專利名稱：一種治療脈管炎的毛冬青提取物及其制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種治療脈管炎的中藥有效部位及其制劑和制備方法，具體說是從藥用植物毛冬青(Ilex pubescens Hook Et Arm)中提取分離的治療脈管炎的有效部位及其制劑，及其可工業化應用的提取分離方法。
背景技術：
血管閉塞性脈管炎是慢性周圍血管性疾病中最常見的一種慢性閉塞性炎癥，伴有繼發性神經改變。主要發生于四肢的中、小動、靜脈，尤以下肢為多見，極少數發生于腦、心、消化道等處的血管，臨床癥狀為患肢缺血、疼痛、間歇性跛行、受累動脈搏動減弱或消失，伴有游走性血栓性淺表靜脈炎，嚴重者有肢端潰瘍或壞死。目前關于本病的發病原因還不是十分清楚，其發病機制和病理學改變又十分復雜，目前治療藥物和治療手段都比較欠缺。國外采用交感神經節切除術，腎上腺合并交感神經節切除術，血管重建手術或高位截肢等手術治療，但其治療價值一直存在著爭議。西藥治療常用右旋糖酐、妥拉唑林、煙酸等緩解動脈痙攣、擴張血管，使血小板解聚或動脈內注射溶栓藥物或激素、亞甲藍、普魯卡因、前列腺素E或抗炎鎮痛藥等近期療效藥物，但以上治療方法都存在著毒副作用大，療效不太理想的缺點。
中醫藥在古籍中就有關于“脫疽”的治療記載，臨床也常有用中醫藥或中西醫結合治療本病的報道，但大多數以中藥煎劑為主。
中藥毛冬青是冬青科，冬青屬多年生植物，廣泛生長于我國南方各省，我國民間用其治療血栓閉塞性脈管炎，并取得較好療效，在上世紀八十年代就引起人們廣泛關注，我國中山醫院、中科院藥物研究所及日本學者對其化學成分進行了較深入的研究，先后分離鑒定了五種三萜類皂苷，他們所研究的有效成分毛冬青甲素(Alexonin A)，化學結構式未公開發表[藥學通報19(2)，1984]，大量的基礎藥理及臨床實驗表明它有對抗血栓形成作用，能降低心肌耗氧量，并有一定的抗炎作用。但自1984年報道以來，至今仍未上市。中國藥典(1977年版)記載毛冬青有涼血活血、通脈、消炎、解毒功能，主治血栓閉塞性脈管炎，冠狀動脈硬化性心臟病。毛冬青已有多種制劑，如片劑、小針劑、膠囊劑、糖漿劑等用于臨床上治療冠狀病、心肌梗塞、缺血性心臟病、周圍血管病、中心性視網膜炎等。經查新結果表明，國內還未見有利用毛冬青提取物總皂苷含量＞50％制成治療心血管疾病、血栓閉塞性脈管炎制劑的報道。目前只有毛冬青粗提取物或與其它中藥混合制成制劑用于治療心血管疾病的藥物。顯然已有的這些制劑都比較粗，質量難以控制，與目前中藥現代化的要求相差甚遠，對疾病的治療針對性也不夠強。

發明內容
本發明目的是為脈管炎、尤其是血栓閉塞性脈管炎病人研究出更具備針對性的治療藥物，以便更加準確地對癥治療，從而提高對脈管炎的治療效果。本發明的另一目的是公開一種治療脈管炎、尤其是血栓閉塞性脈管炎的高活性成分含量的毛冬青有效部位及其制劑。
本發明通過藥理試驗結果，證實總皂苷為毛冬青的一個有效部位，其抗血小板聚集及抗栓作用表明在脈管炎病變的多個環節上都有治療作用。
本發明同時采用高效液相色譜法對毛冬青總皂苷提取物中毛冬青皂苷B1和毛冬青皂苷甲(Ilexgenin)A兩化合物進行了含量測定，使其質量可控，為本發明向現實生產轉化創造了必要條件。
本發明的毛冬青總皂苷提取物按如下方法制備的取毛冬青藥材粉碎，加6-10倍量水或親水性溶劑回流熱提1-3次，每次1～4小時，合并提取液，回收溶劑至約原藥材2～4倍量，靜置0～36小時，過濾，收集沉淀，備用；母液繼續濃縮，調整相對密度至1～1.3，過濾，收集沉淀，備用。合并沉淀，加入40-95％親水性溶劑，使其溶解，干燥，制得浸膏狀的毛冬青總皂苷提取物。
上述制備方法的條件，其特征在于(1)、濃縮方法可以是常壓下濃縮，也可以是減壓濃縮，減壓濃縮條件為0.01-0.09MPa，40-90℃；(2)回收乙醇方法可以是常壓回收，也可以是減壓回收，減壓回收乙醇條件為0.01-0.09MPa，30-80℃；(3)干燥方法可以是接觸干燥、氣流干燥、隧道式烘箱干燥、真空(減壓)干燥、沸騰干燥、噴霧干燥、冷凍干燥、遠紅外干燥、微波干燥。
本發明的毛冬青提取物由毛冬青(Ilex pubescens Hook Et Arm)中提取分離的有效部位組成，其總皂苷含量≥50％，可用于脈管炎、尤其是血栓閉塞性脈管炎。(疾病范圍太大，而且無藥效實驗，請補充)優選，本發明的毛冬青總皂苷中毛冬青皂苷B1的含量≥7％。還優選，其中Ilexgenin A的含量≥9％。
本發明的提取物可與任意藥學上可接受的賦形劑或載體混合，制成各種藥劑學上可接受的制劑。其中優選膠囊劑。
本發明藥的有益特點是(1)、總皂苷的提取工藝一般有水提-有機溶劑萃取法，水提-大孔吸附樹脂法，醇提-水轉溶-有機溶劑萃取法，但作為工業化大生產，存在成本過高和樹脂殘留物及環保等問題，我們在大量的實驗基礎上選擇了該方法，同時對所得提取物浸膏中總皂苷進行含量測定，方法和結果如下對照品溶液的制備精密稱取毛冬青皂苷B1適量，用甲醇溶解制成每1ml含0.11mg的溶液，即得。
供試品溶液的制備取本品適量，精密稱定，用甲醇溶解制成每1ml中含有0.16mg的溶液，即得。
測定法取上述對照品溶液和供試品溶液各1ml，分別入具塞試管中，揮去溶劑，取出，放冷，分別加入新鮮配制的5％香草醛冰醋酸溶液0.2ml、高氯酸0.8ml，搖勻，置70℃水浴中加熱15分鐘，立即取出，入冰水浴冷卻后，加入冰醋酸5ml，搖勻，放置1小時后，以試劑同法操作作為空白。照分光光度法(中國藥典2000年版一部附錄VB)，在539nm±1nm的波長分別測定吸收度，計算，即得。
經方法學考察，標準曲線在0.02～0.2mg的范圍內呈一近似過零點的直線，回歸方程為A＝4.3788C-0.0399，相關系數r＝0.9998(n＝6)。精密度較好，RSD為0.14％，回收率為99.68％，RSD為2.38％，樣品測定結果見表1表1毛冬青總皂苷的測定結果

毛冬青中含有黃酮類化合物、酚性化合物和皂苷類化合物，其皂苷類化合物主要有毛冬青皂苷B、B1、B2、B3(Ilexsaponin B、B1、B2、B3)，毛冬青皂苷甲(Ilexgenin A？)，棲冬青苷(Pedunculoside)，Ilexolide A等。
為便本發明質量可控，從而使本發明順利過渡到大生產，發明人對毛冬青總皂苷提取物中毛冬青皂苷B1和Ilexgenin A？兩化合物進行了含量測定研究。
(2)、用本發明的毛冬青的總皂苷提取物浸膏進行藥理試驗，具體結果如下①、抗栓實驗●電刺激大鼠頸總動脈致血栓法取清潔級雄性SD大鼠，雄性，60只，體重250-300g，隨機分成5組，每組10只。連續灌胃給藥(1ml/100g)9天，第10天取大鼠在25±2℃環境中，灌胃給藥30min后，50mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，固定，分離右側頸總動脈，電刺激左側頸總動脈(1.2mA、7min)，于BT87-3型實驗性體內血栓形成測定儀上，測定血栓形成時間(OT)值，實驗數據統計并做組間t檢驗。
結果毛冬青制劑具有延長動脈血栓形成時間的作用，其中37.5mg/kg劑量組與空白組比較，差異有顯著意義(P＜0.05)75及150mg/kg劑量組與空白組比較，差異有非常顯著意義(P＜0.01)。結果見表2。
表2毛冬青制劑對大鼠頸總動脈血栓形成時間的影響(X±SD)

與空白組比*P＜0.05**P＜0.01●結扎大鼠下腔靜脈致血栓法取雄性清潔級SD大鼠50只，體重為250-300g，隨機分為5組，每組10只。連續灌胃給藥(1ml/100g)14天，第15天取大鼠在25±2℃環境中，灌胃給藥30min后，50mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，固定，打開腹腔，分離下腔靜脈。于左腎靜脈下方結扎下腔靜脈。爾后縫合手術傷口。結扎3小時后，重新打開腹腔，在結扎線下方2cm處，用止血鉗夾閉血管，并將此段血管各分枝血管結扎。用注射器抽干血液，剖開血管，用鑷子小心夾出血栓，并在濾紙上吸盡殘血，2min后在電子天秤上稱血栓濕重。統計各組數據，并做組間t檢驗。
結果毛冬青制劑具有對抗靜脈血栓形成的作用，其中37.5、75mg/kg劑量組與空白組比較，差異有非常顯著意義(P＜0.01)，150mg/kg劑量組與空白組比，差異有顯著意義(P＜0.05)，結果見表3。
表3毛冬青制劑對大鼠下腔靜脈血栓形成的影響(X±SD)

與空白組比較*P＜0.05**P＜0.01②、血漿優球蛋白溶解時間(ELT)，血漿凝血酶原時間(PT)，部分凝血酶時間(AKPTT)的測定取清潔級雄性SD大鼠50只，200-250g，隨機分成5組，每組10只，連續灌胃給藥(1ml/100g)14天，第15天取已禁食12hr的大鼠于25±2℃環境中，灌胃給藥30min后，50mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，固定，腹主動脈取血4.5ml，用0.5ml，3.28％構椽酸鈉抗凝。于4℃冰箱內，3000r離心10min，取血漿0.5ml置于TYXN-91A智能血液凝集儀上，37℃預熱5min后，測定PT，AKPTT值。另取血漿1ml，分成兩份，每份0.5ml，分別加入內置4℃，9ml0.011％乙酸液的錐形離心管中，混勻。靜置30min后，3000r離心5min，傾出上清液，并將離心管倒置于濾紙上，吸干余液，爾后將離心管置于37℃水浴中加入0.5ml四硼酸鈉液(pH＝9)，溶解沉淀。再加入0.025M CaCl2液0.5ml，混勻。約2-3min后，管內液體開始凝固，記錄從形成凝塊至完全溶解的時間(min)，即ELT值。統計各組數據，并做組間t檢驗。
結果毛冬青制劑具有加速纖維蛋白溶解的作用，對內源性及外源性凝血系統則無作用(P＞0.05)，結果見表4。
表4毛冬青制劑對ELT、PT、AKPTT的影響(X±SD)

與空白組比較*P＜0.05**P＜0.01③、對血小板聚集性的影響取清潔級雄性SD大鼠60只，200-250g，隨機分成5組，每組10只，連續灌胃給藥(1ml/100g)6天，第7天取已禁食12hr的大鼠于25±2℃環境中，灌胃給藥30min后，50mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，固定，腹主動脈取血4.5ml，用0.5ml 3.28％枸椽酸鈉1∶9抗凝，制取PRP及PPP。
將各管血漿，于TYXN-91A型智能血液凝集儀上，測5min內血小板最大聚集率，所用誘導劑為ADP(5uM)，膠原(5ul)，花生四烯酸(10ul)，統計各組結果，并做組間t檢驗。
結果毛冬青制劑能對抗ADP誘導的大鼠血小板聚集(P＜0.05及0.01)，起效劑量為37.5mg/kg。不能對抗膠原誘導的大鼠血小板聚集(P＞0.05)，不能對抗花生四烯酸誘導的大鼠血小板聚集(P＞0.05)。結果見表5-1、2、3。
表5-1毛冬青制劑對膠原誘導的大鼠血小板聚集率的影響(X±SD)

與空白組比較p＞0.05
表5-2毛冬青制劑對ADP誘導的大鼠血小板聚集率的影響(X±SD)

與空白組比較*P＜0.05**P＜0.01表5-3毛冬青制劑對花生四烯酸誘導的大鼠血小板聚集率的影響(X±SD)

與空白組比較p＞0.05④、對動脈壁前列環素(PGI2)活性的影響[9]取清潔級雄性SD大鼠50只，250-300g。隨機分成5組，每組10只。麻醉，固定，舌靜脈注射給藥(0.2ml/100g)30min后，迅速開胸剪下胸主動脈置于冰冷-中剝離周圍結締組織，切成約2mm小段，稱重，加入磷酸緩沖液(1ml/4mg)，于37℃水浴中溫育30min后，取出組織，放入冰浴中終止反應。爾后取10ul溫育液，采用放免法測定PGI2代謝產物6-Keto-PGF1a含量以此作指標，統計，并做組間t檢驗。
結果毛冬青制劑具有增強PGI2活性的作用(P＜0.05)，起效劑量為37.5mg/kg，結果見表6。
表6毛冬青制劑對大鼠胸主動脈壁PGI2活性的影響(X±SD)

與空白組比*P＜0.05**P＜0.01⑤、小鼠耳腫脹試驗取雄性清潔級昆明種鼠60只，體重為18-20g，按體重隨機分為6組，每組10只。連續灌胃給藥(0.2ml/10g)2天，第3天取小鼠在25±2℃環境中，灌胃給藥30min后，在小鼠左耳涂抹二甲苯25ul，待30min后處死小鼠，剪下雙耳，用直徑為8mm的子彈殼沿耳緣切跡打孔，分別稱重，以每只小鼠的左耳重量減去右耳重量的差值作為腫脹度，統計，并做組間t檢驗。
結果與模型組比較，阿司匹林組及毛冬青制劑75，150mg/kg劑量組有減輕小鼠耳腫脹度的作用，差異有顯著性意義(p＜0.05及0.01)。結果見表7。
表7毛冬青制劑對小鼠耳腫脹的影響(X±SD)

與模型組比*P＜0.05**P＜0.01。
通過動物實驗觀察，本品經灌胃給藥后，可見其有抗栓作用，這與其抗血小板聚集、促進纖溶及促進PGI2的釋放有關，同時本品還具有減輕急性炎癥的發生。由此可見，本品在脈管炎病變的多個環節上都有治療作用，綜上所述，本品不失為治療脈管炎的良藥。
實施例1取毛冬青藥材粉碎，加6倍量60％乙醇回流熱提1次，時間2小時，合并提取液，回收溶劑至約原藥材2倍量，靜置24小時，過濾，收集沉淀，備用；母液繼續濃縮，調整相對密度至1.05(25-28℃)，過濾，收集沉淀，備用。合并沉淀，加入60％乙醇，使其溶解，干燥，制得總皂苷含量為75％的浸膏，其中毛冬青皂苷B1和Ilexgenin A的含量分別為7.35％、9.47％。
實施例2取毛冬青藥材粉碎，加8倍量80％乙醇回流熱提2次，每次2小時，合并提取液，回收溶劑至約原藥材2倍量，靜置24小時，過濾，收集沉淀，備用；母液繼續濃縮，調整相對密度至1.05(25-28℃)，過濾，收集沉淀，備用。合并沉淀，加入80％乙醇，使其溶解，干燥，制得總皂苷含量為79％的浸膏，其中毛冬青皂苷B1和Ilexgenin A的含量分別為9.45％、12.72％。
實施例3取毛冬青藥材粉碎，加10倍量80％乙醇回流熱提3次，每次2小時，合并提取液，回收溶劑至約原藥材2倍量，靜置24小時，過濾，收集沉淀，備用；母液繼續濃縮，調整相對密度至1.05(25-28℃)，過濾，收集沉淀，備用。合并沉淀，加入80％乙醇，使其溶解，干燥，制得總皂苷76％的浸膏，其中毛冬青皂苷B1和Ilexgenin A的含量含量分別為8.89％、12.55％。
實施例4取毛冬青提取物浸膏1份，聚乙二醇1.5份，加10倍量80％乙醇，加熱回流2～4小時，回收溶劑干燥，粉碎，制成膠囊。
實施例5取毛冬青提取物浸膏1份，聚乙二醇2份，加15倍量95％乙醇，加熱回流1～3小時，減壓回收溶劑，干燥，粉碎，制成膠囊。
實施例6取毛冬青提取物浸膏1份，聚乙二醇3份，加20倍無水乙醇，加熱回流1～5小時，回收溶劑，干燥，粉碎，制成膠囊。
權利要求
1.一種治療脈管炎的毛冬青提取物，其特征在于它是由以下方法制備而成的取毛冬青藥材粉碎，加6-10倍量水或40-95％親水性溶劑回流熱提1-3次，每次1～4小時，合并提取液，回收溶劑至約原藥材2～4倍量，靜置0～36小時，過濾，收集沉淀，備用；母液繼續濃縮，調整相對密度至1～1.3，過濾，收集沉淀，備用，合并沉淀，加入40-95％親水性溶劑，使其溶解，干燥，制得浸膏狀的毛冬青提取物。
2.利要求1所述的毛冬青提取物，其中含總皂苷≥50％。
3.根據權利要求2所述的毛冬青提取物，其中總皂苷中毛冬青皂苷B1的含量≥7％。
4.根據權利要求2所述的毛冬青提取物，其中總皂苷中毛冬青皂苷甲A的含量≥9％。
5.一種治療脈管炎的毛冬青制劑，其特征在于由權利要求1-4所述的任一毛冬青提取物與藥學上可接受的載體或賦形劑混合而成。
6.根據權利要求1所述的毛冬青制劑，其特征在于該制劑為膠囊。
7.權利要求6所述制劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟取毛冬青提取物和聚乙二醇3份，加入乙醇，加熱回流1～5小時，回收溶劑，干燥，粉碎，制成膠囊。
全文摘要
本發明涉及一種治療脈管炎的中藥有效部位及其制劑和制備方法，具體說是從藥用植物毛冬青(Ilex pubescens Hook Et Arm)中提取分離的治療脈管炎的有效部位及其制劑，以及可工業化應用的提取分離方法。本發明特征在于所公開的中藥提取物，其總皂苷含量≥50％；該提取物可與藥學上可接受的賦形劑或載體混合，制成各種藥劑學上可接受的制劑。本發明的有益效果如下本發明提取物總皂苷為毛冬青的一個有效部位，其抗血栓、抗血小板聚集及消炎鎮痛作用表明在脈管炎尤其是血管閉塞性脈管炎病變的多個環節上都有治療作用。
文檔編號A61K9/48GK1781503SQ200410097759
公開日2006年6月7日 申請日期2004年11月29日 優先權日2004年11月29日
發明者曾憲儀, 郭晟, 陳新菊, 鐘小群, 利家平, 徐曉艷, 鄭國安, 李萍 申請人:江西省藥物研究所