專利名稱：一種星形高分子納米微球及其制法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種可生物降解的星形高分子納米微球，可以用作藥物載體，具體地說，可以作為紫杉醇的載體。
背景技術：
紫杉醇是一種從紫杉(Taxus brevifolia)的樹皮中提取的化合物，是微管的特異性穩(wěn)定劑，可以促進微管的裝配和保持微管的穩(wěn)定的藥物。在細胞中，紫杉醇結合到聚合的微管上，而不與未聚合的微管蛋白二聚體反應。細胞接觸紫杉醇后會在細胞內積累大量的微管，這些微管的積累干擾了癌癥細胞的正常功能(使細胞分裂停止于有絲分裂期， 阻斷細胞的正常分裂)。紫杉醇主要適用于卵巢癌和乳腺癌，對肺癌，大腸癌，黑色素瘤， 頭頸部癌，淋巴瘤和腦瘤等也都有療效。由于紫杉醇在水溶液中的溶解度僅為0.006 mg/ mL，因此商業(yè)上應用的紫杉醇是泰素(TaxoD。雖然泰素中含有一種叫做聚氧乙烯蓖麻油 (Cremophor EL)的化合物，具有優(yōu)良的增溶能力和乳化能力，能解決紫杉醇的低溶解度問題，但是使用這種助溶劑可以導致很多的不良反應(包括過敏反應和神經毒性等)。隨著納米技術的興起，使得基于生物可降解的并且生物相容性的雙親性高分子為載體的藥物輸送體系受到人們的廣泛關注。一般說來，雙親性嵌段高分子可以在水中自組裝形成納米尺度的納米球型粒子，親水部分形成微球的球殼，疏水部分則成為內核。這種納米微球可以用于負載疏水性的藥物，增加疏水藥物的濃度，控制藥物釋放速度，延長藥物的半衰期，提高藥物的利用效率以及減輕化療藥物帶來的副作用。線性高分子的納米微球在注射到人體內之后由于血流稀釋和血流剪切力的作用，很容易發(fā)生解離。這時，包裹在納米微球中的藥物還沒有到達腫瘤部位的時候就會提前釋放出來，就減弱了納米藥物載體的功能從而影響到治療的效果，因此納米微球的物理穩(wěn)定性成為困擾納米載體的很大問題。由于星形高分子的臨界聚集濃度比同等的線性的高分子低，因此星形高分子形成的納米微球比線性高分子形成的納米微球有更好的熱力學穩(wěn)定性。正是基于星形雙親性高分子的納米微球比線性高分子的納米微球的熱力學穩(wěn)定的優(yōu)點，使得星形高分子的納米微球能夠解決線性高分子的納米微球由于血流的作用而引起的不穩(wěn)定問題。因此，近年來基于星形高分子的納米微球越來越得到人們的關注。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種生物相容，可以生物降解的，可用作藥物載體高分子納米微球及其制備方法。本發(fā)明的技術方案如下
一種星形高分子的納米微球，它是以5，10，15，20-四(4-氨基苯基)卟啉或者雙嘧達莫(Dipyridamole)為核的星形高分子的納米微球，它的表面是親水的聚乙二醇，內部是疏水的聚已-己內酯，經凝膠色譜測定高分子的分子量為3000(Γ50000，親水部分聚乙二醇的數均分子量為5000X4，疏水部分聚己內酯數均分子量為1000(Γ30000，納米微球的平均粒徑通過動態(tài)光散射儀測定為2(T60 nm。一種制備上述的星形高分子納米微球的方法，它包括如下步驟
步驟1.在惰性氣體保護下，5，10，15，20-四(4-氨基苯基)卟啉或者雙嘧達莫(Dipyridamole)、f -己內酯和催化量的辛酸亞錫加到反應瓶中，所述的5，10， 15，20-四(4-氨基苯基)卟啉或雙嘧達莫、己內酯和辛酸亞錫的投料比為0.025 mmol:0. ΟΟΓΟ. 005 mmol:2 7 mmol。在100_160°C攪拌下反應1-4天，所得固體溶解于二氯甲烷或四氫呋喃中，加入到冷的甲醇中沉淀，得到的固體真空干燥；
步驟2.將步驟1得到的以卟啉或雙嘧達莫為核的聚己內酯和數均分子量為5000 的單甲氧基羧基聚乙二醇(末端為羧基甲氧基聚乙二醇)在90 °〇下加熱真空抽氣2-4 h， 冷卻后，將4-二甲氨基吡啶對甲基苯磺酸鹽(DTPQ的二氯甲烷溶液加入到反應瓶中，再將 N, 二環(huán)乙基碳二亞胺的二氯甲烷溶液加入到上述溶液中，混合物室溫下攪拌反應2-4 d，過濾，濾液在乙醚中沉淀，真空干燥，將所得固體溶解在丙酮中，加入到水溶液中透析除去未反應的聚乙二醇，凍干，即得星形高分子，所述的以卟啉或雙嘧達莫為核的聚己內酯，單甲氧基羧基聚乙二醇，4-二甲氨基吡啶對甲基苯磺酸鹽，#，二環(huán)乙基碳二亞胺的投料比為 0.0052 mmol :0. 025 0. 05 mmol :0. θΓθ. 02 mmol :0. 025^0. 6 mmol ；
步驟3.將上述的星形高分子通過納米沉淀的方法得到空白的納米微球，其步驟為 將步驟2得到的星形高分子溶于乙醇中，將乙醇溶液在4(T60 °C下攪拌加入到熱水中，冷至室溫，減壓蒸去溶液中的乙醇得到納米微球的水溶液，所得納米微球的平均粒徑為2(Γ60 nm，所述的星形高分子，乙醇，熱水用量比為10 mg:廣1.5 mL:2 3 mL。一種負載有紫杉醇的星形高分子納米微球，它是以上述的星形高分子納米微球作為載體，負載有紫杉醇，紫杉醇的質量占納米微球總質量的3-5 %。一種制備負載紫杉醇的納米微球的方法將上述步驟2得到的星形高分子和紫杉醇混溶在乙醇中，將上述溶液攪拌加入到4(T60 °C的熱水中，冷至室溫，減壓蒸去乙醇， 得到負載紫杉醇的納米微球的水溶液，所述的星形高分子，紫杉醇，乙醇，熱水的投料比為 10 mg:0.4 0· 75 mg:l 1.5 mL:2 3 mL。本發(fā)明制備的負載紫杉醇的納米微球可以用作藥物載體，還可能用作熒光標記。本發(fā)明的負載紫杉醇的納米微球具有很好的藥物緩釋功能。本發(fā)明的復合納米微球生物相容性好，化學性質穩(wěn)定。本發(fā)明的復合納米微球可以用作藥物載體，還可能用作熒光標記。本發(fā)明的負載紫杉醇的納米微球具有很好的藥物緩釋功能。


圖1為載有紫杉醇的星形高分子納米微球的體外釋放曲線；
圖2為載有紫杉醇的星形高分子納米微球在腫瘤小鼠中的熒光標記功能。
具體實施例方式下面結合實施例進一步闡明本發(fā)明的內容，但是這些實施例并不限制本發(fā)明的保護范圍。實施例1:5，10，15，20-四(4-氨基苯基)卟啉(TAPP)作為引發(fā)劑引發(fā)聚合己內酯
氬氣保護下，將 TAPP (16. 85 mg, 0. 025mmol)，辛酸亞錫(1. 00 mg, 0. 0025 mmol), ε -己內酯(0. 7 g, 6. 14 mmol)加入到10 mL圓底燒瓶中，混合物在110°C加熱攪拌反應 72 h。反應完成后，固體溶解于二氯甲烷中，在冷的甲醇中沉淀。過濾，乙醚洗滌，真空干燥， 得到聚 f -己內酯化合物(TAPP-PCL)。1H WR (CDCl3, 300ΜΗζ) δ 1. 39 (m, 2H)，1. 63 (m, 4H)，2. 30 (t, 2H)，4.05 (t, 2H)，7.94 (d, porphyrin)，8. 14 (s, porphyrin)， 8.85 (s，porphyrin)。經體積排阻色譜測定高分子的分子量為23394。實施例2 雙嘧達莫作為引發(fā)劑引發(fā)聚合己內酯
氬氣保護下，將雙嘧達莫(12. 61 mg, 0. 025mmol)，辛酸亞錫(1.00 mg, 0. 0025 mmol), f -己內酯(0. 7 g, 6. 14 mmol)加入到10 mL圓底燒瓶中，混合物在110°C加熱攪拌反應72 h。反應完成后，固體溶解于二氯甲烷中，在冷的甲醇中沉淀。過濾，乙醚洗滌，真空干燥，得到聚 f -己內酯化合物(Dipyridamole-PCL)。ldH NMR (CDCl3, 300ΜΗζ) δ 1.39 (m, 2H), 1.63 (m, 4H)，2. 30 (t, 2H)，4.05 (t, 2H)，1. 72 (m, dipyridamole), 3.81 (m, dipyridamole), 4.27 (m, dipyridamole)。經體積排阻色譜測定高分子的分子量為22985。實施例3:5，10，15，20-四(4_氨基苯基)卟啉(TAPP)作為引發(fā)劑引發(fā)聚合己內酯
氬氣保護下，將 TAPP (16. 85 mg, 0. 025mmol)，辛酸亞錫(1. 00 mg, 0. 0025 mmol), ε -己內酯(0. 3 g, 6. 14 mmol)加入到10 mL圓底燒瓶中，混合物在110°C加熱攪拌反應 72 h。反應完成后，固體溶解于二氯甲烷中，在冷的甲醇中沉淀。過濾，乙醚洗滌，真空干燥， 得到聚 f -己內酯化合物(TAPP-PCL)。1H WR (CDCl3, 300ΜΗζ) δ 1. 39 (m, 2H)，1. 63 (m, 4H)，2. 30 (t, 2H)，4.05 (t, 2H)，7.94 (d, porphyrin)，8. 14 (s, porphyrin)， 8. 85 (s，porphyrin)。經體積排阻色譜測定高分子的分子量為12674。實施例4 以卟啉為核星形嵌段高分子的合成
將 MPE0-C00H (125 mg, 0. 025mmol)，實施例 1 制得的 TAPP-PCL (140 mg, 0.0052 mmol)加入到圓底燒瓶中，在90°C加熱真空抽氣4 h，除去反應物中的少量溶劑和水汽。冷卻至室溫，將4-二甲氨基吡啶對甲基苯磺酸鹽(DTPS) (6 mg, 0. 02 mmol)溶解在15 mL 二氯甲烷中，然后加入到上述反應混合物中。將A； 二環(huán)乙基碳二亞胺(12 mg, 0. 06 mmol)溶在2 mL 二氯甲烷中后加入到上述溶液中。反應混合物室溫下攪拌反應4 d。將所得溶液過濾，濾液在乙醚中沉淀。過濾出沉淀，真空干燥。將所得固體溶解在丙酮中，加入到水中。蒸除丙酮，用截留分子量為15000的透析袋透析，除去未反應的mPE0-C00H。冷凍干燥，得到固體星形嵌段高分子 TAPP-PCL-mPEO。1H NMR (CDCl3, 300ΜΗζ) δ 1.39 (m, 2H), 1. 63 (m, 4H)，2. 30 (t, 2H)， 4. 06 (t, 2H)，3. 65 (s, 8· 90H)。經體積排阻色譜測定高分子的分子量為47803。實施例5 以雙嘧達莫為核星形嵌段高分子的合成
將 MPE0-C00H (125 mg, 0. 025mmol)，實施例 2 制得的 Dipyridamole-PCL (139 mg, 0.0052 mmol)加入到圓底燒瓶中，在90°C加熱真空抽氣4 h，除去反應物中的少量溶劑和水汽。冷卻至室溫，將4-二甲氨基吡啶對甲基苯磺酸鹽(DTPS) (6 mg, 0. 02 mmol)溶解在15 mL 二氯甲烷中后加入到反應瓶的上述反應混合物中。再將#，二環(huán)乙基碳二亞胺(12 mg, 0. 06 mmol)溶在2 mL 二氯甲烷中后加入到上述溶液中。混合物室溫下攪拌反應 4 d。所得溶液過濾，濾液在乙醚中沉淀。過濾出沉淀，真空干燥。所得固體溶解在丙酮中， 加入到水中。蒸除丙酮，用截留分子量為15000的透析袋透析，除去未反應的mPEO-COOH。 冷凍干燥得到固體星形嵌段高分子Dipyridamole-PCL-IiiPEOtj1H NMR (CDCl3, 300MHz) δ 1. 39 (m, 2H), 1. 63 (m, 4H)，2. 30 (t, 2H)， 4. 06 (t, 2H)，3. 65 (s, 8· 89H)。經體積排阻色譜測定高分子的分子量為46927。實施例6 以卟啉為核星形嵌段高分子的合成
將MPE0-C00H (210 mg, 0. 042mmol)，實施例 3 制得的 TAPP-PCL (127 mg, 0. 01 mmol) 加入到圓底燒瓶中，在90°C加熱真空抽氣4 h，除去反應物中的少量溶劑和水汽。冷卻至室溫，將4-二甲氨基吡啶對甲基苯磺酸鹽(DTPS) (6 mg, 0. 02 mmol)溶解在15 mL 二氯甲烷中，然后加入到上述反應混合物中。將A； 二環(huán)乙基碳二亞胺(12 mg, 0. 06 mmol)溶在2 mL 二氯甲烷中后加入到上述溶液中。反應混合物室溫下攪拌反應4 d。將所得溶液過濾，濾液在乙醚中沉淀。過濾出沉淀，真空干燥。將所得固體溶解在丙酮中，加入到水中。 蒸除丙酮，用截留分子量為15000的透析袋透析，除去未反應的mPE0-C00H。冷凍干燥，得到固體星形嵌段高分子 TAPP-PCL-mPEO。1HWR (CDCl3, 300ΜΗζ) δ 1. 39 (m, 2H)，1. 63 (m, 4H), 2. 30 (t, 2H)， 4. 06 (t, 2H)，3. 65 (s, 8· 90H)。經體積排阻色譜測定高分子的分子量為32803。實施例7 負載紫杉醇的星形嵌段高分子TAPP-PCL-mPEO納米微球的制備
將10 mg實施例3制得的星形嵌段高分子TAPP-PCL-mPEO納米微球和0. 75 mg紫杉醇溶于1 mL乙醇中，攪拌下加入到2 mL熱水中(50°C)。冷至室溫，減壓蒸除乙醇。用濾膜 (0.22 μ m)過濾除掉沒有包覆的紫杉醇(紫杉醇在水溶液中的溶解度為0.006 mg/mL，紫杉醇在水溶液會生成結晶)，得到負載紫杉醇的星形高分子納米微球。經過動態(tài)光散射測定這種納米微球的粒徑分布在2(T60 nm，納米微球的載藥量經高效液相色譜測定為5%。實施例8 負載紫杉醇的嵌段高分子Dipyridamole-PCL-mPEO納米微球的制備
將10 mg實施例4制得的星形嵌段高分子Dipyridamole-PCL-mPEO納米微球和0. 5 mg 紫杉醇溶于1 mL乙醇中，攪拌下加入到2 mL熱水中(50°C)。冷至室溫，減壓蒸除乙醇。用濾膜(0.22 μ m)過濾除掉沒有包覆的紫杉醇(紫杉醇在水溶液中的溶解度為0.006 mg/ mL，紫杉醇在水溶液會生成結晶)，得到負載紫杉醇的星形高分子納米微球。經過動態(tài)光散
射測定這種納米微球的粒徑分布在2(T60 nm，納米微球的載藥量經高效液相色譜測定為4%。實施例9 負載紫杉醇的嵌段高分子Dipyridamole-PCL-mPEO納米微球的制備
將10 mg實施例4制得的星形嵌段高分子Dipyridamole-PCL-mPEO納米微球和0. 4 mg 紫杉醇溶于1 mL乙醇中，攪拌下加入到2 mL熱水中(50°C)。冷至室溫，減壓蒸除乙醇。用濾膜(0.22 μ m)過濾除掉沒有包覆的紫杉醇(紫杉醇在水溶液中的溶解度為0.006 mg/ mL，紫杉醇在水溶液會生成結晶)，得到負載紫杉醇的星形高分子納米微球。經過動態(tài)光散
射測定這種納米微球的粒徑分布在2(T60 nm，納米微球的載藥量經高效液相色譜測定為3%。實施例10 載有紫杉醇的星形高分子納米微球的體外釋放
取實施例7或8中制得的1 mL載有紫杉醇的星形高分子納米微球的水溶液(所含紫杉醇的量為0. 5 mg)放在透析袋(Cut-off分子量為12000)中，然后將透析袋完全浸入1 M水楊酸鈉溶液(10 mL)中，在37 ° C攪拌下進行釋放試驗。每隔一定的時間取出1 mL 釋放介質。用高效液相色譜通過標準曲線的方法測定樣品中阿霉素的含量。并根據含量來計算釋放的百分率，結果見圖1所示，可以看出負載于其中的藥物表現出持續(xù)釋放的特性。
實施例11 載有紫杉醇的星形高分子納米微球的熒光標記功能
小鼠模型采用皮下注射的方式接種于ICR小鼠(左側腋下，每只0.2 ml)。種植后7-8 天，選擇腫瘤體積100 mm3左右的小鼠。取實施例5中制得的負載紫杉醇納米微球，注射入小鼠體內通過近紅外熒光成像的方法來診斷腫瘤的部位。注射入小鼠體內12小時后，如圖 2所示觀察到納米微球主要集中在腫瘤部位，通過近紅外活體成像儀(CRI，Inc.，Woburn, MA)中進行造影的方法可以用來診斷腫瘤的位置。
權利要求
1.一種星形高分子的納米微球，其特征是它是以5，10，15，20-四(4-氨基苯基) 卟啉或者雙嘧達莫為核的星形高分子的納米微球，它的表面是親水的聚乙二醇，內部是疏水的聚f -己內酯，高分子納米微球的分子量為3000(Γ50000，親水部分的數均分子量為 5000 X 4，疏水的部分的數均分子量為10000 30000，納米微球的平均粒徑為20 60 nm。
2.一種制備權利要求1所述的星形高分子納米微球的方法，其特征是它包括如下步驟步驟1.在惰性氣體保護下，5，10，15，20-四(4-氨基苯基)卟啉或者雙嘧達莫 (Dipyridamole)、ε -己內酯和催化量的辛酸亞錫加到反應瓶中，在100_160°C攪拌下反應 1-4天，所得固體溶解于二氯甲烷或四氫呋喃中，加入到冷的甲醇中沉淀，得到的固體真空干燥；步驟2.將步驟1得到的以卟啉或雙嘧達莫為核的聚己內酯和平均分子量為5000 的單甲氧基羧基聚乙二醇(末端為羧基甲氧基聚乙二醇)在90 °〇下加熱真空抽氣2-4 h， 冷卻后，將4-二甲氨基吡啶對甲基苯磺酸鹽(DTPQ的二氯甲烷溶液加入到反應瓶中，再將 N, 二環(huán)乙基碳二亞胺的二氯甲烷溶液加入到上述溶液中，混合物室溫下攪拌反應2-4 d，過濾，濾液在乙醚中沉淀，真空干燥，將所得固體溶解在丙酮中，加入到水溶液中透析除去未反應的聚乙二醇，凍干，即得星形高分子；步驟3.上述的星形高分子通過納米沉淀的方法得到空白的納米微球高分子溶于乙醇中，將乙醇溶液在4(Γ60 ！下攪拌加入到熱水中，冷至室溫，減壓蒸去溶液中的乙醇得到納米微球的水溶液，納米微球的平均粒徑分布為2(T60 nm。
3.根據權利要求2所述的步驟1的方法，其特征是5，10，15，20-四(4-氨基苯基) 卟啉，雙嘧達莫，己內酯，辛酸亞錫的投料比為0. 025 mmol:0. ΟΟΓΟ. 005 mmol:2 7 mmol。
4.根據權利要求2所述的步驟2的方法，其特征是以卟啉或雙嘧達莫為核的聚己內酯，單甲氧基羧基聚乙二醇，4-二甲氨基吡啶對甲基苯磺酸鹽，#，二環(huán)乙基碳二亞胺的投料比為 0.0052 mmol :0. 025 0. 05 mmol :0. θΓθ. 02 mmol :0. 025^0. 6 mmol。
5.根據權利要求2所述的步驟3的方法，其特征是高分子，乙醇，熱水投料比為10 mg:1 L 5 mL:2 3 mL。
6.一種負載有紫杉醇的星形高分子納米微球，其特征是它是以權利要求1所述的星形高分子納米微球作為載體，負載有紫杉醇，紫杉醇的質量占納米微球總質量的5、％。
7.一種制備權利要求6所述的負載紫杉醇的星形高分子納米微球的方法，其特征是 一種制備負載紫杉醇的納米微球的方法將上述的星形高分子和紫杉醇混溶在乙醇中，將上述溶液攪拌加入到4(T60 °C的熱水中，冷至室溫，減壓蒸去乙醇，得到負載紫杉醇的納米微球的水溶液。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征是星形高分子，紫杉醇，乙醇，熱水的投料比為 10 mg:0.4 0· 75 mg:l 1.5 mL:2 3 mL。
9.根據權利要求6所述的負載紫杉醇的納米微球用作藥物載體，還能用作熒光標記。
10.根據權利要求6所述的負載紫杉醇的納米微球作為紫杉醇藥物的緩釋劑型。
全文摘要
一種以5,10,15,20-四(4-氨基苯基)卟啉或者雙嘧達莫(Dipyridamole)為核的星形高分子的納米微球，其特征是它的表面是親水的聚乙二醇，內部是疏水的聚ε-己內酯，高分子納米微球的分子量為30000~50000，親水部分的分子量為5000×4，疏水的部分的分子量為10000~30000，納米微球的平均粒徑為20~60nm。本發(fā)明的復合納米微球生物相容性好，化學性質穩(wěn)定。本發(fā)明的星形高分子納米微球可以用作藥物載體，并有緩釋作用，還可能用作熒光標記。本發(fā)明公開了其制法及其用途。
文檔編號A61K31/337GK102228442SQ201110172560
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月24日 優(yōu)先權日2011年6月24日
發(fā)明者張亞軍, 張魯中, 武偉, 蔣錫群 申請人:南京大學