專利名稱：一種鮸魚α類趨化因子基因CXCL10、檢測方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及魚類免疫器官中表達的基因序列，更具體涉及一種從鯢魚脾臟和腎臟 SMART cDNA文庫中篩選出的一個新α類趨化因子基因CXCLlO的核苷酸序列、氨基酸序列及其時空表達圖譜。
背景技術：
動物免疫包括先天性免疫和獲得性免疫兩種。先天性免疫是指生物體所具有的對病原體和有害異物的基本天生抵抗性和防御性。先天免疫對絕大多數的病原體和有害異物具有快速、有力和非特異性作用的特點，尤其是在應對一些毒力發揮快，極易造成疫病暴發的病原體入侵中，能否對入侵病原體進行有效的先天免疫往往是宿主動物存活與否的關鍵。先天免疫包括從體表到體內細胞及分子等不同層次的防御體系。體表屏障較易被病原體突破，且一旦突破后則經常引起組織損傷，為其他潛在的病原體入侵提供有利途徑，此時在細胞及分子層次上以炎癥反應為主的一系列復雜免疫反應對殺滅入侵病原體具至關重要的作用。趨化因子大多是能結合肝素的多肽，主要由白細胞分泌，通過受體介導引起粒細胞、單核細胞及淋巴細胞的定向遷移和活化，對淋巴細胞再循環，炎癥反應以及抗腫瘤等方面具有重要作用。依照保守的半胱氨酸殘基，可分為CXC ( α )，CC ( β )，C ( γ )和CX3C (S)四類。α類趨化因子是最早鑒定的具有趨化嗜中性粒細胞的趨化因子，同時其也具有趨化單核細胞和淋巴細胞的功能。α類趨化因子專門吸引能表達CXCRl和CXCR2的嗜中性粒細胞。它們能在很廣泛的細胞中對許多刺激物作出反應，特別是對像白細胞介素I和腫瘤壞死因子這樣的前炎癥細胞因子。主要的作用是促進嗜中性粒細胞與內皮細胞的黏附以及隨后的相關基質蛋白和細胞表面物質沿著趨化因子的濃度梯度向炎癥灶的定向移動并清除入侵病原體和有害異物。因此，對趨化因子基因超家族成員的克隆鑒定及其蛋白產物的結構和功能研究無疑能為魚類先天免疫分子機制解析及提高魚體抗病力提供堅實的技術支撐。

發明內容
本發明旨在提供一種新的鯢魚α類趨化因子基因序列及對應氨基酸序列、檢測方法和在制備鯢魚抵抗病原微生物入侵產品中的應用。為實現本發明的發明目的，發明人提供如下技術方案
一種鯢魚α類趨化因子基因CXCL10，具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。一種鯢魚α類趨化因子基因CXCL10，它編碼的蛋白質具有如SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。本發明所述的基因CXCLlO是從鯢魚脾臟、腎臟的SMART cDNA質粒文庫中篩選到的一個基因，其cDNA序列和編碼的蛋白質序列如下。該基因cDNA全長1157bp，自74bp 到442bp區段為其開放閱讀框，編碼122個氨基酸，5’端非翻譯區長73bp，3’端非翻譯區長7Mbp，有1個mRNA半衰期信號，多聚腺苷酸加尾信號(AATAAA)及多聚腺苷酸尾巴。在 Genbmk中進行同源性分析確定其為趨化因子基因超家族成員。CXCLlO基因的cDNA序列如下 ggggactacagatagtccagactgaagaaagactgagtgcactgtgatccagaacccgtctacagcaacaac
tATGAATTCAGCTGCTGTTGCCTTTCTCGTCTGCCTGCTTGTCTTCTATACACAAGGGCAACCAACCAACAGATCTA TTAAGTGTAAGTGTTTAAACGGTTATGTGGGCAAAATCAAACCACAAGACATCAAGGCAGGGCCTGTCACACATGAG CCAAGTATCTTCTGTCCACGTACAGAGATTATTATTACAACAACAGAAAATAGGGAGAAATGTGTGAATCCACGCTC ACCACTCGGAAAACTCATCCTGAAAAACAAAAACAAGTACCAGAAAAATGCAACTGTGAATACGACAGCAGCTTCAA GCTCAACGGACACGACAGCAGCTTCAAGCTCAACAAGACACCACACAACATCCAGGCTGTAGgactctgccactgca ctgaagaggatggagctgaaacactttttattgttgttgttcaccatcactgccttttatcaagtaaatacaataag tgggtagaagtgatcaaagtgtctgtttgtcctcttatatttgttgtggagaaattgctgaagtcagtggtcaatgg tgaggtcaggaaggaagaaagtgttcaggagcctctgatgtcttatgctgtatta^tttattgacgcttggccaagaa gaattagagacactctcaaagtacatcagaagtgcctgagtcggtctcacattctgccaaactcatcctggtggata gactttaaacccctacagataacaccacaaatactatacgcccagaattagccaaagagaatgtttttacccatgca ggtgttattctcagcatattctagtctggagacacagatgtctgtttacacagattggaacgtcaacggccagctat ctattatgtctatgaaggcagcaatagtctcttcgaccctggccaccacactgttgagatagactggcacctactgt tcccaatcaaagccaaacaattaatactgccgaggaccttaaggcccacacgtgaccttgtgtaagctaaggataaa aaattccataacaacattgtcttcatgtgtacataccaaataaatcatctgtatatactttttaagcaaaaaaaaaaCXCLlO基因編碼的蛋白質序列如下 MNSAAVAFLVCLLVFYTQGQPTNRSIKCKCLNGYVGKIKPQDIKAGPVTHEPSIFCPRTEIIITTTENREKCV
NPRSPLGKLILKNKNKYQKNATVNTTAASSSTDTTAASSSTRHHTTSRL。本發明還提供了一種鯢魚α類趨化因子基因CXCLlO的檢測方法，其中，所述的檢測方法至少包括使用一對熒光定量PCR引物，所述的一對熒光定量PCR引物由上游引物和下游引物組成，其中，所述的上游引物(CXCL10-RT-F)具有如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列；下游引物(CXCL10-RT-R)具有如SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列。本發明還提供了上述的一種鯢魚α類趨化因子基因CXCLlO在制備鯢魚抵抗病原微生物入侵產品中的應用。作為優選，根據本發明所述的一種鯢魚α類趨化因子基因CXCLlO在制備鯢魚抵抗病原微生物入侵產品中的應用，其中，所述的病原微生物包括鰻弧菌。發明人運用實時熒光定量PCR技術檢測了 CXCLlO在鯢魚的鰾、眼球、鰭條、鰓、心臟、小腸、腎臟、肝臟、肌肉、脾臟中的轉錄本水平，結果表明該基因在所檢測的十個組織中均有mRNA轉錄本存在，其中在小腸中的豐度最高，其次在眼球中，而在其他組織中則只檢測到較少量的mRNA轉錄本存在。另外還檢測到經鰻弧菌刺激后的脾臟和腎臟中的CXCLlO 基因表達量呈上升趨勢，明顯較正常水平高，這提示該基因在鯢魚抵抗病原微生物入侵中具有重要功能。與現有技術相比，本發明具有如下優點
本發明的基因的獲得不僅為研究魚類趨化因子CXCLlO分子在先天免疫反應中的作用機理奠定基礎，而且通過基因序列可以獲得具有生物活性的蛋白產物，為進一步研究CXCLlO的免疫學功能提供理論基礎。此外，本發明的基因還可以用于抗病相關性研究。


圖1為熒光定量檢測基因CXCLlO在鯢魚組織中的表達。圖2-1、2_2和2-3是鯢魚經鰻弧菌感染后肝臟、脾臟和腎臟組織中的CXCLlO基因表達的時空圖譜，其中圖2-1代表肝臟；圖2-2代表脾臟；圖2-3代表腎臟。
具體實施例方式下面結合實施例和說明書附圖，更具體地說明本發明的內容。應當理解，本發明的實施并不局限于下面的實施例，對本發明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發明保護范圍。在本發明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設備和原料等均可從市場購得或是本行業常用的。若無特別指明，實施例采用的方法為本領域通用技術。主要材料、試劑和儀器設備手術刀，眼科剪，鑷子，解剖盤，充氧泵，水箱，1.5ml 離心管，微量移液器、微量移液器槍頭，一次性培養皿，陶瓷研缽。脫氧核糖核苷酸dNTP， 熱聚合 Taq 酶，Trnzol-A+ 總 RNA 提取試劑盒，RealMasterMix(SYBRGreen)試劑，Quant cDNA第一鏈合成試劑盒以及DH5a感受態細胞，SMART cDNA Library Construction Kit,小型離心機(Qspin ，BAYGENE),渦旋振蕩器(QL-866型，QILINEBEIER),核酸蛋白儀 (SmartSpace Plus, Bio-feid)，超凈工作臺(SW — CJ一IG型，名牌之星)，恒溫培養箱(型號或生產商)，_80°超低溫冰箱(Thermo scientific)，熒光定量PCR系統(ABI 7300型)pH計 (Mettler Toledo 320PH Meter)、高壓蒸氣滅菌鍋(SANYO)、高速冷凍離心機(Centrifuge 5417R, eppendorf)、電泳儀(DYY-6C型，北京六一)、水浴鍋(上海精宏)、凝膠成像系統 (Bio-Rad GD2000)、PCR 儀(ABI Veriti 96well Thermal Cycler)、自動測序儀(ABI 3730 型)。實驗樣本鯢魚采集于浙江省海洋水產研究所。本發明實施例所用的常規藥品氯仿(分析純)，異丙醇(分析純)，氯霉素，氯化鈉(分析純)購自國藥集團，異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷(X-gal)，胰蛋白胨，酵母提取物，瓊脂糖，溴化乙錠，焦碳酸二乙酯 (DEPC)等購自Takara公司，液氮為浙江省舟山億洋氣體有限公司產品，脫氧核糖核苷酸 dNTP,熱聚合 Taq 酶，Trnzol-A+ 總 RNA提取試劑盒，RealMasterMix (SYBRGreen)試劑，Quant cDNA第一鏈合成試劑盒以及DH5a感受態細胞購自TIANGEN公司，SMART cDNA Library Construction Kit購自Clontech公司，質粒文庫測序由華大基因公司完成，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；
本發明實施例所用主要儀器包括小型離心機(Qspin ，BAYGENE),渦旋振蕩器 (QL-866 型，QILINEBEIER),核酸蛋白儀(SmartSpace Plus, Bio-Rad),超凈工作臺 (SW—CJ一IG型，名牌之星)，恒溫培養箱(型號或生產商)，-80°超低溫冰箱(Thermo scientific)，熒光定量 PCR 系統(ABI 7300 型)pH 計(Mettler Toledo 320PH Meter)、高壓蒸氣滅菌鍋(SANYO)、高速冷凍離心機(Centrifuge 5417R,印pendorf)、電泳儀(DYY-6C 型，北京六一)、水浴鍋(上海精宏)、凝膠成像系統(Bio-Rad⑶2000)、PCR儀(ABI Veriti96well Thermal Cycler)、自動測序儀(ABI 3730 型)。實施例中未注明具體條件的實驗方法，是按照常規條件，例如Sambrook等作者的分子克隆實驗室手冊(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商說明書建議的條件。實施例1
1.利用Trnzol-A+總RNA提取試劑盒(TIANGEN)提取鯢魚脾臟、腎臟總RNA 取健康的鯢魚(體重約750g)在充氧水箱養殖14日后，腹腔注射Iml的鰻弧菌 (1. 2X108 cfu/ml)。刺激24h后，解剖魚體取出脾臟和腎臟，液氮速凍后放入_80°C超低溫冰箱備用。分別取備用脾臟和腎臟組織約IOOmg用液氮研磨后加入Iml的Trnzol-A+總 RNA提取試劑(TIANGEN)勻漿，按照試劑盒說明提取總RNA。將兩個組織所得的總RNA合并于一個1. 5ml的離心管中，取2μ 1分別用核酸蛋白儀和電泳檢測總RNA濃度和質量。2. SMART cDNA 文庫構建
SMART cDNA 的合成步驟詳見 SMART cDNA Library Construction Kit 試劑盒操作手冊。取鯢魚脾腎組織mRNA lug，按試劑盒用戶手冊所提供的文庫構建方法合成第一鏈 cDNA 加入3，-CDS引物和SMART II寡核苷酸各1 μ 1，72°C孵育^iiin后，冰上急冷2min， 然后在終體積為10 μ 1的反應體系中，加入5Χ第一鏈反應緩沖液(250mmol/L Tris-Hcl, PH8.3; 375mmol/L Kcl ； 30mmol/L MgC12)2μ 1，DTT (20mmol/L)1 μ 1，dNTP (lOmmol/L) 1 μ 1和Powerscript逆轉錄酶1 μ 1，42°C保溫Ih合成第一鏈cDNA。取2 μ 1第一鏈cDNA 加入 dNTP 2 μ 1, SMART cDNA Library Construction Kit 試劑盒中對應的 PCR 引物 4 μ 1， 禾口 2μ1 50 X Advantage 2 cDNA Polymerase Mix 于 100 μ 1 的反應體系中進行如下 PCR 循環95°C預變性Imin后，以95°C 5s, 65°C 5s, 68°C 6min反應沈個循環。反應結束后，取 5μ 1電泳檢測。取50μ 1上述雙鏈cDNA，加入蛋白酶K(20ug/y υ2μ 1，45°C溫育20min， 滅活DNA聚合酶，用100 μ 1等體積苯酚/氯仿/異戊醇(1 1 1 )，氯仿/異戊醇(1:1)各抽提1次，上清夜經醋酸鈉，糖原，酒精共沉淀后，80%的酒精漂洗，風干后溶解于79 μ 1滅菌雙蒸水中，加入SfiI酶(20υ/μ 1)10μ 1，IOXsfiI緩沖液10 μ 1及1μ 1100XBSA，總體積 100 μ 1，50°C酶切池。酶切產物用CHROMA SPIN-400柱進行分級分離，收集1_16管，每管1 滴。分別取3 μ 1于1. 1%的瓊脂糖凝膠上150V電泳lOmin，收集含cDNA前3管，混合后加入醋酸鈉，糖原和酒精共沉淀，沉淀的cDNA用滅菌雙蒸水溶解。合成的SMART cDNA連接入pDNR-LIB載體中，并轉化入DH5 α感受態細胞中。涂平板(內含氯霉素、異丙基硫代- β -D-半乳糖苷(IPTG)及5-溴-4-氯-3-吲哚- β -D-半乳糖苷(X-gal)，37 °C恒溫培養箱中培養過夜。3.質粒文庫隨機篩選及測序
通過藍白斑鑒定后隨機篩選含cDNA插入片段的陽性重組子，將挑取的每個單克隆子分別接種到Iml氯霉素抗性的LB培養液中，搖菌2個小時，菌液PCR確認陽性克隆子，剔除假陽性克隆子。將經過菌液PCR鑒定的陽性克隆子寄送華大基因公司測序，測序在ABI 3730測序儀上進行。在Genbank中對測得的序列進行Blast同源比對，鑒定到α類趨化因子基因 CXCL10，該基因cDNA全長為1157bp，自74bp到44^p區段為其開放閱讀框，編碼122個氨基酸，5’端非編碼區長73bp，3’端非編碼區長7Kbp，包含1個mRNA半衰期信號，多聚腺苷酸加尾信號AATAAA和多聚腺苷酸尾巴。4.十個正常組織和經鰻弧菌刺激的肝臟、脾臟和腎臟組織總RNA提起和熒光定量PCR反應。利用Trnzol-A+總RNA提取試劑盒提取鯢魚鰾、眼球、鰭條、鰓、心臟、小腸、 腎臟、肝臟、肌肉、脾臟以及經鰻弧菌刺激的不同時間點肝臟、脾臟和腎臟組織的總RNA， 利用Quant cDNA第一鏈合成試劑盒反轉錄合成cDNA第一鏈為模板進行實時熒光定量 PCR 反應。用鯢魚的 β-actin 基因(上游引物5，-GTGATGAAGCC CAGAGCA-3，(SEQ ID NO. 5)；下游引物5，-CGACCAGAGGCATACAGG-3，(SEQ ID NO. 6))作為對照，確證各個組織逆轉錄的效率都符合要求。CXCLlO基因的熒光定量PCR引物為CXCL10-RT-F (上游引物)5，-GCCTTTCTCGTCTGCCTGCTT-3，(SEQ ID NO. 3) ； CSX10-RT-R (下游引物) 5，-CCGAGTGGTGAGCGTGGATT-3，(SEQ ID NO. 4)。熒光定量反應程序模板設置為 ddCt (Relative Quantitation)Study，反應條件設置為95 度 20s ；95 度 5s，60 度 30s，共 40 個循環。利用2_ΔΔσ法計算相對表達量。發明人運用實時熒光定量PCR技術檢測了 CXCLlO在鯢魚的鰾、眼球、鰭條、鰓、心臟、小腸、腎臟、肝臟、肌肉、脾臟中的轉錄本水平，結果表明該基因在所檢測的十個組織中均有mRNA轉錄本存在，其中在小腸中的豐度最高，其次在眼球中，而在其他組織中則只檢測到較少量的mRNA轉錄本存在(如圖1所示)。另外還檢測到經鰻弧菌刺激后的脾臟和腎臟中的CXCLlO基因表達量呈上升趨勢，明顯較正常水平高，這提示該基因在鯢魚抵抗病原微生物入侵中具有重要功能(如圖2-1、2-2和2-3所示)。盡管發明人已經對本發明的技術方案做了較為詳細的闡述和列舉，應當理解，對于本領域一個熟練的技術人員來說，對上述實施例作出修改和/或變通或者采用等同的替代方案是顯然的，都不能脫離本發明精神的實質，本發明中出現的術語用于對本發明技術方案的闡述和理解，并不能構成對本發明的限制。
權利要求
1.一種鯢魚α類趨化因子基因CXCL10，具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
2.一種鯢魚α類趨化因子基因CXCL10，它編碼的蛋白質具有如SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
3.一種鯢魚α類趨化因子基因CXCLlO的檢測方法，其特征在于，所述的檢測方法至少包括使用一對熒光定量PCR引物，所述的一對熒光定量PCR引物由上游引物和下游引物組成，其中，所述的上游引物具有如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列。
4.如權利要求1或2所述的一種鯢魚α類趨化因子基因CXCLlO在制備鯢魚抵抗病原微生物入侵產品中的應用。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于，所述的病原微生物包括鰻弧菌。
全文摘要
本發明涉及魚類免疫器官中表達的基因序列領域，具體是一種鮸魚α類趨化因子基因CXCL10、檢測方法和應用。本發明的基因的獲得不僅為研究魚類趨化因子CXCL10分子在先天免疫反應中的作用機理奠定基礎，而且通過基因序列可以獲得具有生物活性的蛋白產物，為進一步研究CXCL10的免疫學功能提供理論基礎；此外，本發明的基因還可以用于抗病相關性研究，該基因在鮸魚抵抗病原微生物入侵中具有重要功能。
文檔編號A61P31/04GK102250915SQ20111013987
公開日2011年11月23日 申請日期2011年5月27日 優先權日2011年5月27日
發明者孫悅娜, 徐田軍, 王日昕, 石戈, 程遠志 申請人:浙江海洋學院