專利名稱：聚合物-因子viii部分綴合物的制作方法
技術領域：
一般地說，本發明涉及包括因子VIII部分(即具有因子VIII活性的部分)和聚 合物的綴合物(conjugate)。此外，本發明涉及包括所述綴合物的組合物、合成所述綴合物的方法和治療患者 的方法。
背景技術：
止血是阻止血液從損傷血管流出的過程。就哺乳動物以及許多其它生物而言，止 血過程對繼續存活來說具有決定性的重要意義。例如，止血過程中的缺陷可以導致不能有 效形成用于使血管損傷后失血停止的血塊。在人體中，患有不能形成血塊的個體稱作血友 病患者。對血友病患者特別關注的是危及生命的危險，出血一旦開始，它就從不會停止。一般來說，血友病患者缺乏產生形成血塊所需的有效量的一種或多種物質的能 力。例如，患有血友病A(也稱作典型血友病")的血友病患者不能產生有效水平的因子 VIII (也稱作“抗血友病因子A”、“抗血友病球蛋白”和“AHG”)。因子VIII是導致血塊形成 的幾種“級聯”反應之一中的關鍵成分。對稱作“內在途經”的反應級聯關鍵的，因子VIII 最終影響血纖蛋白原轉化成血塊的主要成分血纖蛋白。盡管血塊形成的內在途經相對復雜，但是可以簡單描因子VIII的作用。在有相對 少量凝血酶存在下(例如，由破裂的組織細胞釋放)，因子VIII被轉化成其活化形式，稱作 因子Villa。因子VIIIa(與其它物質一起)依次使另一種因子，因子X活化成因子fe。此 后，因子敘(與其它物質一起)將凝血酶原轉化成凝血酶，結果隨時間內產生相對大量的凝 血酶。相對大量的凝血酶有效地將血纖蛋白原轉化成血纖蛋白。血纖蛋白依次形成導致血 塊形成的基質或晶格。因子VIII在凝血的內在途經中的作用如說明書附圖6所示。在所有群體中，每10，000個生下來活著的嬰兒中影響1個或2個男性，所以血友 病A可能因位于X-染色體上的因子VIII基因各種突變中的任意一個所致。隨特定突變的 不同，血友病A自身可以表現為重度、中度或輕度。患有最嚴重形式血友病A的個體完全缺 乏表達因子VIII的活性形式的能力。在臨床上，受血友病A侵害的個體遭受肌肉出血、關 節出血、易青腫和從傷口出血延長。患血友病A的未經治療的個體平均年齡為20歲。目前 對血友病A的治療包括輸注收集自人血漿或通過重組DNA技術制備的外源性因子VIII濃 縮物。因為這些治療僅用于補充缺乏的有效水平的因子VIII，所以因因子VIII受到損害的 個體需要在其整個生命過程中定期注射因子VIII濃縮物。可以得到因子VIII濃縮物的幾種商品形式以提供對患有血友病A的患者的 代替療法。例如，以 Hemof il M (Baxter, Deerfield, IL)、Koate -DVI (Bayer,Research Tringle Park, NC)、Monarc-M (Ameri can Red Cross, Washington, D. C.) 和 Monoclate-P (Aventis, Bridgewater, NJ)商標銷售的血液衍生的因子 VIII 濃縮物產品。就以重組方式制備的因子VIII濃縮物而言，以Helixate FS (Aventis, Bridgewater, NJ)、Kogenate FS (Bayer, Research Triangle Park, NC)、 Recombinate (Baxter, Deerfield, IL)、 Advate (Baxter, Deerfield, IL)和 ReFaCtO (Wyeth/Genetics Institute, Cambridge, MA) Ttf|^il#^lti[ n。一般來說，重組來源的因子VIII濃縮物優于血液衍生來源，因為后者涉及傳播病 毒和/或其它與獻血相關的疾病的風險。盡管基于重組的制品避免了這些缺陷，但是基于 重組的產品的加工通常需要存在某些蛋白質，諸如清蛋白，它們不可避免地存在于給予患 者的最終制品中。接受這類制品的患者通常發生對這些外來蛋白的過敏反應。在任何情況 下，血液衍生和基于重組的產品均遭受反復給藥的缺點。已經將聚乙二醇化或聚(乙二醇)衍生物與蛋白質結合描述為減輕免疫原性的方 式以及延長蛋白質的體內半衰期的方式。然而，就因子VIII而言，先前形成蛋白質-聚合 物共軛物的經驗已經證實與聚合物與因子VIII偶聯相比較幾乎沒有預測值。參見美國專 利 No. 4，970，300。盡管存在這些困難，但是已經描述了制備令人滿意的某些聚合物與因子VIII的 共軛物的組合物的嘗試。例如，上述參照的美國專利No. 4，970，300中描述了使用具有約 500-5，000分子量的特定聚(乙二醇)衍生物使因子VIII聚乙二醇化。另外，美國專利 No. 6，048，720中描述了當4至5個一甲氧基聚(乙二醇)鏈與因子VIII軛合時有效保護 免受體外環境中的降解。然而，證實這些所述的共軛物中沒有一種可以令人滿意地解決與目前基于因子 VIII療法相關的難題。例如，由相對小的聚合物(例如約5，000道爾頓或5，000道爾頓以 下)組成的共軛物可能無法適當提供延長的體內半衰期和/或充分減輕的免疫反應。此外， 帶有多種與因子VIII結合的個體聚合物的共軛物因聚合物封閉位點對活性而言必不可少 而更可能具有下降的活性。因此，本領域中仍然存在提供另外的水溶性聚合物與具有因子VIII活性的部分 之間的共軛物的需求。本發明由此涉及這類共軛物以及包括所述共軛物的組合物和本文所 述的相關方法，認為它們是新的且在本領域中完全沒有啟示。發明概述因此，本發明的主要目的在于提供包括多種共軛物的組合物，盡管不必需地，但是 優選所述的共軛物各自帶有1至3種與因子VIII部分共價結合的水溶性聚合物，其中每一 水溶性聚合物優選具有的標稱平均分子量在大于5，000道爾頓至約100，000道爾頓的范圍 內。本發明的另一個目的在于提供這類共軛物，其中所述每一水溶性聚合物為聚(環 氧烷)。本發明的另一個目的在于提供這類共軛物，其中所述每一水溶性聚合物為聚(乙
二醇)。本發明的另一個目的在于提供包括多種單聚乙二醇化因子VIII部分共軛物的共 軛物。
本發明的還另一個目的在于提供制備聚合物共軛物的方法，該方法包括在足以產 生多種共軛物的條件下使一種或多種活化的水溶性聚合物與因子VIII部分接觸的步驟， 盡管不必需地，但是優選所述的共軛物各自帶有1至3種與因子VIII部分共價結合的水溶 性聚合物，其中所述的水溶性聚合物優選具有的標稱平均分子量在大于5，000道爾頓至約 150,000道爾頓的范圍內。本發明的另一個目的在于提供治療需要因子VIII療法的患者的方法，該方法包 括對所述患者給予本文所述的組合物的步驟，其中該組合物含有治療有效量的一種或多種 所述共軛物。本發明的還另一個目的在于提供制備水溶性聚合物-因子VIII部分共軛物的方 法，該方法包括在共軛條件下使因子VIII部分與聚合物試劑接觸的步驟。如下的本說明書中將列出本發明的其它目的、優點和新特征且部分對本領域技術 人員而言在閱讀下文后將變得顯而易見或可以通過實施本發明而得知。然后在一個實施方案中，提供了包括多種共軛物的組合物，盡管不必需地，但是 優選所述的共軛物各自帶有1至3種與因子VIII部分共價結合的水溶性聚合物，其中每一 水溶性聚合物優選具有的標稱平均分子量在大于5，000道爾頓至約150，000道爾頓的范圍 內。盡管可以使用任意的因子VIII部分，但是優選該組合物包括因子VIII本身(例如，如 美國專利No. 4，757，006中所述)、因子VIIIa(即當因子VIII與相對少量凝血酶接觸時產 生因子VIII的活化形式)、因子VIII =VffF(即與馮維勒布蘭德因子結合的因子VIII)和/ 或因子VIII的截短形式，諸如B-結構域缺失的因子VIII (例如，如美國專利No. 4，868，112 中所述)。聚合物可以為任意的水溶性聚合物且本發明在這方面沒有限制。不過，優選共軛 物中存在的各聚合物選自由聚(環氧烷)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、 聚(丙烯酰嗎啉)及其組合組成的組。然而，特別優選將聚(環氧烷)，諸如聚(乙二醇) 衍生物用作本發明中的聚合物。本文所述的共軛物有利地減輕免疫原性，即許多用外源性來源的因子VIII治療 的血友病患者遇到的問題。此外，本發明的共軛物與不含共軛物的因子VIII組合物相比對 給藥頻率的需求減少。通過減少給藥頻率，所述的共軛物有利地減少了血友病患者必須耐 受以提供持續水平的具有因子VIII活性的藥劑的疼痛注射次數。在另一個實施方案中，提供了制備共軛物的方法。該方法包括使一種或多種活化 的、水溶性聚合物(即聚合物試劑)與因子VIII部分接觸的步驟，其中所述的一種或多種 活化的、水溶性聚合物優選具有的標稱平均分子量在大于5，000道爾頓至約150，000道爾 頓的范圍內。可以在本領域中任意公知的方法條件下完成所述的水溶性聚合物的活化，只 要所得聚合物在適當PH、溫度等條件下將形成共價鍵，使得因子VIII部分與所述聚合物共 價結合。在活化的、水溶性聚合物在所述部分的所需位置上形成共價結合所要求的那些條 件下進行一種或多種活化的、水溶性聚合物與因子VIII部分的接觸。該方法產生多種共軛 物，盡管不必需地，但是優選所述的共軛物各自帶有1至3種與因子VIII部分共價結合的 水溶性聚合物。在某些情況中，所述的共軛物可以包括與2、3、4、5、6、7、8或更多因子VIII 部分結合的單一聚合物。任選地，可以將所得組合物進一步加工以除去不需要的種類，諸如 帶有不需要數量聚合物的共軛物。為了除去這類不需要的種類，可以使用純化技術，諸如尺
6寸排阻色譜法。在本發明的還另一個實施方案中，提供了包括與藥物上可接受的賦形劑結合的本 發明共軛物的組合物。該組合物包括所有類型的制劑且特別是那些適合于注射的制劑，諸 如可以被重構的粉末和液體(例如混懸液和溶液)。在本發明的另一個實施方案中，提供了給予所述共軛物的方法。這種給藥方法包 括對患者給予本文所述的組合物的步驟，其中該組合物含有治療有效量的所述共軛物。一 般來說，通過注射(例如肌內注射、靜脈內注射、皮下注射等)進行含有共軛物的組合物的 給藥步驟。附圖簡述附

圖1是對應于如實施例6中所述的用30K的mPEG-SPA使B-結構域缺失的因子 VIII聚乙二醇化時形成的反應混合物的SEC圖。附圖2是對應于如實施例6中所述的通過使蛋白質與30K的mPEG_SPA軛合制備 的純化的B-結構域缺失的因子VIII-PEG共軛物的SEC圖。附圖3是對應于如實施例7中所述的用20K的mPEG_MAL使B-結構域缺失的因子 VIII聚乙二醇化時形成的反應混合物的SEC圖。正如可以觀察到的，單聚乙二醇化產物的 產率約為33%。附圖4是對應于如實施例7中所述的通過使蛋白質與20K的mPEG_MAL軛合制備 的純化的B-結構域缺失的因子VIII-PEG共軛物的SEC圖。附圖5是對應于如實施例8中所述的用30K的mPEG_SMB使B-結構域缺失的因子 VIII聚乙二醇化時形成的反應混合物的SEC圖。單聚乙二醇化產蛋白質(1-鏈節)的產率 約為41%。
附圖6表示因子VIII在凝血的內在途經中的作用。發明詳述在詳細描述本發明前，應理解本發明并非限于特定的聚合物、合成技術、因子VIII 部分等，因為它們可以改變。必須注意，除非上下文中另有清楚的說明，作為本說明書和權利要求中所用的單 數形式"一個(a)“、“ 一種(an)“和"所述的(the)“包括復數形式。因此，例如涉及 的"聚合物"包括單一聚合物和兩種或更多種相同或不同的聚合物，涉及的"任選的賦形 劑"指的是單一可選的賦形劑和兩種或更多種相同或不同的可選賦形劑等。在描述和要求保護本發明中，按照下文所述的定義使用下列術語。本文所用的〃 PEG"、丨‘聚乙二醇〃和〃聚(乙二醇)〃可以互換使用且用以包 括任意水溶性聚(環氧乙烷)。一般來說，用于本發明的PEk包括如下結構"-(OCH2CH2) n_ “，其中(η)為 2 至 4000。本文所用的 PEG 還包括“-CH2CH2-O (CH2CH2O) n_CH2CH2-“ 和"-(OCH2CH2)nO-"，這取決于末端氧是否被取代。在說明書和權利要求的全文中，應記住 術語"PEG"包括帶有各種末端或"封端"基團等的結構。術語"PEG"還指含有大多數， 即大于50%的-OCH2CH2-重復亞單位的聚合物。就具體形式而言，PEG可以采用任意數量的 不同分子量以及結構或幾何結構，諸如"支化"、“線型"、“叉形"、“多官能"等，在 下文中更詳細地描述。術語"封端"和"末端封端"在本文中可以互換使用以指帶有封端部分的聚合物末端或端點。一般來說，盡管不必需地，但是封端部分包括羥基或C1J烷氧基，更優選C1, 烷氧基且更優選C"烷氧基。因此，封端部分的實例包括烷氧基(例如甲氧基、乙氧基和芐 氧基)以及芳基、雜芳基、環、雜環等。必須記住封端部分可以包括聚合物上末端單體中的 一個或多個原子[例如在CH3(OCH2CH2)n-上的封端部分"甲氧基"]。此外，設想到上述物 質中每一種的飽和、不飽和、取代和未被取代的形式。此外，封端基還可以為硅烷。封端基還 可以有利地包括可檢測標記。當聚合物帶有包括可檢測標記的封端基時，可以通過使用合 適的檢測器測定聚合物和/或聚合物所偶聯的部分(例如活性劑)的量或位置。這類標記 包括，但不限于熒光劑、化學發光劑、用于酶標記的部分、比色劑(例如染料)、金屬離子、放 射性部分等。合適的檢測器包括光度計、薄膜、分光光度計等。封端基還可以有利地包括磷 脂。當聚合物帶有包括磷脂的封端基時，獨特特性可以被賦予給聚合物和所得共軛物。典 型的磷脂類包括，但不限于那些選自稱作磷脂酰膽堿類的磷脂類。具體的磷脂類包括，但不 限于那些選自二月桂酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷 脂酰膽堿、山崳酰磷脂酰膽堿、花生四烯酰磷脂酰膽堿(arachidoylphosphatidylcholine) 和卵磷脂組成的組的磷脂。就本文所述的聚合物，“非天然存在的"指的是其整體在天然中未發現的聚合 物。不過，本發明非天然存在的聚合物可以含有一種或多種天然存在的單體或單體鏈段，只 要總體聚合物結構在天然中未發現。作為"水溶性聚合物"中的術語"水溶性"聚合物是在室溫下溶于水的任意聚 合物。一般來說，水溶性聚合物將透過至少約75%，更優選至少約95%的由過濾后相同溶 液透過的光。以重量為基礎，水溶性聚合物將優選至少約35% (按重量計)溶于水，更優選 至少約50% (按重量計)溶于水，更優選至少約70% (按重量計)溶于水且更優選至少約 85% (按重量計)溶于水。不過，最優選水溶性聚合物約95% (按重量計)溶于水或完全 溶于水。就諸如PEG這類水溶性、非天然存在的聚合物而言的“標稱平均分子量"指的是 該聚合物的質量平均分子量，一般通過尺寸排阻色譜法、MALDI (基質輔助激光解吸/離子 化)、光散射技術或在1，2，4_三氯苯中內在速度測定來測定。這些聚合物一般為多分散系， 具有的低多分散性值優選小于約1. 2，更優選小于約1. 15，更優選小于約1. 10，更優選小于 約1.05和最優選小于約1.03。與特定官能團結合使用的術語"活性"或"活化的"指的是易于與另一分子上 的親電體或親核體反應的反應性官能團。這與需要強催化劑或非常不實際反應條件才能反 應的那些基團(即"非反應性"或"惰性"基團)相反。本文所用的術語"官能團"或其任意的同義詞用以包括其被保護形式和未被保 護形式。本文所用的術語"鍵"或"連接體"指的是任選用于連接互聯部分的原子或原 子團，所述的互聯部分諸如聚合物鏈段和因子VIII部分的末端或因子VIII部分的親電子 體或親核體。本發明的連接體可以是水解穩定的或可以包括生理上可水解的或酶可降解的 鍵。“烷基"指的是一般長度約1至15個原子的烴鏈。優選這類烴鏈，但不必需是飽 和的且可以為支鏈或直鏈，不過一般優選直鏈。典型的烷基包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、3-甲基戊基等。本文所用的"烷基"包括環烷基以及含有亞 環烷基的烷基。“低級烷基"指的是含有1至6個碳原子的烷基且可以為直鏈或支鏈，作為典型 的有甲基、乙基、正丁基、異丁基和叔丁基。“環烷基"指的是飽和或不飽和的環狀烴鏈，包括橋連、稠合或螺環化合物，優選 由3至約12個碳原子，更優選由3至約8個原子構成。“亞環烷基"指的是通過在環系上 的任意兩個碳上結合鏈被插入烷基鏈的環烷基。“烷氧基"指的是-O-R基團，其中R為烷基或取代的烷基，優選CV6烷基(例如
甲氧基、乙氧基、丙氧基等)。作為例如"取代的烷基"中的術語"取代的"指的是被一個或多個非干擾取代 基取代的部分(例如烷基)，諸如，但不限于烷基；C3_8環烷基，例如環丙基、環丁基等；鹵 素，例如氟、氯、溴和碘；氰基；烷氧基、低級苯基；取代的苯基等。“取代的芳基"為帶有一 個或多個非干擾基團作為取代基的芳基。就苯基環上的取代基而言，取代基可以為任意方 向(即鄰位、間位或對位)。“非干擾取代基"是那些當存在于分子上時，一般不與該分子內包含的其它官能 團反應的基團。“芳基"指的是一種或多種各自有5或6個核碳原子的芳族環。芳基包括可以作 為在萘基上稠合或在作為聯苯基上未稠合的多個芳基環。芳基環也可以與一種或多種環 烴、雜芳基或雜環稠合或不與它們稠合。本文所用的"芳基"包括雜芳基。“雜芳基"為含有1至4個雜原子，優選硫、氧或氮或其組合的芳基。雜芳基環還 可以與一種或多種環烴、雜環、芳基或雜芳基環稠合。“雜環(heterocycle)“或〃雜環(heterocyclic)“指的是一個或多個5-12 個 原子，優選5-7個原子的環，它們具有或沒有不飽和性或芳香性且帶有至少一個不為碳的 環原子。優選的雜原子包括硫、氧和氮。“取代的雜芳基"為帶有一個或多個非干擾基團作為取代基的雜芳基。“取代的雜環"為帶有一個或多個由非干擾取代基形成的側鏈的雜環。“親電子體"和"親電子基團"指的是可以為離子的、帶有親電中心的離子或原 子或原子團，即所述的親電中心是尋找電子、能夠與親核體反應的中心。“親核體"和"親核基團"指的是可以為離子的帶有親核中心的離子或原子或 原子團，即所述的親核中心是尋找親電子中心或帶有親電子體的中心。“生理上可裂解的〃或〃可水解的〃或〃可降解的〃鍵為在生理條件下與水反 應(即被水解的)鍵。優選的是在25V、pH 8下具有小于約30分鐘的水解半衰期的鍵。 鍵在水中水解的趨向將不僅取決于連接兩個中心原子的鍵的一般類型，而且取決于與這些 中心原子連接的取代基。合適的水解不穩定或弱的鍵包括，但不限于羧酸酯、磷酸酯、酸酐 類、縮醛類、酮縮醇類、酰氧基烷基醚、亞胺類、原酸酯類、肽類和寡核苷酸類。“酶可水解的鍵"指的是易受一種或多種酶降解的鍵。“水解穩定的"鍵(linkage)或鍵(bond)指的是在水中實質上穩定的化學鍵，一 般為共價鍵，即在生理條件下在延長時間期限內不會水解至任何可察覺的程度。水解穩定 鍵的實例包括，但不限于如下碳-碳鍵(例如在脂族鏈上)、醚類、酰胺類、尿烷類等。一般來說，水解穩定的鍵為在生理條件下表現出低于約1-2%/天的水解速率的鍵。有代表 性的化學鍵的水解速率可以在大部分標準化學教科書中找到。“藥物上可接受的賦形劑或載體"指的是可以任選被包括在本發明組合物中且 不會對患者產生明顯不良毒理學作用的賦形劑。“藥理有效量"、“生理有效量"和〃治 療有效量"在本文中可以互換使用以指在血流或靶組織中提供所需水平的共軛物(或相 應的未軛合的因子VIII部分)所需要的聚合物-因子VIII部分共軛物的量。精確量將取 決于許多因素，例如特定的因子VIII部分、治療組合物中的成分和物理特性、所針對的患 者群體、個體患者的考慮等且易于由本領域技術人員基于本文提供的信息確定。“多官能"指的是帶有其中含有的3個或更多官能團的聚合物，其中所述的官能 團可以相同或不同。本發明的多官能團聚合物試劑將一般在聚合物骨架內含有約3-100個 官能團或3-50個官能團或3-25個官能團或3-15個官能團或3_10個官能團或將含有3、4、 5、6、7、8、9或10個官能團。本文所用的術語"因子VIII部分"指的是具有因子VIII活性的部分。因子VIII 部分還將帶有至少一個適合于與聚合物試劑反應的親電子基團或親核基團。盡管不必需 是，但是因子VIII部分一般為蛋白質。此外，術語"因子VIII部分"包括軛合前的因子 VIII部分和軛合后的因子VIII部分殘基。正如下文進一步具體解釋的，本領域技術人員可 以確定任意指定的部分是否具有因子VIII活性。術語"患者"指的是患有或易患可以通過給予活性劑(例如共軛物)預防或治療 的狀況的活生物且包括人和動物。“任選"或"任選地"指的是隨后所述的情況可以發生，也可以不發生，使得該 描述包括情況發生的實例和情況不發生的實例。將肽類中的氨基酸殘基縮寫如下苯丙氨酸為Phe或F ；亮氨酸為Leu或L ；異亮 氨酸為Ile或I ；甲硫氨酸為Met或M ；纈氨酸為Val或V ；絲氨酸為Ser或S ；脯氨酸為Pro 或P ；蘇氨酸為Thr或T ；丙氨酸為Ala或A ；酪氨酸為Tyr或Y ；組氨酸為His或H ；谷氨酰 胺為Gln或Q ；天冬酰胺為Asn或N ；賴氨酸為Lys或K ；天冬氨酸為Asp或D ；谷氨酸為Glu 或E ；半胱氨酸為Cys或C ；色氨酸為Trp或W ；精氨酸為Arg或R ；且甘氨酸為Gly或G。現在轉向本發明的第一個實施方案，該實施方案提供了包括多種共軛物的組合 物，盡管不必需地，但優選所述的共軛物各自帶有1至3種與因子VIII部分共價結合的水 溶性聚合物，其中每一水溶性聚合物優選具有的標稱平均分子量在大于5，000道爾頓至約 150,000道爾頓的范圍內。天然因子VIII為2，351個氨基酸的單鏈糖蛋白，它在結構上構成為 A1-A2-B-A3-C1-C2。表達的2，351個氨基酸序列作為SEQ. ID. NO :1提供。然而，當表達的多 肽被易位到內質網腔中時，19-氨基酸信號序列被裂解，產生第二序列。研究人員通常將本 文作為SEQ. ID. NO 2提供、缺少引導的19個氨基酸的這第二序列用于給指定的因子VIII 的氨基酸殘基指定位置編號(例如Arg372)。因此，除非有特別的說明，本文提供的氨基酸殘 基的所有指定的編號位置均基于SEQ. ID. NO :2。在有相對少量凝血酶存在下，因子VIII在Arg372、Arg74°和Arg1689上被凝血酶裂解 而產生因子Villa。因子VIIIa是由與凝血酶-裂解的輕鏈A3-C1-C2結合(通過銅離子) 的Al亞單位和通過離子相互作用與Al結合的游離A2亞單位組成的異三聚體。將理解因
10子VIII部分并不僅限于因子VIII"活性"形式(例如因子Villa)且術語"因子VIII部 分"包括"前體"形式和具有類似的前凝血劑作用的其它物質。對任何指定的部分而言，測定該部分是否具有因子VIII活性是可能的。例如，已 經有意識地繁殖了存在血友病遺傳突變的幾種動物品系，使得由這類品系產生的動物具 有極低和不足水平的因子VIII。這類品系可獲自各種來源，諸如，但不限于Division of Laboratories and Research, New York Department of Public Health, Albany, NY ；禾口 Department of Pathology, University of North Carolina, Chapel Hill, NC0 例如，這 兩種來源提供了患有犬血友病A的犬。為了測試討論中任何指定部分的因子VIII活性，將 該部分注入患病動物，做小切口并與健康對照比較出血時間。另一種適用于測定因子VIII 活性的方法在于測定輔因子和前凝血劑活性。例如，參見Mertens等(199 《英國血液病 學雜志》(Brit. J.Haematol.)迎133-42。還可以將本領域技術人員公知的其它方法用于 測定指定部分是否具有因子VIIII活性。這類方法適用于測定所述部分自身(且由此可被 用作"因子VIII部分)以及相應的聚合物-部分共軛物的因子VIII活性。因子VIII部分的非限制性實例包括如下因子VIII ；因子VIIIa ；因子VIII =C ； 因子VIII :vWF;B-結構域缺失的因子VIII (和因子VIII的其它截短形式)；雜交蛋白，諸 如那些描述在美國專利No. 6，158，888中的蛋白；具有因子VIII活性的糖基化蛋白，諸如那 些描述在美國專利申請No. 2003/0077752中的蛋白；和具有因子VIII活性的肽模擬物。優 選的截短的因子VIII形式(被術語"B-結構域缺失的因子VIII包括的)對應于具有人 因子VIII的氨基酸序列(SEQ. ID. NO. 1)的蛋白質，所述的人因子VIII的氨基酸序列(SEQ. ID. NO. 1)帶有對應于Argra^P kr17°9之間區內至少581個氨基酸的缺失，更優選其中的缺 失對應于和Asp1582之間的區和Thr778和ftV659之間的區和Thr778和Glu1694之間的 區之一。維持至少一定程度因子VIII活性的上述任意的生物活性片段、缺失變體、取代變 體或添加變體也可起因子VIII部分的作用。還可以將具有因子VIII活性的部分有利地修飾成包括一種或多種氨基酸殘基， 諸如賴氨酸、半胱氨酸和/或精氨酸以便提供聚合物與氨基酸側鏈內原子的便利結合。用 于添加氨基酸殘基的技術對本領域技術人員而言眾所周知。參考下列文獻J. March，《高級 有機化學反應機制禾口結構》(Advanced Organic Chemistry :Reactions Mechanisms and Structure)，第 4 片反(New York Wi ley-Inter science, 1992)。因子VIII部分可以獲自血液衍生的來源。例如，可以使用本領域技術人員公知 的沉淀和離心技術從人血漿中分級分離因子VIII。例如，參見=Wickerhauser(1976)《輸 血》(Transfusion) 16(4) 345-350 ；和 Slichter 等(1976)《輸血》(Transfusion) 16 (6) 616-626。因子VIII還可以分離自人粒細胞。參見kmitkoski等(1977)《血液病學》 (Haematologia)(Budap.)11(1-2) :177_187。此外，因子VIII部分還可以獲自重組方法。簡單的說，重組方法包括構建編碼所 需多肽或片段的核酸、將該核酸克隆入表達載體、轉化宿主細胞(例如細菌、酵母或哺乳動 物細胞，諸如中國倉鼠卵巢細胞或幼倉鼠腎細胞)并表達該核酸以產生所需多肽或片段。 用于在體外和原核和真核宿主細胞內產生和表達重組多肽類的方法是本領域技術人員公 知的。例如，參見美國專利No. 4，868，122。為了有利于鑒定和純化重組多肽，可以符合編碼序列讀框地插入或加入編碼表位tag或其它親和結合序列的核酸序列，由此產生由所需多肽和適合于結合的多肽組成的融 合蛋白。可以通過下列步驟鑒定和純化融合蛋白首先使含有所述融合蛋白的混合物通過 帶有定向于融合蛋白中的表位tag或其它結合序列的結合部分(例如抗體)的親和柱，由 此結合柱內的融合蛋白。此后，可以通過用合適的溶液(例如酸)洗滌該柱以釋放結合的 融合蛋白回收所述的融合蛋白。還可以通過裂解宿主細胞、例如通過尺寸排阻色譜法分離 多肽并收集該多肽來鑒定和純化重組多肽。這些和其它用于鑒定和純化重組多肽類的方法 是本領域技術人員公知的。本發明的組合物可以包括多種共軛物，每一共軛物由相同的因子VIII部分組成 (即在完整的組合物內僅發現有一種類型的因子VIII部分)。此外，該組合物可以包括多 種共軛物，其中任何給定的共軛物均由選自由兩種或更多種不同因子VIII部分組成的組 的部分組成(即在完整的組合物內發現兩種或更多種不同的因子VIII部分)。然而，最佳 情況的是，在該組合物中實質上所有數量的共軛物(例如在該組合物中85%或更多數量的 共軛物)各自由相同的因子VIII部分組成。此外，優選含有所述共軛物的組合物不含或實質上不含清蛋白。還優選該組合物 不含或實質上不含不具有因子VIII活性的蛋白質。因此，優選該組合物85%，更優選95% 且最優選99%不含清蛋白。另外，優選該組合物85%，更優選95%且最優選99%不含不 具有因子VIII活性的任何蛋白質。如上所述，每一共軛物包括與水溶性聚合物結合的因子VIII部分。就所述的水 溶性聚合物而言，該水溶性聚合物是非肽的、無毒性的、非天然存在的和生物相容性的。就 生物相容性而言，將物質視為生物相容性的條件是與單獨使用該物質或與活組織相關(例 如對患者給藥)的另一種物質(例如活性劑，諸如因子VIII部分)一起使用有關的有益作 用超過了由臨床醫師，例如內科醫師評價的任何有害作用。就非免疫原性而言，將物質視為 無免疫原性的條件是該物質在體內的計劃應用不會產生不需要的免疫反應(例如形成抗 體)或即使產生免疫反應，那么也不認為這類反應是由臨床醫師評價的臨床上顯著的或重 要的。特別優選所述的水溶性聚合物是生物相容性的和非免疫原性的。此外，所述的聚合物的一般特征在于帶有2至約300個末端。這類聚合物的實例 包括，但不限于聚(亞烷基二醇類)諸如聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(〃 PPG")、乙二 醇和丙二醇的共聚物等，聚(氧乙基化多元醇)，聚(烯醇)，聚(乙烯基吡咯烷酮)，聚(羥 基烷基甲基丙烯酰胺)，聚(羥基烷基甲基丙烯酸酯)，聚(糖)，聚(α-羥基酸)，聚(乙 烯醇)，聚磷嗪，聚噁唑啉，聚(N-丙烯酰嗎啉)和任意上述物質的組合。所述的聚合物并不限于特定的結構且可以為線型(例如烷氧基PEG或雙官能 PEG)、支化或多臂的(例如叉形PEG或與多元醇核結合的PEG)、樹枝狀的或帶有可降解的 鍵。此外，可以以任意數量的不同模式構成聚合物的內部結構且這些結構可以選自均聚物、 交替共聚物、無規共聚物、嵌段共聚物、交替三聚體、無規三聚體和嵌段三聚體。一般來說，用適合于與因子VIII部分上的所需位質偶聯的合適活化基團活化PEG 和其它水溶性聚合物。活化的聚合物試劑將帶有與因子VIII部分反應的反應基團。用 于使這些聚合物與活性部分軛合的有代表性的聚合物試劑和方法是本領域中公知的且進 一步描述在hlipsky，S.等的“官能化聚(乙二醇)在多肽類修飾中的應用”(〃 Use of Functionalized Poly (Ethylene Glycols)for Modification of Polypeptides")-《聚乙二醇化學生物技術與生物醫學應用》(Polyethylene Glycol Chemistry =Biotechnical and Biomedical Applications), J.M.Harris, Plenus Press, New York(1992)； 禾口 Zalipsky (1995)《高級藥物綜述》(Advanced Drug Reviews)!^ 157-182。一般來說，共軛物中任意指定聚合物的標稱平均分子量為約100道爾頓至約 150，000道爾頓。然而，典型范圍包括大于5，000道爾頓至約100，000道爾頓范圍、約6，000 道爾頓至約90，000道爾頓范圍、約10，000道爾頓至約85，000道爾頓范圍、約20，000道爾 頓至約85，000道爾頓范圍和約53，000道爾頓至約85，000道爾頓范圍內的標稱平均分子 量。對任意指定的水溶性聚合物而言，優選具有這些分子量范圍的PE(^s。水溶性聚合物鏈段的典型標稱平均分子量包括約100道爾頓、約200道爾頓、約 300道爾頓、約400道爾頓、約500道爾頓、約600道爾頓、約700道爾頓、約750道爾頓、約 800道爾頓、約900道爾頓、約1，000道爾頓、約2，000道爾頓、約2，200道爾頓、約2，500 道爾頓、約3，000道爾頓、約4，000道爾頓、約4，400道爾頓、約5，000道爾頓、約6，000道 爾頓、約7，000道爾頓、約7，500道爾頓、約8，000道爾頓、約9，000道爾頓、約10，000道爾 頓、約11，000道爾頓、約12，000道爾頓、約13，000道爾頓、約14，000道爾頓、約15，000道 爾頓、約20，000道爾頓、約22，500道爾頓、約25，000道爾頓、約30，000道爾頓、約40，000 道爾頓、約50，000道爾頓、約60，000道爾頓和約75，000道爾頓。當用作聚合物時，PEG s—般包括許多(OCH2CH2)單體。本說明書上下文中所用的 重復單元數量由〃(OCH2CH2)n“中的下標〃 η"確定。因此，(η)值一般在如下范圍中的一 種或多種2至約2，300 ；約100至約2，300 ；約1；35至約2，000 ；約230至約1，900 ；約450 至約1，900 ；和約1，200至約1，900。對分子量已知的任意指定聚合物而言，通過用聚合物 的總分子量除以重復單元的分子量確定重復單元的數量(即“n")是可能的。用于本發明的一種特別優選的聚合物為封端聚合物，即帶有至少一個被相對惰性 的基團，諸如低級Cp6烷氧基封端的末端的聚合物。例如，當聚合物為PEG時，優選使用甲 氧基-PEG (常稱作mPEG)，它是PEG的線性形式，其中聚合物的一個末端為甲氧基(-OCH3)， 而另一個末端為羥基或可以任選進行化學修飾的其它官能團。在適用于本發明的一種形式中，游離或未結合的PEG為在每一末端上被羥基終止 的線型聚合物HO-CH2CH2O- (CH2CH2O)m, -CH2CH2-OH,其中(m') 一般在0至約4，000的范圍。可以將上述聚合物α -，ω-二羥基聚(乙二醇)表示為H0-PEG-0H的簡單形式，其 中可以理解-PEG-符號可以表示下列結構單元-CH2CH20-(CH2CH2O)m, -CH2CH2-，其中(m') 如上述所定義。適用于本發明的另一種類型的PEG為甲氧基-PEG-OH或簡寫為mPEG，其中一個末 端為相對惰性的甲氧基，而另一個末端為羥基。mPEG的結構如下所示。CH3O-CH2CH2O- (CH2CH2O) m’ -CH2CH2-OH其中(m')如上述所定義。諸如描述在美國專利No. 5，932，462中的那些多臂或支化PEG分子也可以被用作 PEG聚合物。例如，PEG可以具有如下結構
權利要求
1.綴合物，其包含經由可降解鍵或因子VIII多肽內所含的半胱氨酸殘基的巰基與該 因子VIII多肽共價結合的水溶性聚合物，其中所述因子VIII多肽選自由因子VIII、因子 Villa、因子VIII C、因子VIII :vWF和B-結構域缺失的因子VIII組成的組，并且其中所述 水溶性聚合物選自由聚(亞烷基二醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚Tl唑啉和 聚(丙烯酰嗎啉)組成的組。
2.權利要求1的綴合物，其中所述因子VIII多肽與一個、兩個、三個或四個水溶性聚合 物共價結合。
3.權利要求2的綴合物，其中所述因子VIII多肽與一個、兩個或三個水溶性聚合物共 價結合。
4.權利要求1的綴合物，其中所述水溶性聚合物是聚(環氧烷)。
5.權利要求4的綴合物，其中所述水溶性聚合物是聚(乙二醇)。
6.權利要求5的綴合物，其中所述的聚(乙二醇)被封端部分封端，所述的封端部分選 自由羥基、烷氧基、取代的烷氧基、鏈烯氧基、取代的鏈烯氧基、炔氧基、取代的炔氧基、芳氧 基和取代的芳氧基組成的組。
7.權利要求6的綴合物，其中所述的聚(乙二醇)被甲氧基封端。
8.權利要求6的綴合物，其中所述的聚(乙二醇)被羥基封端。
9.權利要求5的綴合物，其中所述的聚(乙二醇)具有的標稱平均分子量在大于5，000 道爾頓至150,000道爾頓的范圍內。
10.權利要求9的綴合物，其中所述的聚(乙二醇)具有的標稱平均分子量在10，000 道爾頓至85，000道爾頓的范圍內。
11.權利要求10的綴合物，其中所述的聚(乙二醇)具有的標稱平均分子量在20，000 道爾頓至85，000道爾頓的范圍內。
12.權利要求1的綴合物，其中所述水溶性聚合物為線型的。
13.權利要求1的綴合物，其中所述水溶性聚合物為支化的。
14.權利要求1的綴合物，其中所述的因子VIII多肽選自由因子VIII、因子Villa、因 子VIII:C和因子VIII: vWF組成的組。
15.權利要求1的綴合物，其中所述的因子VIII多肽為B-結構域缺失的因子VIII。
16.權利要求1的綴合物，其中所述的因子VIII多肽為因子VIII:vWF。
17.權利要求1的綴合物，其中所述的因子VIII多肽為重組的因子VIII多肽。
18.權利要求1的綴合物，其中所述的因子VIII多肽是從血液中獲得的。
19.權利要求5的綴合物，其中該綴合物是單PEG化的。
20.權利要求5的綴合物，其中該綴合物是二PEG化的。
21.權利要求1的綴合物，其包含經由可降解鍵與因子VIII多肽共價結合的水溶性聚 合物。
22.權利要求21的綴合物，其中所述鍵是水解可降解的，以允許釋放母體因子VIII多肽。
23.權利要求21的綴合物，其中所述水解可降解的鍵選自由羧酸酯、磷酸酯、硫羥酸 酯、酸酐類、縮醛類、酮縮醇類、酰氧基烷基醚、亞胺類和原酸酯類組成的組。
24.權利要求1的綴合物，其包含經由因子VIII多肽內所含的半胱氨酸殘基的巰基與因子VIII多肽共價結合的水溶性聚合物。
25.權利要求對的綴合物，其中所述因子VIII多肽是經修飾以便添加半胱氨酸殘基的 因子VIII多肽，所述半胱氨酸殘基與所述水溶性聚合物共價結合。
26.權利要求25的綴合物，其中所述因子VIII多肽是經修飾以便添加半胱氨酸殘基的 B-結構域缺失的因子VIII，所述半胱氨酸殘基與所述水溶性聚合物共價結合。
27.權利要求25或沈的綴合物，其中所述水溶性聚合物是聚(乙二醇)并且所述綴合 物是單PEG化的。
28.權利要求對的綴合物，其中所述水溶性聚合物經由位于所述因子VIII多肽的Al 亞基內的半胱氨酸殘基的巰基與所述因子VIII多肽共價結合。
29.權利要求M的綴合物，其中所述水溶性聚合物經由位于所述因子VIII多肽的A2 亞基內的半胱氨酸殘基的巰基與所述因子VIII多肽共價結合。
30.權利要求M的綴合物，其中所述水溶性聚合物經由位于所述因子VIII多肽的A3 亞基內的半胱氨酸殘基的巰基與所述因子VIII多肽共價結合。
31.權利要求對的綴合物，其中所述水溶性聚合物經由位于所述因子VIII多肽的Cl 亞基內的半胱氨酸殘基的巰基與所述因子VIII多肽共價結合。
32.權利要求M的綴合物，其中所述水溶性聚合物經由位于所述因子VIII多肽的C2 亞基內的半胱氨酸殘基的巰基與所述因子VIII多肽共價結合。
33.權利要求對的綴合物，其是通過末端為馬來酰亞胺的水溶性聚合物與所述半胱氨 酸殘基的巰基反應而形成的。
34.權利要求對的綴合物，其中所述水溶性聚合物經由硫醚鍵與所述因子VIII多肽共 價結合。
35.權利要求對的綴合物，其中所述水溶性聚合物經由二硫鍵與所述因子VIII多肽共 價結合。
36.組合物，其包含一種或多種根據權利要求21的綴合物。
37.組合物，其包含一種或多種根據權利要求M的綴合物。
38.組合物，其包含多種權利要求21或M的單PEG化或二PEG化因子VIII多肽綴合 物，其中所述水溶性聚合物是聚(乙二醇)。
39.權利要求38的組合物，其中該組合物不含所述綴合物的位置異構體。
40.權利要求36或37的組合物，其中該組合物不含清蛋白。
41.權利要求36或37的組合物，其中該組合物不含沒有因子VIII活性的蛋白質。
42.權利要求36或37的組合物，其呈凍干的形式。
43.權利要求36或37的組合物，其呈液體形式。
44.權利要求36或37的組合物，它進一步包含藥物上可接受的賦形劑。
全文摘要
本發明提供了聚合物-因子VIII多肽綴合物。一般來說，所述的水溶性聚合物為聚(乙二醇)或其衍生物。本發明還提供了包括所述綴合物的組合物、制備所述綴合物的方法和對患者給予包括所述綴合物的組合物的方法。
文檔編號A61K38/19GK102139114SQ201010541868
公開日2011年8月3日 申請日期2004年2月26日 優先權日2003年2月26日
發明者M·D·本特利, M·J·博薩德 申請人:尼克塔治療公司