專利名稱：兩親聚合物-pdgf復合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及與兩親聚合物結合的血小板源生長因子(PDGF)的新型復合物，其可以改善用于藥物應用的治療性蛋白質的體外和體內物理和化學穩定性。
背景技術：
PDGF類是通過經由兩個二硫化物橋彼此連接的兩個多肽鏈構成的大約30000道爾頓的糖蛋白類。已經識別出四種類型的鏈:A、B、C和D。天然蛋白質以同二聚體或AB型異二聚體的形式存在(Oefner C.EMBO J.11，3921-2926，1992)。PDGF最初分離自血小板。TOGF類是在血液凝結過程中釋放出來的能夠促進各種細胞類型的生長的生長因子(Ross R等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 1974,71，1207 ；Kohler N.&Lipton A., Exp.Cell Res.，1974，87，297)。已知的是，血小板以外的某些細胞也會產生TOGF，其對于多數源自間葉細胞的細胞即血液、肌肉、骨骼和軟骨細胞以及結締組織細胞來說是促有絲分裂的(Raines E.ff., “Biology of Platelet-Derivated GrowthFactor (血小板源生長因子生物學)”，1993, Westermark, B.和 C.Sorg, Ed.Basel, Kerger,第74頁)。許多文章往往也證實，巨噬細胞源TOGF對于平滑肌細胞起到趨化和促有絲分裂劑的作用并且其有助于動脈硬化特有的動脈壁的肌內膜增厚(Ross R等人，Science(科學)，1990，248，1009)。PDGF的活性此外還特別包括刺激嗜中性單核細胞的微粒釋放(Tzeng D.Y等人，Blood (血液),1985, 66, 179),促進間質細胞的類固醇合成(RisbridgerG.P., Mol.Cell, Endocrinol., 1993,97，125)，刺激嗜中性吞噬作用(Wilson E 等人，Proc.Natl.Acad.Sc 1.USA, 1987，84，2213)，調節凝血栓蛋白表達和分泌(Majak R.A等人，J.Biol.Chem.，1987，262，8821)，以及血管平滑肌細胞中ICAM-1基因的后調節(MorisakiN 等人，Biochem.Biophys.Res.Commun., 1994, 200, 612)。由于這些不同性質，已經設想了重組I3DGF類在制藥領域中的應用。I3DGF已經特別被批準用于糖尿病足部潰瘍的治療(Regranex, J&J)和用于牙周修補(GEM21S, Biomimetic)0潰瘍愈合，就像一般來說的皮膚愈合一樣，是一種復雜的現象，其要求許多細胞類型隨時間和在空間上的協調干預，這可以概括為三個階段:發炎階段、增殖階段和重塑階段。在對正常愈合而言大約7天的發炎階段中，巨噬細胞殺死細菌，清除受損組織并使組織再生。為此，巨噬細胞分泌出膠原酶、細胞因子和生長因子。在對正常愈合而言從第3天到第三周的增殖階段的過程中，相繼發生三個事件。傷口被肉芽組織填充，血管生成且傷口被上皮細胞覆蓋。肉芽組織從邊緣向中心生長。成纖維細胞大量產生III型膠原。
在從第3周到I甚至2年的重塑過程中，肉芽組織成熟，且成纖維細胞產生較少膠原。通過細胞凋亡消除肉芽形成過程中形成的沒用的血管。III型膠原被I型膠原替代，其依照張力線組織和交聯。在此過程中，TOGF起到基本作用。在傷口形成過程中，血小板聚集并釋放roGF。roGF將嗜中性白細胞、巨噬細胞和成纖維細胞引向傷口并且是有力的促細胞分裂劑。巨噬細胞和內皮細胞又合成和分泌roGF。roGF刺激成纖維細胞產生新的細胞外基質，基本是非膠原化合物，例如葡胺聚糖和粘著蛋白(J.F.Norton等人，Essential practice ofsurgery (外科基本實踐),Springer, 2003,第 7 章，77-89)。慢性傷口例如糖尿 病足部潰瘍、靜脈潰瘍和壓瘡具有愈合非常緩慢且有時不完全的特性，這是因為愈合過程不是正常進行(R.Lobmann等人，J.0f Diabetes and itscomplications (糖尿病及其并發癥雜志)，2006, 20, 329-335)。愈合過程實際上是消除對組織的損傷所必須的破壞過程與引起新組織形成的修復過程之間的精妙平衡。蛋白酶和生長因子在此過程中通過調節此平衡來發揮基本作用。在慢性傷口的情況下，這種平衡向著有利于破壞的方向被擾亂，因此這些傷口的愈合緩慢。盡管存在不同類型的慢性傷口，但是在它們以持續發炎階段(這造成高的蛋白酶含量并因此降低生長因子活性)為特征的意義上，它們在生物化學上相對類似(G.Lauer 等人，J.1nvest.Dermatol.115 (2000) 12-18)。這種生長因子的劣化造成與這些慢性傷口有關的組織的整體損失，這不利于愈合(D.R.Yager等人，J.1nvest.Dermatol.107(1996)743-748)。目前在市場上存在與國際非有產權名稱“becaplermin(貝卡普勒明)”對應的，以商品名Regranex 出售的人重組fogf-ββ-基藥品。這種藥品用于糖尿病的下肢潰瘍的治療。其是局部施用的凝膠形式并且能夠促進潰瘍愈合。其就像內源roGF—樣特別能夠促進細胞增殖并因此促進新組織的形成。這種治療的效力有限(Cullen等人，The international journal ofbiochemistry&Cell Biology (國際生物化學與細胞生物學雜志)34，1544-1556, 2002),即使臨床研究已經顯示了在愈合和愈合所需的時間周期方面的改進(Greenhalgh等人，American Journal of pathology (美國病理學雜志)，136, 1235-12461990 ；Ladin Plasticand Reconstructive Surgery (Ladin 整形和重建外科學)，105, 1230-12312000 ； Ho I loway等人，Wounds, 5/4, 198-206 ；Mandracchia 等人，Clinics in Podiatric Medecine andSurgery (足病醫學和外科學臨床)，18，189-2092001 ;Wieman T.J.American Journal ofSurgery (美國外科學雜志)，176，74S-79S1998)。J&J出售的含有roGF-BB的Regranex產品已經通過將治療的患者的康復率提高至50%而證實了其效力，與之相比，僅接受標準傷口治療的患者的康復率僅為36%。盡管在糖尿病足部潰瘍的治療中具有這種顯著改進，但必須指出，只有50%患者在長期和昂貴的治療后實現康復。在未康復的情況下，后果可能極其嚴重，在許多情況下則導致下肢切除。應該補充的是，該治療的平均持續時間非常長，大約20周，且其施用昂貴并有限制，這是因為必須清潔傷口并在早晨施用Regranex，然后在12小時后清潔傷口。這兩個程序大多需要護士的護理。此外，持續20周的平均治療成本過高(大約1400美元)。可以通過roGF在要治療的傷口上的迅速降解來解釋這種部分效力。這種降解在慢性傷口的情況下來自持續的發炎狀態，這由于刺激蛋白酶的過度生產而在傷口上產生對PDGF不利的環境。盡管降解控制對于傷口愈合是必須的，但過度的蛋白水解活性是有害的，因為其造成細胞外基質的降解(F.Grinnell 等人，J.1nvest.Dermatol.106 (1996) 335-341 和C.N.Rao等人，J.1nvest.Dermatol.105(1995)572-578)和具有關鍵功能性作用的分子如生長因子的降解(V.Falanga 等人，J.Derm.Surg.0ne.18 (1992) 604-606 ；D.R.Yager 等人，Wound Rep, Reg.5 (1997) 23-32.和 M.Wlaschek 等人，Br.J.Dermatol.137(1997)646-647)。實際上，生長因子如H)GF、TGF^或bFGF由于它們誘發細胞遷移、增殖、蛋白質合成和基質形成的能力，并且更一般地由于它們控制修復過程的事實而成為愈合過程中的關鍵因素。但是，這些生長因子是蛋白質分子并因此對蛋白水解降解敏感。一些研究表明，在它們與來自慢性傷口的流體接觸時，如I3DGF這樣的生長因子的降解快得多，這是因為它們含有高濃度的金屬蛋白酶(D.R.Yager 等人，J.1nvest.Dermatol.107 (1996) 743-748)。對于靜脈潰瘍的治療，在出版物(T.J.ffieman, Wounds, 2003,卷15, N0.8,257-264)中報道的試驗性臨床研究中，與基于用加壓療法常規清潔傷口的現有治療相比，Regranex僅表現出輕微改進。在蛋白質生成過程中體現出例如I3DGF的不穩定性的問題。已知的是，I3DGF對轉譯后的蛋白水解特別敏感(Hart等人，Biochemistry (生物化學)29:166-172, 1990和美國專利序列號07/557，219)，尤其是在蛋白質的成熟鏈的位置32處的精氨酸氨基酸與位置33處的蘇氨酸氨基酸之間的結合程度上。其它位置對蛋白水解敏感，例如I3DGF的B鏈的位置79處的精氨酸與位置80處的賴氨酸之間的結合，或位置27處的精氨酸與位置28處的精氨酸之間的結合。這種蛋白水解不穩定性在獲得這種蛋白質方面具有嚴重問題，其根據美國專利N0.4，845，075中所述的方法在酵母中以重組方式制成。具體而言，美國專利N0.7，084, 262教導我們，PDGF-BB的分析和提純導致由轉譯后內切蛋白酶解裂解產生21種異型。這種極大的結構異質性因此導致基因 工程產生的蛋白質活性與成熟形式的完整蛋白質相比降低50%。此外，根據日期為2006年8月14日的關于在14周后尚未康復的糖尿病足部潰瘍的新聞公報(WWW, prnewswire.com), Cardium最近的臨床結果表明使用F1DGF-BB的治療可以提供的潛力。Cardium提出的解決方案在于在傷口細胞中引入表達TOGF-BB的基因以使其局部過度表達。借助腺病毒載體的這種基因療法在15位患者組中能夠使耐受普通治療的這些糖尿病足部潰瘍愈合接近80%。這種治療方案是有前途的。但是，由于與腺病毒型病毒載體的使用有關的安全性，基因療法的制藥發展迄今仍然非常危險。因此需要改進和有可能改進使用I3DGF的糖尿病足部潰瘍的現有治療。在糖尿病足部潰瘍治療的情況下，最終目的是三重的:-加速康復-提高康復率-簡化治療程序。也存在靜脈潰瘍和壓瘡的情況，它們會造成相當大的疼痛和非常嚴重的醫療并發癥。
因此，要解決的問題基本上是保護慢性傷口上的I3DGF。已經提出各種解決方案。美國專利5，905，142描述了通過產生對蛋白水解侵襲具有更高抗性的蛋白質突變體，通過取代或通過刪除一個或多個接近潛在裂解位點的賴氨酸或精氨酸氨基酸來減輕與roGF有關的這些蛋白水解問題。制造更耐受蛋白酶的蛋白質的這種策略并不令人滿意。PDGF的這種基因改性會導致生物活性的改變，產生不同的與其各種受體的親合力，這也可能引發毒理學問題。此外，PDGF的這種改性要求新的藥物開發，這是極其昂貴和冒險的。在1970年代，大量研究了這種蛋白質，據發現，提純極其棘手，因為TOGF由于其陽離子和疏水性質而是“非常粘的蛋白質”(Heldin，C.H.EMBO J.11:4251-4259, 1992 ；Raines和 Ross, J.Biol.Chem.257(9):5154-5160，1982 ；Antoniades, PNAS78:7314，1981 ；Deuel 等人，J.Biol.Chem.256:8896, 1981)。PDGF實際上是高度陽離子性的蛋白質，其等電點為9.8至10.5。其它作者證實了這一性狀，例如Wei等人(Journal of controlled release (受控釋放雜志)112:103-110, 2006)，其解釋了 I3DGF容易吸附到容器表面上，其在該容器中處于溶解狀態。該作者通過在該混合物中加入0.1%BSA或0.1%BSA/Tween20混合物來解決該問題。這些解決方案在很大程度上解決了該問題，因為多達95%的蛋白質被發現處于溶解狀態。但是，考慮到BSA的動物來源和與牛綿狀腦病相關的風險，從制藥角度看，這些解決方案并不令人滿意。相同的作者提出的另一解決方案在于加入更有力的陰離子表面活性劑(SDS)，其能夠使roGF保持溶解。遺憾地，SDS也引發蛋白質的部分變性，造成生物活性的損失。這種解決方案因此對于蛋白質的穩定化并不令人滿意。在專利W093/08825中，發明人已經證實，純化的TOGF在以局部施用的凝膠形式配制時具有極大的不穩定性。作為例子，他們舉出roGF與某些傳統用于配制藥品的產品如甲基纖維素或羥丙基纖維素以及某些傳統防腐劑如芐基醇的不相容性。作者通過解釋需要在具有良好長期穩定性的同時配制局部施用的凝膠形式`roGF來提出此問題。相同的作者表示，溶解的roGF由于在中性pH值下的脫酰胺作用而降解且蛋白質在微酸性pH值下更穩定。該作者表示，通過結合幾種參數-沒有與蛋白質表現出任何相互作用的聚合物、能夠限制脫酰胺反應的在微酸性PH值下的緩沖劑和對于蛋白質為中性的防腐劑，從而可以配制PDGF以獲得從制藥角度來看穩定的制劑。該作者表示，通過加入沒有與蛋白質表現出任何相互作用的聚合物可以獲得儲存穩定的制劑，只要該制劑保持在微酸性PH值下以避免通過脫酰胺作用使蛋白質降解的反應。但是，這一解決方案并不令人滿意，因為其不能保護生長因子避免在生理pH值下的體內蛋白水解降解。在專利W097/12601中描述了凝膠形式的I3DGF制劑，作者解釋到，他們使用的纖維素衍生物能夠使生長因子穩定化以避免儲存過程中可能的活性損失。為此，他們使用之前在美國專利4，717, 717中對EGF獲得的結果作為基礎。但是，他們還解釋到，通過在制劑中加入帶電化學物質如帶電氨基酸或金屬離子，可以極大改進含有TOGF的纖維素凝膠的穩定性。在此，該解決方案能夠使制劑中的生長因子在產品儲存過程中穩定化，但不能使這些生長因子在生理PH值下對慢性傷口中存在的蛋白酶穩定化。因此在穩定化和保護生長因子(特別是TOGF)方面存在治療優點，從而提高其在慢性傷口治療，更特別是糖尿病足部潰瘍傷口治療中的效力。本發明因此涉及通過開發出兩親聚合物與I3DGF之間的復合物，從而在體外和體內在生理pH值下可能發生的化學或物理降解方面使I3DGF穩定化。

發明內容
本發明因此涉及兩親聚合物與I3DGF之間的復合物(兩親聚合物-PDGF)的形成，這種復合物為蛋白質提供了對于在體外和體內在生理PH值下在降解方面的化學和物理穩定性。本發明因此涉及水溶性的物理和化學穩定的兩親聚合物-PDGF復合物，其特征在于:-該兩親聚合物根據下列通式由用疏水取代基和親水基團官能化的親水聚合物骨架構成:
權利要求
1.水溶性的物理和化學穩定的兩親聚合物-PDGF復合物，其特征在于: -該兩親聚合物根據下列通式由用疏水取代基和親水基團官能化的親水聚合物骨架構成:
2.根據權利要求1的復合物，其特征在于I3DGF從由含有兩個B鏈的人重組TOGF類(rhPDGF-BB)構成的組中選擇。
3.根據前述權利要求任一項的復合物，其特征在于聚合物選自取代基無規分布的聚合物。
4.根據前述權利要求任一項的復合物，其特征在于兩親聚合物選自聚氨基酸。
5.根據權利要求4的復合物，其特征在于聚氨基酸選自聚谷氨酸或聚天冬氨酸。
6.根據權利要求5的復合物，其特征在于聚氨基酸是均聚谷氨酸。
7.根據權利要求6的復合物，其特征在于聚氨基酸是均聚天冬氨酸。
8.根據權利要求7的復合物，其特征在于聚氨基酸是天冬氨酸和谷氨酸的共聚物。
9.根據權利要求1至5之一的復合物，其特征在于該聚合物選自多糖。
10.根據權利要求9的復合物，其特征在于多糖從由乙酰透明質酸、藻酸鹽、脫乙酰殼多糖、聚半乳糖醛酸 、硫酸軟骨素、葡聚糖、纖維素構成的組中選擇。
11.根據權利要求10的復合物，其特征在于纖維素的組由用酸官能化的纖維素如羧甲基纖維素構成。
12.根據權利要求10的復合物，其特征在于葡聚糖的組由用酸官能化的葡聚糖如羧甲基葡聚糖構成。
13.根據權利要求9的復合物，其特征在于多糖從由乙酰透明質酸、藻酸鹽、脫乙酰殼多糖構成的組中選擇。
14.根據權利要求9的復合物，其特征在于多糖從由與下式(I)對應的可溶性葡聚糖的衍生物所構成的組中選擇: DMCaBbSuc (I) 其中: -D代表多糖鏈，優選由糖苷單元的鏈狀連接構成， -MC代表甲基羧基基團， -B代表N-芐基亞甲基甲酰胺基團， -Su代表硫酸根基團(糖苷單元所帶的游離羥基官能團的硫酸化)， -a、b和c分別代表基團MC、B和Su的取代程度(ds)，其中 i)a嚴格大于O ; ii)b為: 要么b大于或等于0.3且c為0.1至0.5 ; 要么b嚴格小于0.3且c符合下式(I): c ^ 8.5b2-5.41b + 0.86 (I)。
15.根據前述權利要求任一項的復合物，其特征在于疏水基團Hy從由脂肪酸、脂肪醇、脂肪胺、芐胺、膽固醇衍生物和酚構成的組中選擇。
16.根據前述權利要求任一項的復合物，其特征在于兩親聚合物-PDGF復合物的形成是可逆的。
17.根據前述權利要求任一項的復合物，其特征在于其滿足驗證化學和物理穩定性的試驗。
18.根據權利要求17的復合物，其特征在于驗證化學和物理穩定性的試驗選自:復合物的驗證試驗(凝膠遷移率變動分析)、通過與蛋白酶接觸進行的酶促降解減緩的試驗以及通過SDS-Page進行的在生理pH值下的物理穩定性的試驗。
19.根據前述權利要求任一項的復合物，其特征在于TOGF/兩親聚合物比率為1/5至1/5000。
20.根據前述權利要求任一項的復合物，其特征在于roGF/兩親聚合物比率為1/100至1/5000。
21.根據前述權利要求任一項的復合物，其特征在于TOGF/兩親聚合物比率為1/300至1/700。
22.制備根據前述權利要求任一項的兩親聚合物-PDGF復合物的方法，其特征在于在含水介質中在不存在可使蛋白質變性的有機溶劑的情況下制備這種聚合物/PDGF-BB復合物。
23.治療用組合物，其特征在于其包含根據權利要求1至22任一項的兩親聚合物-PDGF復合物。
24.根據權利要求20的治療用組合物，其特征在于其能夠以100微克/毫升的TOGF施用。
25.根據權利要求1至22任一項的兩親聚合物-PDGF復合物用于制備通過局部途徑治療潰瘍用的具有愈合作用的治療性組合物的用途。
26.人用或獸用治療方法，其特征在于其包括在治療位置施用包含根據權利要求1至22任一項的兩親聚合物-PDGF復合物的治療性組合物。
全文摘要
本發明涉及與兩親聚合物結合的血小板源生長因子(PDGF)的新型復合物，其可以改善用于藥物應用的治療性蛋白質的體外和體內物理和化學穩定性。本發明還涉及制備PDGF-兩親聚合物復合物的方法，其特征在于在含水介質中和在不存在可能導致蛋白質變性的有機溶劑的情況下制備這種聚合物/PDGF-BB復合物并涉及所述兩親聚合物-PDGF復合物用于制備通過局部途徑治療潰瘍用的具有愈合作用的治療性組合物的用途。
文檔編號A61K47/34GK103203023SQ20131012029
公開日2013年7月17日 申請日期2006年9月26日 優先權日2005年9月26日
發明者G·迪布勒克, L·達里-科雷亞, J·科雷亞, D·迪拉謝爾, R·蘇拉, O·蘇拉, G·蘇拉 申請人:阿道恰公司