán)萘和26.1％多環(huán)萘)或Arlacel(mannite monolate)。滅活分枝桿菌的加入大大增強(qiáng)了佐劑活性，這類佐劑被稱為“完全”佐劑，這是相對(duì)于不完全佐劑而言的，不完全佐劑沒(méi)有分枝桿菌。其它微生物產(chǎn)物包括脂蛋白提取物可以替代分枝桿菌。當(dāng)使用完全佐劑時(shí)，已確定分枝桿菌的糖脂類和粘肽部分(wax D)是所見(jiàn)的增強(qiáng)的佐劑作用的主要原因。
當(dāng)皮內(nèi)或皮下注射時(shí)，使用單層乳液佐劑系統(tǒng)的疫苗最為有效。雙層乳液(水包油包水)是更“自由流動(dòng)”的乳液，故可獲得更廣泛的施用途徑。
天然鹽是另一種增強(qiáng)致免疫的性的方法，因而使疫苗有效。用天然鹽，例如磷酸鈣、硅石、明礬(硫酸鋁鉀或磷酸鋁)或礬土霜沉淀的抗原溶液在注射部位及排流注射面積的淋巴結(jié)部位產(chǎn)生肉芽腫。該免疫肉芽腫所起的作用與用弗氏佐劑產(chǎn)生的相同。對(duì)人使用明礬沉淀的抗原增強(qiáng)了對(duì)于抗原例如，白喉類毒素預(yù)防接種的免疫應(yīng)答程度。
不溶性膠性載體是另一類佐劑。除明礬沉淀外，其它膠性載體可以單獨(dú)使用或和微生物產(chǎn)物或提取物組合與抗原組成佐劑。已經(jīng)證明血炭(Blood charcoal)在刺激產(chǎn)生抗被吸附抗原的抗體中有用。可控的聚合物長(zhǎng)度的藻酸鈣或鈉具有佐劑特性。據(jù)證明對(duì)少量被捕獲抗原聚丙烯酰胺凝膠能有效地刺激抗體產(chǎn)生。皂土也被成功地用作佐劑。
當(dāng)與負(fù)電荷的抗原、DNA或多核苷酸混合產(chǎn)生沉淀時(shí)，甲基化牛血清白蛋白和其它正電荷蛋白作為佐劑十分有效。
由于它們?cè)谧魟┲械挠猛荆?jiǎn)單提及一下微生物提取物。內(nèi)毒素，例如革蘭氏陰性細(xì)菌的胞內(nèi)脂多糖可有效地增強(qiáng)免疫反應(yīng)。內(nèi)毒素系統(tǒng)地施用時(shí)起佐劑作用，但當(dāng)它單獨(dú)與抗原注射時(shí)則更為有效。許多內(nèi)毒素能刺激抗體合成和B細(xì)胞增殖，還能提高巨噬細(xì)胞的吞噬活性。優(yōu)選的內(nèi)毒素包括大腸桿菌0111B4鼠傷寒沙門(mén)氏菌(S.typhimurium)多種類型、腸炎沙門(mén)氏菌(S.enteriditis)和明尼蘇達(dá)沙門(mén)氏菌(S.minnesota)中的內(nèi)毒素。分枝桿菌和一些真菌的細(xì)胞壁亦可提高免疫反應(yīng)性。這些物質(zhì)似乎能吸引和激活巨噬細(xì)胞，由此增強(qiáng)抗原誘導(dǎo)的炎癥部位的吞噬作用，而后通過(guò)輔助細(xì)胞增強(qiáng)抗原的顯示，接下來(lái)促進(jìn)抗原反應(yīng)性B淋巴細(xì)胞的激活并增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)的(T細(xì)胞)作用。
多核苷酸，尤其是雙鏈多核苷酸，例如聚肌胞(poly(IC))或聚腺尿(poly(AU))是有效的佐劑和免疫刺激劑。它們似乎是通過(guò)激活抗原反應(yīng)性T細(xì)胞而起作用。多核苷酸也激活巨噬細(xì)胞。
卡介菌(BCG)(Bacillus calmette guerin)、小棒桿菌(corynebacteriumparvum)、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、百日咳博得特氏菌(Bordetella pertussis)或這些細(xì)菌的提取物都被用作佐劑。左旋四咪唑，一種驅(qū)蟲(chóng)藥也可用作佐劑，假設(shè)這是通過(guò)它能激活T細(xì)胞、提高補(bǔ)體水平和激活巨噬細(xì)胞起作用。
佐劑的選擇或佐劑的組合完全在普通免疫學(xué)技術(shù)人員的技術(shù)范圍之內(nèi)。上述討論的佐劑包括用于實(shí)驗(yàn)的佐劑和潛在的應(yīng)用于獸類的佐劑。本發(fā)明的乳腺炎疫苗可使用任意上述的佐劑進(jìn)行配制，還應(yīng)考慮到佐劑與本發(fā)明的肽的任意組合，或佐劑與本發(fā)明的肽的任意結(jié)合的使用都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
據(jù)證明，本發(fā)明的乳腺炎疫苗能有效地引發(fā)包含抗體的體液應(yīng)答它阻斷其它的粘附性細(xì)菌結(jié)合到培養(yǎng)的乳房上皮細(xì)胞上。實(shí)施例中提供了免疫接種和牛乳房上皮細(xì)胞/細(xì)菌粘附鑒別的方案和具體細(xì)節(jié)。表I表示的數(shù)據(jù)表明了本發(fā)明的乳腺炎疫苗引發(fā)體液反應(yīng)的有效性，該反應(yīng)抑制金黃色葡萄球菌附著于乳用動(dòng)物的易變形上皮細(xì)胞。
表1結(jié)合抑制百分率對(duì)照奶牛 接種前 接種后 加強(qiáng)接種后10 8 34211 20 28312 17 39平均值 8 15 34實(shí)驗(yàn)?zāi)膛? 10 35 582 21 52 633 0 41 584 5 54 575 10 38 516 5 36 587 2 46 558 12 40 579 12 36 5910 3 32 5211 0 55 5412 0 30 5313 12 45 5714 31 36 5515 17 46 51平均值 9 41 56術(shù)語(yǔ)“PRE”(接種前)是指標(biāo)準(zhǔn)化的免疫接種前動(dòng)物血清阻斷粘附的能力。“POST”反映免疫接種后的水平“BOOST”值是如實(shí)施例中所述施行佐劑加強(qiáng)免疫接種后觀察到的值。實(shí)施例6提供了用于產(chǎn)生表I數(shù)據(jù)的方法。
本發(fā)明的疫苗在乳牛乳腺炎的獸醫(yī)學(xué)管理中特別有用。在乳腺炎疾病狀態(tài)下細(xì)菌對(duì)易變形上皮細(xì)胞的粘附性特別易受本發(fā)明疫苗的影響，因?yàn)楸景l(fā)明疫苗阻斷細(xì)菌粘附的能力會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌在正常擠奶過(guò)程中流出。
將上面的討論及數(shù)據(jù)主要指向本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，該方案是用本發(fā)明方法來(lái)設(shè)計(jì)本發(fā)明乳腺炎疫苗的用途。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到可將本領(lǐng)域各方面推知到許多其它與細(xì)菌粘附相關(guān)的領(lǐng)域，因而也應(yīng)想到本發(fā)明的其它應(yīng)用，并且這些都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
下面描述的本發(fā)明具體實(shí)施方案的實(shí)施例旨在進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而不暗示對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。
實(shí)施例1AVKVAIDGFGRIGRLAFRAIQG-OH的合成使用具有下列側(cè)鏈保護(hù)基Arg(Tosyl)、Asp(Chxl)和Lys(2-Cl-z)的Boc氨基酸。將328(0.25mM)Boc GlyOC H2PAM樹(shù)脂(Applied Biosystems)通過(guò)雙偶合循環(huán)裝載到通過(guò)Applied Biosystems 430A肽合成儀上。
經(jīng)TEA脫保護(hù)循環(huán)從完全的肽基樹(shù)脂上脫除N-末端Boc基，然后將樹(shù)脂轉(zhuǎn)移到HF反應(yīng)容器中，除去過(guò)量溶劑并真空。干燥該樹(shù)脂，得1.03g。加入1ml間甲酚，將該容器連于HF裝置(HF apparatus)(Pennisula Labs)，冷至-78℃，并抽取進(jìn)約15ml液態(tài)氟化氫。在冰浴中攪拌該反應(yīng)1小時(shí)，而后真空除去HF，殘留物懸于200ml乙醚。使該固體物質(zhì)通過(guò)60ml玻璃多孔過(guò)濾漏斗，用乙醚洗兩次。通過(guò)將收集物用15ml 50％乙酸水溶液(aq HOAc)洗滌兩次，用15ml 10％aq HOAc洗滌兩次和15ml水洗一次來(lái)增溶肽并使之與樹(shù)脂分離。合并水性濾液，凍結(jié)并凍干。
將凍干物再溶于15ml 50％aq HOAc、10ml 10％aq HOAc和3ml CH3CH中。取出5μl該溶液，用0.1％TFA稀釋到500μl，將25μl注射到0.46×15cmVydacC18柱，使用FPLC(Pharmacia)系統(tǒng)分析。流速采用0.5ml/分。室溫下進(jìn)行層析。使用帶有214nm濾片的UV檢測(cè)器和設(shè)置于FPLC’S檢測(cè)器(Pharmacia)的0.2A規(guī)格檢測(cè)分離。層析溶液A為0.1％TFA。層析溶液B是0.1％TFA/50％CH3CN；使用的梯度為50％B、5％B、1％B、40％B、0％B和5％B。
在FPLC上，將剩余溶液上2.2×25cm VydacC18柱進(jìn)行制備性提純。使用梯度為25％B50分鐘，然后在450分鐘里用25-65％B。收集5分鐘(250ml)餾份。使用規(guī)格設(shè)定為0.2A的FPLC檢測(cè)器在214nm檢測(cè)UV吸收。用0.1％TFA以1∶10比例稀釋第60-74各餾份的40μl樣品，用HPLC分析20μl每份的樣品。合并第64-68餾份，凍結(jié)并凍干，得到112mg。隨后對(duì)該產(chǎn)物樣品進(jìn)行氨基酸分析和質(zhì)譜分析。氨基酸摩爾比證實(shí)了得到的是目的產(chǎn)物。
快速原子轟擊質(zhì)譜數(shù)據(jù)表明除目的產(chǎn)物(2315.75)外還有2種較高分子量的組份(2375.0和2357.4)。該產(chǎn)物的HPLC分析表明純度高于90％。
實(shí)施例2AVKVAIDGFGRIGRLAFRAI.QG-OH的大規(guī)模合成合成、斷裂和純化基本按實(shí)施例1的教導(dǎo)進(jìn)行。在AVKVAIDGFGRIGRLAFRAIQG-OH的合成中使用0.65g(0.5mM)BocGlyOCH2PAM樹(shù)脂，得到2.1g完全的肽基樹(shù)脂(得到理論重量的98％)。在斷裂中使用1.5ml間甲酚和20ml HF，凍干所收集固體的水洗液得到1.06g粗產(chǎn)物。該產(chǎn)物的HPLC分析表明純度為約75％，氨基酸分析表明存在所有預(yù)示的殘基。氨基酸比例在所期望的粗肽制品的范圍之內(nèi)，但比例的變化性較理想的高一些。質(zhì)譜分析未測(cè)到質(zhì)量為2315.75的產(chǎn)物。缺乏2315.75MW產(chǎn)物是由于7和8位上Asp-Gly的存在以及HF斷裂。
實(shí)施例3AVKVAIEGFGAIGRLAFRAIQG-OH的合成合成、斷裂和純化基本上按實(shí)施例1進(jìn)行。該合成中的7和8位與實(shí)施例2的反應(yīng)產(chǎn)物的相應(yīng)位置不同。選擇該肽的7和8位與HF斷裂方法具有相容性。將650mg(0.5mM)Boc GlyOCH2PAM樹(shù)脂通過(guò)目的合成反應(yīng)裝載，該反應(yīng)中對(duì)Glu7側(cè)鏈保護(hù)使用Chxl。如實(shí)施例1在ABI 430A肽合成儀上進(jìn)行雙偶合。干燥后得到2.08g97％)肽基樹(shù)脂。基本按實(shí)施例2的方法進(jìn)行HF斷裂對(duì)所收集固體的水洗液進(jìn)行HPLC分析，并且經(jīng)制備層析純化剩余的100ml水溶液。
合并餾份90-107，冷凍并凍干，得到400mg。HPLC分析表明其純度為約95％+。氨基酸比例與理論值一致，質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)證實(shí)了目的分子量(2329.78)產(chǎn)物的存在。
實(shí)施例4多抗原遞呈的乳腺炎肽(AVKVAIDGFGRIGRLAFRAIQG)4MAPS4-分支的合成如實(shí)施例1在ABI 430A肽合成儀上使用Boc氨基酸進(jìn)行雙偶聯(lián)，用1克(0.5mM)MAP4-分支t-Boc樹(shù)脂進(jìn)行同樣的固相合成。得到2.7g干燥的肽基樹(shù)脂，在斷裂中使用2ml間甲酚和25ml液態(tài)HF。除去HF后用乙醚沉淀，過(guò)濾固體，用醚洗滌，通過(guò)用50％aqHOAc、10％aq HOAc和水洗滌來(lái)從所收集固體中提取肽。將合并的水洗液冷凍并凍干，得到830mg。高壓液相層析(HPLC)分析表明僅有一寬峰，氨基酸分析得到的比例在理論值的68％-127％范圍內(nèi)。發(fā)現(xiàn)蛋白含量為36％。使用該產(chǎn)物而進(jìn)行免疫接種無(wú)需進(jìn)行另外的純化/特征鑒別。
實(shí)施例5疫苗的配制將本發(fā)明優(yōu)選的疫苗制成雙層乳液(水包油包水)。把所需量的優(yōu)選肽溶于含0.5％CaCl2的無(wú)菌磷酸緩沖鹽水(PBS)中，并用帶微量附屬裝置(Microattachment)的Omni Corp混合器在等體積的CFA(Difco)中進(jìn)行乳化。使用冰浴以防止對(duì)肽的熱損傷。一種可選擇性的乳化方法是使用兩支玻璃注射器和一個(gè)Leur鎖閥，在兩支注射器之間重復(fù)轉(zhuǎn)移乳液。無(wú)論何種方式進(jìn)行乳化，都應(yīng)測(cè)試乳液抵抗分散到水性介質(zhì)中的能力。通過(guò)將一滴乳液放在水中并觀察該乳液的分散來(lái)進(jìn)行測(cè)試。如果乳滴在水中穩(wěn)定數(shù)分鐘就足夠了。
將在油(CFA)中乳化的PBS的(最初的水相)中的肽而后在等體積的2％TWEENTM80(Sigma)中，用具有微量附屬裝置的混合器進(jìn)行乳化。帶有Leur鎖閥的注射器將乳化得同樣好。
實(shí)施例6免疫接種方法牛的研究在免疫接種開(kāi)始前，從每只動(dòng)物獲取少量血樣。表I中提供了作為研究中每只動(dòng)物的前血值的PRE。所有的免疫接種由1ml指定注射劑組成并且所有注射均是皮下的。對(duì)照組動(dòng)物每次接受1mlPBS，實(shí)驗(yàn)組則接受疫苗。最初的免疫接種由如實(shí)施例5詳述的在修飾的完全弗氏佐劑中乳化的50mg優(yōu)選的肽組成。初始注射后7天，每只“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物”接受第二次修飾的不完全弗氏佐劑(總體積1ml)中的75mg皮下注射。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接受修飾的不完全弗氏佐劑中的100mg優(yōu)選肽。初始免疫接種7周后，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接受100μg修飾的不完全弗氏佐劑進(jìn)行強(qiáng)化免疫接種。采血樣并評(píng)估可阻斷細(xì)菌粘附于易變形上皮細(xì)胞的抗體的存在。羊的研究對(duì)牛進(jìn)行的研究花費(fèi)了昂貴的費(fèi)用，因而在羊中只進(jìn)行了證明血清轉(zhuǎn)化(對(duì)抗本發(fā)明的優(yōu)選肽免疫原的抗體產(chǎn)生)的初步實(shí)驗(yàn)。下面給出了免疫接種方法、放血時(shí)間和由此得到的結(jié)果。
周1 2 3467 810注射疫苗 X X XX X采集血樣 X XXXX XX細(xì)胞分析 8.8 31 37 46 5556 52中百分抑制率實(shí)施例7牛乳房上皮細(xì)胞的制備A.組織獲取選擇具有正常乳房活性，即沒(méi)有疾病或外傷的動(dòng)物。使用捕獲栓施行安死術(shù)，取下整個(gè)乳房。室溫下用無(wú)菌0.85％鹽水對(duì)該乳房進(jìn)行全面洗滌。將乳房沿平行于中央韌帶對(duì)切。獲取健康組織。對(duì)健康組織的識(shí)別需要對(duì)該類型組織有一定的熟悉。實(shí)際上，實(shí)踐該方法的技術(shù)人員不一定具有這方面的技術(shù)，本發(fā)明者建議只獲取外觀是顆粒狀的組織。將獲取的組織樣品切成小片直至組織碎片能通過(guò)20號(hào)(gauge)針頭。將組織碎片放在盛有漢氏平衡鹽溶液(HBSS)、(GIBCO)的無(wú)菌容器中，它補(bǔ)加有慶大霉素和兩性霉素B(50ppm)。HBSS可以有兩種不同形式，一種含有Mg和Ca，不含Mg和Ca的HBSS本文稱為HBSS熟練技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到對(duì)獲取的樣品用含有有效抗生素和抗真菌劑的生理溶液進(jìn)行外科手術(shù)式洗滌是必要的，以減少原代培養(yǎng)中的污染。也可以使用其它鹽溶液、抗生素和抗真菌劑，這純粹是選擇方式問(wèn)題。B.組織制備將A步驟中制備的約100g組織放在約400ml新鮮冰冷的HBSS中。在隨后的過(guò)程中使該組織盡可能地置于冰上并盡快完成這些過(guò)程。取小片組織樣品放到無(wú)菌皿中，剪碎成均勻糊狀。合并剪碎的樣品并用冷HBSS洗，直至上清液外觀不再呈乳狀。C.消化過(guò)程制備酶“雞尾酒”來(lái)消化細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)，以游離出單個(gè)細(xì)胞。將下列組份溶于含有慶大霉素和兩性霉素B的400mlHBSS中來(lái)制備酶溶液，膠原酶-1.38g；α-糜蛋白酶-1g；彈性蛋白酶-20mg；透明質(zhì)酸酶-1g；大豆胰蛋白酶抑制劑-50mg和牛血清白蛋白-10g。上述試劑可從許多生化試劑供應(yīng)商購(gòu)得。SigmaChemical Company和Worthington Biochemical是優(yōu)選的廠商。
將上面制備的酶雞尾酒進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾并用來(lái)消化約100g組織。消化過(guò)程在約37℃進(jìn)行約45分鐘。確切時(shí)間根據(jù)溫度、混合情況、組織碎片大小、酶活性等而變化。本發(fā)明建議按一定時(shí)間間隔取出等份的消化混合物并觀察到含有多于約100個(gè)細(xì)胞的團(tuán)塊存在。顯微鏡和血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(hemocytometer)可充分滿足此目的。
將消化容器從37℃水浴或孵箱中取出(水浴是優(yōu)選的，因?yàn)橄鄬?duì)于孵箱而言它可快速達(dá)到熱平衡)，使用20目篩過(guò)濾該液體并將其傾入無(wú)菌杯中。如果有含有多于約200個(gè)細(xì)胞的殘余團(tuán)塊，使用橡膠淀帚(也可以用帶有橡膠底的注射器柱塞代替)進(jìn)行部分破碎。將消化液重新放入水浴中，仔細(xì)檢測(cè)，得到50-100個(gè)細(xì)胞每個(gè)團(tuán)塊的腺泡(acini)制品。避免過(guò)度消化對(duì)于制品的存活性及因此的利用性而言是必要的。
將燒杯從水浴中取出并使液體通過(guò)無(wú)菌CELLECTORTM篩(20目)，如果需要使用淀帚來(lái)破碎不能過(guò)篩的殘余團(tuán)塊。拋棄篩網(wǎng)上剩余組織并將該細(xì)胞制品放在離心管中。經(jīng)離心細(xì)胞被沉淀，用HBSS洗兩次并再懸浮于Media 199加Earl’s鹽(GIBCO)，它含有20％胎牛血清和10％二甲亞砜，細(xì)胞濃度為約6×106個(gè)細(xì)胞/ml。D.組織儲(chǔ)存將C步驟的細(xì)胞制品分成1ml等份溶液并裝入2ml塑料冷凍管(Sarstedt，WGermany)。該管在-70℃冰箱中預(yù)凍24小時(shí)，然后轉(zhuǎn)入液氮中最終儲(chǔ)存。
實(shí)施例8結(jié)合抑制分析A.乳房上皮細(xì)胞合并三個(gè)冷凍管的乳房上皮細(xì)胞并在25℃用PH7.2的40ml PHS洗三次。B.細(xì)菌生長(zhǎng)將一接種環(huán)金黃色葡萄球菌株轉(zhuǎn)移到無(wú)菌胰酶解酪蛋白大豆肉湯培基中于39℃培養(yǎng)24小時(shí)該菌株已被預(yù)先確定粘附于乳房上皮細(xì)胞。該細(xì)胞通過(guò)離心收獲并用等體積PBS洗一次。洗后，將該細(xì)胞以106個(gè)細(xì)胞/ml懸浮于PBS中。C.細(xì)菌粘附分析將洗過(guò)的乳房上皮細(xì)胞(0.5ml的104個(gè)細(xì)胞/ml懸浮液)與B步驟中制備的0.5ml細(xì)菌細(xì)胞懸浮液在12×75mM玻璃試管中混合，并在水浴搖床上于39℃孵育30分鐘。孵育后細(xì)胞混合物用PBS洗四次并除去任何非粘附細(xì)菌。涂片，空氣干燥，用革蘭氏結(jié)晶紫染色15秒。通過(guò)計(jì)數(shù)多塊涂片上粘附于25個(gè)乳房細(xì)胞的金黃色葡萄球菌數(shù)測(cè)定粘附于100個(gè)上皮細(xì)胞上的細(xì)菌數(shù)。
本發(fā)明疫苗的有效率部分地通過(guò)滴定免疫接種動(dòng)物血清和相關(guān)于稀釋品抑制粘附的能力來(lái)測(cè)定。第7頁(yè)表1概括了這些研究數(shù)據(jù)。
權(quán)利要求
1.一種具有下述結(jié)構(gòu)通式的乳腺炎疫苗R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-Gly-R10-Gly-R12-R13-Gly-R15-R16-Ala-R18-Arg-Ala-R21-Gln-Gly-R24其中R1是氫或G1-C16羧酸R2是Ala，Gly，Ser或丙酸R3是Val，Ile，Leu或D-Val；R4是Lys或Arg；R5是Val，Ile或Leu；R6是Ala，Gly或Ser；R7是Ile，Leu或Val；R8是Asp，Asn或Glu；R10是Phe，Tyr或Trp；R12是Arg，Asn，Lys或His；R13是Ile，Leu或Val；R15是Arg，Asn，Lys或His；R16是Leu，Ala，Ile或Val；R18是Phe，Asn，Lys或His；R21是Ile，Ala，Val或Leu；和R24是OH，Ala或Ser。
2.權(quán)利要求1的乳腺炎疫苗肽，其中R2是Ala；R3是Val；R4是Lys；R5是Val；R6是Ala；R7是Ile；R8是Asp；R9是Gly；R10是Phe；R11是Gly；R12是Arg；R13是Ile；R15是Arg；R16是Leu；R18是Phe；R21是Ile；和R24是OH。
3.一種具有下述通式的多抗原遞呈肽 其中，肽1、肽2、肽3和肽4獨(dú)立地選自于下式的化合物R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-Gly-R10-Gly-R12-R13-Gly-R15-R16-Ala-R18-Arg-Ala-R21-Gln-Gly-R24其中R1是氫或C1-C16羧酸R2是Ala，Gly，Ser或丙酸R3是Val，Ile，Leu或D-Val；R4是Lys或Arg；R5是Val，Ile或Leu；R6是Ala，Gly或Ser；R7是Ile，Leu或Val；R8是Asp，Asn或Glu；R10是Phe，Tyr或Trp；R12是Arg，Asn，Lys或His；R13是Ile，Leu或Val；R15是Arg，Asn，Lys或His；R16是Leu，Ala，Ile或Val；R18是Phe，Asn，Lys或His；R21是Ile，Ala，Val或Leu；和R24是OH，Ala或Ser。
4.權(quán)利要求3的多抗原遞呈肽，其中肽1、肽2、肽3和肽4各由下述化合物組成，其中，R2是Ala；R3是Val；R4是Lys；R5是Val；R6是Ala；R7是Ile；R8是Asp；R9是Gly；R10是Phe；R11是Gly；R12是Arg；R13是Ile；R15是Arg；R16是Leu；R18是Phe；R21是Ile，和R24是OH。
5.一種佐劑中包含權(quán)利要求1化合物的藥物制劑。
6一種佐劑中包含權(quán)利要求3化合物的藥物制劑。
7一種確定參與粘附的分子的方法，包括(a)制各粘附件或非粘附性微生物變種的細(xì)胞壁或細(xì)胞膜提取物；和(b)比較(a)步驟的提取物以確定存在于粘附性變種但不存在于非粘附性變種的分子。
8.權(quán)利要求7的方法，其中微生物是革蘭氏陽(yáng)性菌。
9.權(quán)利要求8的革蘭氏陽(yáng)性菌，它是一種與乳腺炎有關(guān)的細(xì)菌。
10.一種疫苗，它包含按權(quán)利要求7的方法鑒別的致免疫肽。
全文摘要
由與細(xì)菌粘附于乳房易變形上皮細(xì)胞相關(guān)蛋白衍生的肽用于制備預(yù)防乳腺炎的疫苗。確定微生物粘附的方法提供了合理的疫苗設(shè)計(jì)。
文檔編號(hào)A61P31/04GK1141000SQ94194775
公開(kāi)日1997年1月22日 申請(qǐng)日期1994年11月4日 優(yōu)先權(quán)日1993年11月5日
發(fā)明者C·C·塞芬格, D·L·施邁利 申請(qǐng)人:伊萊利利公司