專利名稱：鐵調素調節蛋白對機體免疫的調節作用及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體地，涉及鐵調素調節蛋白對機體免疫的調節作用及其應用。
背景技術：
鐵元素是生命生長的必需元素。一直以來，人們認識到，鐵代謝與免疫調控和感染以有千絲萬縷的聯系。近年來的研究顯示，與鐵代謝相關的重要基因也在感染以及免疫調控中起著極為重要的作用。在這些基因中，鐵調素(hepcidin)作為鐵代謝的關鍵調控因子，其缺失導致IL-6和TNF-α的表達上調，在h印cidin敲除小鼠中，外源細菌模式分子的刺激下，小鼠機體發生免疫過激反應,產生膿毒血癥,導致h印cidin敲除小鼠的死亡。鐵調素調節蛋白(Hemojuvelin，HJV)作為BMPs (骨形態發生蛋白，)的共受體，協助增強BMPR(人骨成型蛋白受體，)對BMP的信號傳遞，促進smadl/5/8的磷酸化水平，從而上調hepcidin的表達。目前鐵代謝研究中對HJV調控h印cidin的研究已經有 很多重要發現。HJV是一種跨膜蛋白，HJV的突變導致Hepcidin的表達下降，其缺失的癥狀為:鐵在體內大量蓄積，引發嚴重的遺傳疾病-青少年血色病，在青少年血色病病人尿液里，幾乎無法檢測出Hepcidin的含量；低水平的Hepcidin引起小腸對鐵的吸收增加以及巨曬細胞內鐵釋放增力口，導致鐵離子在各個臟器中蓄積。由于脾臟中富含巨噬細胞，所以鐵含量比正常值低。另夕卜，HJV敲除小鼠模型的建立，確證了該基因的缺失會導致血色病。雖然鐵代謝和免疫系統一直以來都有著密不可分的聯系，但是HJV和免疫系統之間的聯系還很不清晰，未見報道。因此本領域迫切需要研究鐵調素調節蛋白對機體免疫的調節作用及其應用。

發明內容
本發明的目的是提供一種鐵調素調節蛋白或其激動劑的用途。本發明的另一目的是一種鐵調素調節蛋白拮抗劑的用途。本發明的另一目的是提供一種篩選調節免疫細胞殺菌功能的化合物的和調節炎性反應相關蛋白水平或活性的化合物的方法。在本發明的第一方面，提供了一種鐵調素調節蛋白或其激動劑的用途，用于制備免疫調節劑，或用于制備抗感染藥物組合物。在另一優選例中，所述鐵調素調節蛋白或其激動劑(或所述的免疫調節劑，或所述的組合物)還用于:(B1)制備白介素IL-12的激動劑組合物；和/或(Id1)促進干擾素IFN Y的產生和分泌；和/或(C1)上調一氧化氮合酶活性；和/或
(Cl1)促進一氧化氮NO的產生；和/或(θι)促進免疫細胞的殺菌功能。在另一優選例中，所述的鐵調素調節蛋白選自下組:(A)氨基酸序列如SEQ ID NO:1、3、5、7任一所示的多肽；(B)將SEQ ID NO:1、3、5、7任一所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的鐵調素調節蛋白衍生物，或其活性片段。在另一優選例中，所述的鐵調素調節蛋白編碼序列選自下組:(Al)編碼如SEQ ID NO:1、3、5、7任一所示多肽的多核苷酸序列；(BI)如SEQ ID NO :2、4、6、8任一所示的多核苷酸序列；(Cl)與(Al)或(BI)所述的多核苷酸序列互補的多核苷酸。在另一優選例中，所述鐵調素調節蛋白來源于人或非人哺乳動物。在另一優選例中，所述鐵調素調節蛋白來源于小鼠，大鼠，或家鼠。在另一優選例中，所述鐵調素調節蛋白為s亞型(S-HJV)。在另一優選例中，所述鐵調素調節蛋白為人S-HJV或小鼠s-HJV。在本發明的第二方面，提供了一種鐵調素調節蛋白拮抗劑的用途，用于制備下調白介素IL-12的活性的組合物，或用于制備白介素IL-12的拮抗劑組合物。在另一優選例中，所述組合物還用于:(a2)降低干擾素IFN Y的產生和分泌；和/或
(b2)下調一氧化氮合酶活性；和/或(c2)抑制一氧化氮NO的產生；和/或(d2)抑制免疫細胞的殺菌功能。本發明還提供了一種鐵調素調節蛋白拮抗劑的用途，用于制備降低干擾素IFNY的產生和分泌的組合物。在另一優選例中，所述組合物還用于:(a3)下調白介素IL-12的活性；和/或(b3)下調一氧化氮合酶活性；和/或(C3)抑制一氧化氮NO的產生；和/或(d3)抑制免疫細胞的殺菌功能。在本發明的第三方面，提供了一種鐵調素調節蛋白、或其激動劑、或其拮抗劑的用途，用于:(I)調節白介素IL-12的活性；和/或(2)調節干擾素IFN Y的產生和分泌；和/或(3)調節一氧化氮合酶活性；和/或(4)調節NO的產生；和/或(5)調節免疫細胞的殺菌功能。在本發明的第四方面，提供了一種方法，所述方法用于調節白介素IL-12活性、調節干擾素IFNy的產生和分泌、調節一氧化氮合酶活性、調節NO的產生、調節免疫細胞的殺菌功能，所述方法包括步驟:改變鐵調素調節蛋白的表達或活性；或添加鐵調素調節蛋白的激動劑；或添加鐵調素調節蛋白的拮抗劑。
在本發明的第五方面，提供了一種篩選調節免疫細胞殺菌功能的化合物的方法，包括步驟:(i)在測試組中，在測試化合物存在情況下培養免疫細胞，并測定鐵調素調節蛋白的水平或活性；并且在對照組中，在不存在測試化合物情況下培養免疫細胞，并測定鐵調素調節蛋白的水平或活性；(ii)比較測試組和對照組的鐵調素調節蛋白水平或活性，如果測試組的鐵調素調節蛋白水平或活性顯著高于對照組，則提示該物質是上調免疫細胞殺菌功能的化合物；如果測試組的鐵調素調節蛋白水平或活性顯著低于對照組，則提示該物質是下調免疫細胞殺菌功能的化合物。在另一優選例中，所述的方法還包括步驟:(iii)測定在測試化合物存在情況下免疫細胞對細菌的殺傷能力，從而對測試化合物的調節功能進行確認。在本發明的第六方面，提供了一種篩選調節炎性反應相關蛋白水平或活性的化合物的方法，其中殺傷相關相關蛋白是干擾素IFNy或一氧化氮合酶，包括步驟:(a)在測試組中，在測試化合物存在情況下培養免疫細胞，并測定鐵調素調節蛋白的水平或活性；并且在對照組中，在不存在測試化合物情況下培養免疫細胞，并測定鐵調素調節蛋白的水平或活性；(b)比較測試組和對照組的鐵調素調節蛋白水平或活性，如果測試組的鐵調素調節蛋白水平或活性顯著高 于對照組，則提示該物質是上調炎性反應相關蛋白的化合物；如果測試組的鐵調素調節蛋白水平或活性顯著低于對照組，則提示該物質是下調炎性反應相關蛋白的化合物。在另一優選例中，所述的方法還包括步驟:(c)測定在測試化合物存在情況下免疫細胞中所述炎性反應相關蛋白的水平或活性，從而對測試化合物的調節功能進行確認。應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。


下列附圖用于說明本發明的具體實施方案，而不用于限定由權利要求書所界定的本發明范圍。圖1為HJV敲除小鼠和正常小鼠對細菌的易感性測試結果，a)為正常小鼠和HJV敲除的小鼠對鼠傷寒沙門氏菌的易感性結果山)為正常小鼠和HJV敲除的小鼠對大腸桿菌的易感性結果；c)為正常小鼠和HJV敲除的小鼠對金黃色葡萄球菌的易感性結果；d)為正常小鼠和HJV敲除的小鼠的腹腔大腸桿菌數目統計結果；e)為正常小鼠和HJV敲除的小鼠各主要臟器中大腸桿菌數目統計結果；f)為了排除鐵代謝的影響，在低鐵處理的小鼠體內進行了細菌致死實驗，當低鐵喂養的小鼠機體鐵水平和野生型一致時，在某些臟器中甚至更低時，HJV敲除小鼠依然呈現細菌易感性。圖2顯示細菌刺激后小鼠體內細胞因子的變化，IO8E.Co I i腹腔注射后，不同時間點眼眶采血，ELISA 檢測細胞因子水平 a) TNFa (1.5h)、b) IL_6(2.5h)、c) IFNy (6h)、d)IL-18(6h)、e)IL-12p40(2.5h)細菌感染6h后，流式檢測細胞內IFN γ表達水平，以及f)體外熱滅活菌刺激后，western檢測巨噬細胞內信號通路的改變結果。圖3為與對照組小鼠相比，HJV敲除小鼠感染后體內細胞功能變化結果；a) IO8E.coli腹腔注射后，外周血內白細胞變化；b)體外細胞吞噬功能檢測；c)體外細胞殺菌功能檢測；d)熱滅活細菌體外刺激巨噬細胞24h，細胞因子IFN Y分泌；e)熱滅活細菌體外刺激巨噬細胞24h，細胞因子IL-6分泌；f) western檢測巨噬細胞內IFN Y _stat4信號通路的改變；g)體外巨噬細胞NO分泌檢測；h) western檢測巨噬細胞內iNOS和p38信號通路的改變。圖4顯示HJV在免疫細胞中的表達及調控模式；a)正常小鼠各種免疫細胞通過表面標記通過流式分離，分別檢測細胞內HJV的表達水平；在熱滅活細菌刺激下，野生型小鼠肝臟中HJV表達b)，巨噬細胞內HJV表達c)，肝臟中FPN表達d)，巨噬細胞內FPN表達e)，f)&g)熱滅活細菌的刺激下，過表達HJV的Raw264.7細胞中iNOS的表達更多h)，也分泌更
多NO。圖5顯示s-HJV表達純化及下調Hepcidin表達的功能檢測結果,其中，圖5a顯示分子篩純化及蛋白膠檢測；圖5b顯示s-HJV作用于原代培養肝細胞，下調H印cidin表達，具有劑量效應；圖5c顯示s-HJV可以增強HJV-/-小鼠抗感染能力。
具體實施例方式本發明人經過廣泛而深入的研究，首次意外地發現，在感染狀態下，HJV在免疫細胞中表達增加，協助IL-12促進IFNy的生成，從而激活免疫細胞，表達iNOS，分泌NO，充分行使殺菌功能，因此HJV可以作為一個免疫調控中的重要分子。具體地，本發明涉及一種鐵調素調節蛋白或其激動劑、或其拮抗劑的用途，鐵調素調節蛋白或其激動劑用于制備上調白介素IL-12的活性的組合物，或用于制備白介素IL-12的激動劑組合物；鐵調素調節蛋白拮抗劑用于制備下調白介素IL-12的活性的組合物，或用于制備白介素IL-12的拮抗劑組合物，本發明還提供了一種篩選調節免疫細胞殺菌功能的化合物的和調節炎性反應相關蛋白水平或活性的化合物的方法。鐵調素鐵調素是一個近年新發現的小分子多肽，主要由肝臟合成。它是肝臟、小腸和網狀內皮系統之間鐵代謝調節信號的傳遞者，也是機體鐵平衡的中心調節者。當任何原因引起循環鐵增加時，肝細胞增加合成和分泌鐵調素進入血液，鐵調素經血流運輸到鐵的吸收部位十二指腸及鐵儲存的主要部位巨噬細胞，與細胞膜上的膜鐵轉運蛋白I (Feiroportin I)結合，并降解膜鐵轉運蛋白1，從而抑制鐵從腸腔進入血液，同時減少巨噬細胞分泌鐵進入血液，使血液鐵水平降低。當循環鐵較低時，肝臟合成與分泌的鐵調素減少，腸吸收上皮相關蛋白降解減少，腸鐵吸收量增加，使鐵水平回復到正常。HJV基因及鐵調素調節蛋白HJV基因即L0C138738基因，人類HJV基因位于染色體lq21區，長約2.6kb，包含4個外顯子，其轉錄后可 形成5個mRNA異構體。HJV基因的產物是鐵調素調節蛋白(hemojuvelin^HJV基因突變容易引起年輕型血素沉著癥，這是由于鐵調素表達嚴重下降，進而增加鐵吸收，終致組織嚴重鐵過負荷及相關癥狀。因此HJV基因突變引起的鐵調素表達障礙是這類疾病的根本原因。鐵代謝的重要調控因子HJV作為BMPs的共同受體，可通過SMADs作用于鐵穩態的關鍵激素Hepcidin的啟動子，調控其表達。人體HJV突變或小鼠HJV基因敲除均可引發Hepcidin下調，并導致過量鐵離子在器官蓄積。盡管HJV和hepcidin的表達是正相關作用，但是它們受調控作用卻是截然不同的，鐵水平可以調控hepcidin的表達，但是對HJV的表達卻沒有作用，而炎癥狀態下肝臟中hepcidin的表達水平被上調，而肝臟中的HJV則被下調，提示了 HJV在炎癥免疫中存在特有的作用。 在本發明中，術語“鐵調素調節蛋白”、“鐵調素調節多肽”等可互換使用，指具SEQID NO:1或3所示序列的蛋白或多肽或其衍生物和活性片段。在未特別指出時，術語“鐵調素調節蛋白”包括野生型和突變型蛋白。鐵調素調節蛋白具有兩種亞型，定位于細胞膜的HJV (m-HJV)和可溶形式的HJV (s-HJV)。s-HJV和m_HJV在H印cidin的調控作用上相拮抗。s-HJV的氨基酸序列如SEQ ID NO:5或7所示，也包括其衍生物、活性片段，突變片段。如本文所用，“分離的”是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。如本文所用，“分離的鐵調素調節蛋白或多肽”是指CYP97A4蛋白基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化鐵調素調節蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產生單一的主帶。本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發明還包括所述蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語“片段”、“衍生物 ”和“類似物”是指基本上保持天然鐵調素調節蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是:(i)有一個或幾個保守或非保守性氨基酸殘基(優選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的；(ii)在一個或幾個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽；(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。鐵調素調節蛋白編碼序列選自下組:(Al)編碼如SEQ ID NO:1、3、5、7任一所示多肽的多核苷酸序列;(BI)如SEQ ID NO:2、4、6或8任一所不的多核苷酸序列；(Cl)與(Al)或(BI)所述的多核苷酸序列互補的多核苷酸。
NO內源性NO是一種極不穩定的化合物，其半衰期只有數秒(一般在5秒以下)，體內多種組織和細胞均能合成內源性NO (如巨噬細胞)。在合成NO的細胞中，以L-精氨酸(L-Arg)和分子氧為底物，在一氧化氮合酶(NOS)和還原型輔酶II (NADPH)存在的條件下，生產中間體對羥基L-Arg，后者與02發生反應，生成等克分子量的NO和L-瓜氨酸，其中NOS是NO生成的最主要限速因子，NADPH、黃素單核苷酸(FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)是重要的輔助因子。NO是一種自由基氣體，其化學性質非常活潑，能迅速與分子氧、超氧陰離子以及鐵、銅、鎂等發生反應，氧化生成終末代謝物硝酸鹽(NO)和亞硝酸鹽(NO)而失活。免疫細胞(immunocyte)免疫細胞是參與免疫應答或與免疫應答相關的細胞，主要包括淋巴細胞、樹突狀細胞、單核/巨噬細胞、粒細胞、肥大細胞等。在腹腔中，各類血細胞組成成分分別為，巨噬細胞90%，淋巴細胞5-10%，多形核粒細胞5 %。巨噬細胞是天然免疫系統的重要組成部分，對于識別和清除外源微生物是至關重要的。在腹腔感染發生時，巨噬細胞通過吞噬和殺傷功能來清除微生物。當巨噬細胞被激活，它們生成一氧化氮、氧自由基和抗菌肽等各種物質行使殺傷功能。早在20世紀90年代，人們就已經認識到一氧化氮的抗菌作用。很多種細胞都可以產生一氧化氮，具有放松血管，神經傳遞和抑制血小板聚集等作用。在天然免疫中，巨噬細胞合成和分泌的一氧化氮起到了重要的殺菌作用。作為一個非特異性的保護機制，一氧化氮可以通過結合巰基和金屬活性中心來阻斷微生物的呼吸和DNA復制過程，從而殺滅各種微生物，包括革蘭氏陰性菌和陽性菌。在巨噬細胞中，主要是誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)負責合成一氧化氮。和正常 小鼠相比，缺乏iNOS的小鼠對于感染更加敏感，不能有效控制細菌在體內的繁殖。當感染發生時，作為天然免疫的重要組成部分的細胞因子分泌增加，包括TNF-a、IL-6和IFNy等。作為重要的原炎癥因子IFN Y可以通過全面激活巨噬細胞功能來抗菌，其中一個重要部分就是上調iNOS的表達，從而促進一氧化氮的合成和分泌。誘導IFNy分泌的因子主要有兩個分別為IL-18和IL-12。它們分別通過p38和stat4的磷酸化通路來調控IFN Y的分泌。IFN Y ( Y 干擾素)IFN-Y具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調節和細胞抑制活性，IFN-Y誘導巨噬細胞一氧化氮合酶(iNOS)的產生，促進NO的合成，IFN-Y還可誘導小膠質細胞星形細胞的iNOS產生，與中樞神經系統的某些疾病的發生或保護作用有關。IFN在完全沒有內毒素時不能刺激IL-1轉錄，反而在轉錄水平抑制IL-1自身誘導的IL-1產生，但IFN-Y可增加LPS誘導的IL-1轉錄翻譯和分泌。應用本發明提供了一種鐵調素調節蛋白或其激動劑的用途，所述鐵調素調節蛋白或其激動劑用于制備白介素IL-12的激動劑組合物，所述組合物還用于:促進干擾素IFNy的產生和分泌；上調一氧化氮合酶活性；促進一氧化氮NO的產生；促進巨噬細胞的殺菌功能。本發明還提供了一種鐵調素調節蛋白拮抗劑的用途，所述拮抗劑用于制備白介素IL-12的拮抗劑組合物；降低干擾素IFNy的產生和分泌；下調一氧化氮合酶活性；抑制一氧化氮NO的產生；抑制巨噬細胞的殺菌功能。
本發明還提供了一種篩選調節巨噬細胞殺菌功能的化合物的方法，在本發明的一個優選例中，包括步驟:(i)在測試組中，在測試化合物存在情況下培養巨噬細胞，并測定鐵調素調節蛋白的水平或活性；并且在對照組中，在不存在測試化合物情況下培養巨噬細胞，并測定鐵調素調節蛋白的水平或活性；(ii)比較測試組和對照組的鐵調素調節蛋白水平或活性，如果測試組的鐵調素調節蛋白水平或活性顯著高于對照組，則提示該物質是上調巨噬細胞殺菌功能的化合物；如果測試組的鐵調素調節蛋白水平或活性顯著低于對照組，則提示該物質是下調巨噬細胞殺菌功能的化合物；(iii)測定在測試化合物存在情況下巨噬細胞對細菌的殺傷能力，從而對測試化合物的調節功能進行確認。本發明還提供了一種篩選調節炎性反應相關蛋白水平或活性的化合物的方法，其中殺傷相關蛋白是干擾素IFNy或一氧化氮合酶，在本發明的一個優選例中，包括步驟:(a)在測試組中，在測試化合物存在情況下培養巨噬細胞，并測定鐵調素調節蛋白的水平或活性；并且在對照組中，在不存在測試化合物情況下培養巨噬細胞，并測定鐵調素調節蛋白的水平或活性；(b)比較測試組和對照組的鐵調素調節蛋白水平或活性，如果測試組的鐵調素調節蛋白水平或活性顯著高于對照組，則提示該物質是上調炎性反應相關蛋白的化合物；如果測試組的鐵調素調節蛋白水平或活性顯著低于對照組，則提示該物質是下調炎性反應相關蛋白的化合物；(C)測定在測試化 合物存在情況下巨噬細胞中所述炎性反應相關蛋白的水平或活性，從而對測試化合物的調節功能進行確認。本發明的主要優點:(I)提供鐵調素調節蛋白或其激動劑、或其拮抗劑的用途；(2)提供體外篩選調節巨噬細胞殺菌功能的化合物的和調節炎性反應相關蛋白水平或活性的化合物的方法。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如 Sambrook 等人，分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。材料與方法1.小鼠腹腔巨噬細胞的分離、培養與處理取7-8 周的小鼠,腹腔注射 4% FTG (Fluid Thioglycollate medium),誘導 72h后，斷頸處死，75%酒精浸泡5min，剪開腹部皮膚至胸部，注射IOml預熱的PBS緩沖液，輕揉20次，用注射器將腹腔液吸出，吹散，300g條件下，室溫離心lOmin，用全培養基重懸細胞。培養基成分:RPMI1640 (Gibco)、10% FBS(Gibco)、2mM 谷氨酸、100 μ g/mL 鏈霉素、10Ouni ts/mT,青霉素(Gibco)。細胞鋪板，培養于37°C、5% CO2的細胞培養箱(Thermo)。I小時后，換液，將未貼壁的其余細胞洗去，剩余的細胞即可用于實驗。
2.熱致死細菌制備將E.coli置于37°C搖床，過夜培養，次日于3500rpm條件下，室溫離心5min，棄去上清，用PBS重懸，并于3500rpm條件下室溫離心5min，重復洗滌兩次，最終用PBS重懸。在95°C條件下，熱處理30min，置于_20°C冰箱保存備用。3.體外細胞因子和一氧化氮檢測體外分離的腹腔巨噬細胞，用熱滅活細菌處理24h后，取上清，用ELISA試劑盒(R&D)檢測細胞因子的濃度,Griess Reagent (碧云天公司)顯色反應檢測細胞上清液中的NO濃度。4.體內細胞因子檢測108E.coli腹腔注射小鼠，在不同時間點眼眶采血，采集的血液于室溫放置2h;7000rpm條件下，4°C離心20分鐘，取上清，ELISA試劑盒R&D)檢測血清中細胞因子濃度。5.組織及細胞mRNA的抽提、反轉錄和Real-time PCR檢測基因表達用TRIZOL Reagent (Invitrogen)抽提細胞的總 RNA。DNase37°C處理提取的 RNA,30min,以除去殘余的DNA,加反應停止液(stop solution) Invitrogen65°C處理IOmin,滅7舌 DNclSG ο

用oligo(dT)18 引物(Takara)和 M-MLV 逆轉錄酶(promega)反轉成 cDNA。用Real-time System(Bio-Rad)定量檢測基因表達。用相對定量的方法，用iQTM SYBR Green Supermix(Bio-Rad)檢測基因的表達，并以beta-actin作為內參。6.Western Blot檢測蛋白的表達用強RIPA裂解液來裂解細胞(碧云天公司)，裂解前加入蛋白酶抑制劑PMSF(Sigma)和Cocktail (Sigma)，所有的操作均在冰上進行，蛋白保存于_80°C，并分裝蛋白，防止反復凍融。跑膠前加入上樣緩沖液，混勻，直接上樣，樣品不能加熱變性。10% SDSPAGE膠分
離蛋白。7.巨噬細胞吞噬功能檢測分離的腹腔巨噬細胞，在不含抗生素的培養基中按照MOI = 10: I加入細菌(E.col1-GFP)，孵育45分鐘后，去上清，PBS洗滌3遍，將細胞從板上刮下，流式檢測綠色熒光。8.巨噬細胞殺菌功能檢測在重復的兩塊板上同時進行，分離的腹腔巨噬細胞，在不含抗生素的培養基中按照MOI = 10: I加入細菌(E.col1-GFP)，孵育20分鐘后，去上清，PBS洗滌3遍。其中一塊板中的細胞被裂解，梯度稀釋，涂板37°C過夜，另一塊再孵育90分鐘，取上清后，裂解細胞，梯度稀釋，涂板37°C過夜。9.HJV敲除小鼠的構建本領域技術人員可以使用通用和成熟的方法構建HJV敲除小鼠，如文獻A mousemodel of juvenile hemochromatosis Franklin W.Huang, Jack L Pinkus，GeraldineS.PinkusiMark D.Fleming，Nancy C.Andrews J Clin Invest.2005 ；115(8):2187-2191所述。
實施例1HJV敲除小鼠對細菌易感性檢測為了探究HJV在免疫系統中的作用，本發明人用各種細菌(鼠傷寒沙門氏菌，大腸桿菌，金黃色葡萄球菌)感染HJV敲除的小鼠。結果(圖1)發現，HJV敲除的小鼠對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌都具有易感性。與正常小鼠相比，從腹腔注射鼠傷寒沙門氏菌(108)、大腸桿菌(108)和金黃色葡萄球菌(I X IO8)都會導致HJV敲除小鼠的過早死亡。圖1a為正常小鼠和HJV敲除的小鼠對鼠傷寒沙門氏菌的易感性結果；圖1b為正常小鼠和HJV敲除的小鼠對大腸桿菌的易感性結果；圖1c為正常小鼠和HJV敲除的小鼠對金黃色葡萄球菌的易感性結果。圖1a-圖1c的橫坐標為注射時間，縱坐標為小鼠的存活率(％ )。臟器蓄積結果表明。腹腔注射大腸桿菌，12h后，細菌在HJV敲除小鼠的腹腔及各主要臟器中蓄積增多(圖1d和圖1e)，圖1d為正常小鼠和HJV敲除的小鼠的腹腔大腸桿菌數目統計結果，圖1e為正常小鼠和HJV敲除的小鼠各主要臟器中大腸桿菌數目統計結果。該結果提示，HJV敲除的小鼠，其天然免疫實缺陷的，導致細菌在體內過度增殖，最終使得HJV敲除的小鼠過早死亡。由于HJV敲除的小鼠機體內鐵水平較高，有利于細菌生長，為了排除鐵代謝的影響，本發明人在低鐵處理的小鼠體內進行了細菌致死實驗，當低鐵喂養的小鼠機體鐵水平和野生型一致(未列出)，在某些臟器中甚至更低時，HJV敲除小鼠依然易感(圖1f)。實施例2小鼠體內細胞因子的變化體液免疫是天然免疫的重要組成部分之一，在機體發生感染后，細菌的入侵會誘發機體內細胞因子的表達上調，細胞因子分泌增多，從而激活各種免疫細胞，清除入侵的細菌。將I X IO8的E.coli腹腔注射小鼠后，在不同的時間點進行眼眶取血，室溫放置l-2h, 7000rpm條件下，4°C離心20min,取上清,用Elisa試劑盒檢測細胞因子濃度。結果表明(圖2)，與正常的感染細菌的小鼠相比，感染細菌后的HJV敲除小鼠體內原炎癥因子TNFa和IL-6的血清濃度(圖2a&2b)比野生型小鼠高，IFNy的分泌減少(圖2c)，顯示IFNy的生成有缺陷，而它的兩個誘導因子IL-18和IL-12的分泌卻是正常的(圖 2d&2e)。為了控制定量的細菌數以及模擬體內的刺激模式，在體外實驗中本發明人使用熱滅活細菌作為刺激源。結果表明，在熱滅活細菌的刺激下，巨噬細胞內免疫調控通路的蛋白磷酸化水平發生了變化，IL-12誘導stat4的磷酸化水平降低，而IL-18誘導IFN Y的關鍵因子P38的磷酸化水平和正常組相似(圖2f)。圖2顯示細菌刺激后小鼠體內細胞因子的變化，IO8E.coli腹腔注射后，不同時間點眼眶采血，ELISA 檢測細胞因子水平 a) TNF α (1.5h)、b) IL-6 (2.5h)、c) IFN y (6h)、d)IL-18(6h)、e)IL-12p40(2.5h)細菌感染6h后，流式檢測細胞內IFN γ表達水平，以及f)體外熱滅活菌刺激后，western檢測巨噬細胞內信號通路的改變結果。實施例3IFNY分泌減少導致巨噬細胞殺傷功能減弱IFNy在免疫調控中的主要作用是激活巨噬細胞行使殺傷功能。將IO8的E.coli注射小鼠腹腔后，HJV敲除小 鼠的外周血內細胞遷移增多，且比正常對照組高一倍(圖3a)。體外檢測巨噬細胞的吞噬功能，發現HJV敲除小鼠的巨噬細胞的吞噬功能也略有增強(圖3b)，而對外源細菌的殺傷功能變弱(圖3c)。IFNy在早期主要由自然殺傷(NK)細胞分泌，作為IFNy響應細胞的巨噬細胞也會自分泌，從而發生自激活。為了探究HJV敲除巨噬細胞殺傷功能減弱是不是由于IFNy的分泌減少，體外用熱滅活細菌刺激對照組和HJV敲除組的巨噬細胞，檢測結果顯示HJV敲除組的巨噬細胞自分泌IFNy的能力減弱(圖3d)，而其它原炎癥因子分泌正常(圖3e)。IFNy對于激活巨噬細胞，產生抑菌因子具有非常重要的作用，和IFNy敲除小鼠相似，HJV敲除小鼠不能有效控制外源微生物在體內過度增殖，和對照組小鼠相比，HJV敲除小鼠死亡過早。熱滅活細菌刺激下，HJV敲除巨噬細胞內IFN Y _stat4信號通路被削弱(圖3f)，其下游的重要的活性酶iNOS的表達減少，雖然通過p38的誘導通路沒有太多變化(圖3h)，但是也不能挽救抑菌因子NO分泌減少的狀況(圖3g)。這一結果解釋了巨噬細胞殺菌功能減弱的表型。圖3為與對照組小鼠相比，HJV敲除小鼠感染后體內細胞功能變化結果；a) IO8E.coli腹腔注射后，外周血內白細胞變化；b)體外細胞吞噬功能檢測；c)體外細胞殺菌功能檢測；d)熱滅活細菌體外刺激巨噬細胞24h，細胞因子IFN Y分泌；e)熱滅活細菌體外刺激巨噬細胞24h，細胞因子IL-6分泌；f ) western檢測巨噬細胞內IFN Y _stat4信號通路的改變；g)體外巨噬細胞NO分泌檢測；h) western檢測巨噬細胞內iNOS和p38信號通路的改變。實施例4HJV在免疫調節對抗外源微生物的作用本發明人通過細胞膜表面分子標記，免疫細胞流式分離檢測發現，HJV在免疫細胞中存在廣譜的較高水平表達(圖4a) ;HJV在肝細胞中的表達對于調控機體鐵代謝起到決定性作用，在炎癥刺激狀態下，肝臟中的HJV表達是下調的(圖4b);在炎癥條件下，HJV在巨曬細胞中的表達是上調的(圖4c);而鐵代謝中另一相關基因鐵轉運蛋白(Ferroportin)在炎癥條件下，無論是肝臟還是巨噬細胞中均下調(圖4d&4e)。由于感染狀態下，HJV表達上調，本發明人在體外克隆HJV的質粒，在Raw264.7細胞中過表達。結果顯示，在熱滅活細菌或細菌模式分子LPS的刺激下，過表達HJV的Raw264.7細胞比轉入空載體的細胞表達更多的iNOS，分泌更多的N0(圖4f&4g)，由于Raw264.7含有內源性的HJV表達，在熱滅活細菌的強刺激下，和轉染空載體的對照相比，過表達HJV的Raw264.7分泌NO的增加幅度不是很大，但也具有顯著性差異。圖4顯示HJV在免疫細胞中的表達及調控模式；a)正常小鼠各種免疫細胞通過表面標記通過流式分離，分別檢測細胞內HJV的表達水平；在熱滅活細菌刺激下，野生型小鼠肝臟中HJV表達b)，巨噬細胞內HJV表達c)，肝臟中FPN表達d)，巨噬細胞內FPN表達e)，f&g)熱滅活細菌的刺激下，過表達HJV的Raw264.7細胞中iNOS的表達更多h)，也分泌更多NO。實施例5s-HJV蛋白增強HJV+小鼠抗感染能力HJV具有兩種亞型，定位于細胞膜的HJV (m-HJV)和可溶形式的HJV (s_HJV)。s_HJV和m-HJV在H印cidin的調控作用上相拮抗。將s-HJV克隆入pet28a載體中，在BL21(DE3)系統中表達，通過鎳柱、離子交換和分子篩分離純化。
圖5a顯示s-HJV的分子篩純化圖譜，總共分離得到7個主峰，分別收集檢測鑒定，其中5號峰得到分子量為32kD的s-HJV蛋白。體外細胞實驗顯示重組表達的s-HJV具有下調h印cidin表達的生物學活性(圖5b)。將體外重組表達的可溶性HJV(s-HJV)預處理小鼠(腹腔注射生理鹽水或者s-HJV 7mg/kg) 2h后，腹腔注射鼠傷寒桿菌(3*106/只)，實驗結果顯示s-HJV注射組存活時間延長(圖5c)。以上結果顯示s-HJV具有抗感染活性。討論鐵代謝和機體免疫一直以來息息相關，鐵代謝相關基因不僅通過調控機體鐵代謝和分布來參與機體免疫，近年來的研究發現，它們本身對機體免疫也有調控作用。本發明人經過廣泛而深入的研究，結果表明，HJV(HemojuveIin)敲除小鼠不能像正常小鼠一樣抵御外源微生物的感染，鐵調素調節蛋白作為一個重要的鐵代謝調控基因，其缺失不僅會導致鐵在機體內的蓄積，而且導致機體免疫缺陷。為了排除機體鐵對于體內細菌增殖的影響，本發明人用低鐵喂養HJV敲除小鼠，8周后，小鼠體內鐵水平顯著低于正常小鼠機體鐵水平。進行腹腔感染大腸桿菌的致死試驗，結果顯示，機體內過多的鐵增加了 HJV敲除小鼠對細菌的易感，但卻不是決定性因素。熱滅活細菌預處理小鼠得到的急性相血清抑菌試驗顯示，和正常小鼠相比，HJV敲除小鼠的血清含有的抑菌因子的功能沒有缺陷，表明HJV敲除小鼠體內較低水平的hepcidin，在感染后會有很高很快的回升，并不是直接導致HJV敲除小鼠易感的主要因素。以上實驗結果都推向一個結論，HJV本身在機體免疫中行使重要的作用。腹腔注射活細菌，HJV敲除小鼠比正常小鼠死亡更多更快，而同等劑量熱滅活細菌卻不會導致這一表型，通過體內增殖試驗，本發明人發現細菌在HJV敲除小鼠體內增殖的更快，顯示HJV敲除小鼠存在免疫缺陷。通過感染后原炎癥因子的血清水平檢測發現，HJV敲除小鼠體內的IL-6和TNF α的分泌不僅沒有減少，還略有增多，但是IFN Y的分泌是減少的，而它的兩個重要調控因子IL-18和IL-12的分泌卻是正常的，巨噬細胞中也有表達分泌。體外檢測試驗顯示HJV敲除的巨噬細胞完全不分泌IFN Y。通過westernblot檢測發現，在巨噬細胞內，IL-18誘導IFN Y的通路P38的磷酸化是正常的，而IL-12誘導stat4的磷酸化水平減弱。上述結果提示，HJV在IL-12誘導IFN Y分泌的途徑中起到重要作用。IFNy對于激活巨噬細胞起到非常重要的作用，而巨噬細胞在腹腔中大量存在，是腹腔感染的第一道防線，本發明人分別從遷移，吞噬和殺菌三個方面來檢驗HJV敲除巨噬細胞的功能。感染后HJV敲除小鼠血液中的白細胞含量比正常小鼠要高一倍，體外實驗顯示HJV敲除的巨噬細胞吞噬能力較正常巨噬細胞略高，但在殺菌功能上有缺陷。IFNy的分泌直接導致iNOS的合成及其產物NO的分泌，由于NO是巨噬細胞的重要抑菌因子之一，IFN Y誘導iNOS的信號通路關鍵因子statl的磷酸化水平也降低了，相應的iNOS表達水平降低，NO分泌減少，巨噬細胞不能有效殺死細菌，從而導致細菌過度增殖。實驗發現，熱滅活細菌可以在體外誘導巨噬細胞內HJV表達水平的上調。而另一鐵代謝相關基因FPN的表達都是下調的，過表達HJV的Raw264.7細胞中會分泌更多的NO，由于熱滅活細菌的強刺激，Raw264.7細胞中本底的HJV表達也會上升，NO分泌已經達到一個很高水平，過表達的細胞中只有小幅度的增加，但具有顯著性差異。因此本發明人的研究成果顯示，在感染狀態下，HJV在巨噬細胞中表達增加，協助幾_12促進正^^的生成，從而激活巨噬細胞，表達iNOS，分泌NO，充分行使殺菌功能。這樣HJV將鐵代謝和免疫調控緊密聯系在一起，作為一個免疫調控中的重要分子。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范 圍。
權利要求
1.一種鐵調素調節蛋白或其激動劑的用途，其特征在于，用于制備免疫調節劑，或用于制備抗感染藥物組合物。
2.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述鐵調素調節蛋白或其激動劑還用于: (B1)制備白介素IL-12的激動劑組合物；和/或 (bj促進干擾素IFNy的產生和分泌；和/或 (C1)上調一氧化氮合酶活性；和/或 (Cl1)促進一氧化氮NO的產生；和/或 G1)促進免疫細胞的殺菌功能。
3.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的鐵調素調節蛋白選自下組: (A)氨基酸序列如SEQID NO:1、3、5、7任一所示的多肽； (B)將SEQID NO:1、3、5、7任一所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的鐵調素調節蛋白衍生物，或其活性片段。
4.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述鐵調素調節蛋白為s亞型(S-HJV)。
5.一種鐵調素調節蛋白拮抗劑的用途，其特征在于，用于制備下調白介素IL-12的活性的組合物，或用于制備白介素IL-12的拮抗劑組合物。
6.如權利要求5所述的用途，其特征在于，所述組合物還用于: (a2)降低干擾素IFNy的產生和分泌；和/或 (b2)下調一氧化氮合酶活性；和/或 (C2)抑制一氧化氮NO的產生；和/或 (d2)抑制免疫細胞的殺菌功能。
7.一種鐵調素調節蛋白、或其激動劑、或其拮抗劑的用途，其特征在于，用于: (1)調節白介素IL-12的活性；和/或 (2)調節干擾素IFNy的產生和分泌；和/或 (3)調節一氧化氮合酶活性；和/或 (4)調節NO的產生；和/或 (5)調節免疫細胞的殺菌功能。
8.一種方法，所述方法用于調節白介素IL-12活性、調節干擾素IFNy的產生和分泌、調節一氧化氮合酶活性、調節NO的產生、調節免疫細胞的殺菌功能，其特征在于，所述方法包括步驟:改變鐵調素調節蛋白的表達或活性；或添加鐵調素調節蛋白的激動劑；或添加鐵調素調節蛋白的拮抗劑。
9.一種篩選調節免疫細胞殺菌功能的化合物的方法，其特征在于，包括步驟: (i)在測試組中，在測試化合物存在情況下培養免疫細胞，并測定鐵調素調節蛋白的水平或活性；并且在對照組中，在不存在測試化合物情況下培養免疫細胞，并測定鐵調素調節蛋白的水平或活性； ( )比較測試組和對照組的鐵調素調節蛋白水平或活性，如果測試組的鐵調素調節蛋白水平或活性顯著高于對照組，則提示該物質是上調免疫細胞殺菌功能的化合物；如果測試組的鐵調素調節蛋白水平或活性顯著低于對照組，則提示該物質是下調免疫細胞殺菌功能的化合物。
10.一種篩選調節炎性反應相關蛋白水平或活性的化合物的方法，其中殺傷相關相關蛋白是干擾素IFNy或一氧化氮合酶，其特征在于，包括步驟: (a)在測試組中，在測試化合物存在情況下培養免疫細胞，并測定鐵調素調節蛋白的水平或活性；并且在對照組中，在不存在測試化合物情況下培養免疫細胞，并測定鐵調素調節蛋白的水平或活性； (b)比較測試組和對照組的鐵調素調節蛋白水平或活性，如果測試組的鐵調素調節蛋白水平或活性顯著高于對照組，則提示該物質是上調炎性反應相關蛋白的化合物；如果測試組的鐵調素調節蛋白水平或活性顯著低于對照組，則提示該物質是下調炎性反應相關蛋白的化合 物。
全文摘要
本發明涉及鐵調素調節蛋白對機體免疫的調節作用及其應用，具體地，鐵調素調節蛋白或其激動劑可以用于制備免疫調節劑，或用于制備抗感染藥物或白介素IL-12的激動劑組合物；鐵調素調節蛋白拮抗劑用于制備下調白介素IL-12的活性的組合物或白介素IL-12的拮抗劑組合物，本發明還提供了一種篩選調節免疫細胞殺菌功能的化合物的和調節炎性反應相關蛋白水平或活性的化合物的方法。
文檔編號A61K45/00GK103169948SQ20111043604
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月22日 優先權日2011年12月22日
發明者王福俤, 沈媛媛, 陶云龍, 吳謙 申請人:中國科學院上海生命科學研究院