專利名稱：谷氨酰胺酰基環化酶效應物和谷氨酸環化酶效應物的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及谷氨酰胺酰基環化酶(glutaminyl cyclase) (QC，EC2. 3. 2. 5)，其催化 N-末端谷氨酰胺殘基轉化為焦谷氨酸(5-氧代-脯氨酸，pGlu*)同時釋放氨的分子內環化反應和N-末端谷氨酸殘基轉化為焦谷氨酸同時釋放水分子的分子內環化反應。本發明確認了哺乳動物的QC為金屬酶，提供了新型的哺乳動物QC的生理底物、新型的QC效應物、以及QC效應物和包含QC效應物的藥物組合物用于治療可通過調節QC活性而治療的疾病中的用途。此外，已發現金屬相互作用(metal interaction)是開發QC抑制劑的一種有效途徑。在一個優選的具體實施方案中，本發明提供將QC活性的效應物與DP IV或DP IV 樣酶(DP IV-Iike enzyme)的抑制劑相聯合用于治療或減輕可通過調節QC活性和/或DP IV活性而治療的疾病中的用途。本發明還提供一種鑒定和選擇QC活性的效應物的篩選方法。
背景技術：
谷氨酰胺酰基環化酶(QC，EC 2. 3. 2. 5)催化N-末端谷氨酰胺殘基轉化為焦谷氨酸(pGlu*)同時釋放氨的分子內環化反應。1963年，Messer首次由熱帶植物番木瓜 (Carica papaya)膠乳中分離得到 QC(Messer，M. 1963 Nature 4874,1299)。24 年后，在動物垂體中發現了一種相應的酶活性(Busby，W. H. J.等，1987 J Biol Chem 262,8532-8536 ； Fischer ；W. H.和 Spiess，J. 1987 Proc Natl Acad Sci U S A 84,3628-3632)。對于哺乳動物的QC，通過QC的Gln至pGlu的轉化可見于TRH和GnRH前體(Busby，W. H. J.等，1987 J Biol Chem 262,8532-8536 ；Fischer,W.H.和 Spiess，J. 1987 Proc Natl Acad Sci U S A 84,3628-3632)。此外，最初的QC定位試驗顯示其與催化作用的推定的(putative)產物共存于牛垂體中，進一步提高所提出的于肽類激素合成中的功能(Bockers，Τ. Μ.等，1995 J Neuroendocrinol 7,445-453) 0相反，植物QC的生理功能較不明顯。就來自番木瓜的酶而言，據認為其在植物防御病原微生物中具有一定作用(EI Moussaoui, Α.等，2001 Cell Mol Life Sci 58,556-570)。最近通過序列對比確定了來自其它植物的推定的QC(Dahl， S. W.等，2000Protein Expr Purif 20,27-36) 然而，這些酶的生理功能仍然不明確。來自植物和動物的已知QC在底物的N-末端部位對L-谷氨酰胺有嚴格的特異性， 并且發現它們的動力學行為符合Michaelis-Menten方程(Pohl，T.等，1991 Proc Natl Acad Sci U S A 88,10059-10063 ；Consalvo, A. P.等，1988 Anal Biochem 175,131-138 ； Gololobov, M. Y.等，1996 BiolChem Hoppe Seyler 377,395-398)。然而，對比來自番木瓜的QC和來自哺乳動物的高度保守的QC的一級結構卻并未發現任何序列同源性(Dahl， S. W.等，2000 Protein Expr Purif20，27-36)。盡管植物的QC似乎屬于一類新的酶家族(Dahl，S.W.等，2000 Protein Expr Purif20，27-36)，但發現哺乳動物的QC與細菌氨肽酶具有顯著的序列同源性(Bateman, R. C.等，2001 Biochemistry 40，11246-11250)，從而得出植物和動物的QC具有不同的進化起源的結論。EP 020 11349. 4公開了編碼昆蟲谷氨酰胺酰基環化酶的多核苷酸，及其所編碼的多肽。該申請進一步提供包含表達載體的宿主細胞，該表達載體包含本發明的多核苷酸。所分離的多肽和包含昆蟲QC的宿主細胞可用于篩選降低谷氨酰胺酰基環化酶活性的藥物的方法中。據記載，這種藥物可用作殺蟲劑。阿爾茨海默癥(AD)是以與營養不良的(dystrophic)神經元、反應性星形膠質細胞以及小膠質細胞緊密相關的細胞外淀粉樣斑塊(amyloidotic plaque)的異常堆積為特征(Terry，R. D.和 Katzman，R. 1983Ann Neurol 14，497-506 ；Glenner, G. G.禾口 Wong, C. W. 1984 Biochem Biophys Res Comm 120,885-890 ；Intagaki, S. φ,1989 J Neuroimmunol 24,173-182 ；Funato, H.等，1998 Am J Pathol 152，983-992 ;Selkoe， D. J. 2001Physiol Rev 81,741-766)。β 淀粉樣(Amyloid-β，A β )肽是老年斑的主要成分，并且被認為與AD發病機理及進展直接相關，該假設得到遺傳學研究的支持(Glermer， G.G.和 Wong，C. W. 1984 Biochem Biophys Res Comm 120,885-890 ；Borchelt, D. R.等， 1996 Neuron 17,1005-1013 ；Lemere, C. A.等，1996 Nat Med 2,1146-1150 ；Mann, D. Μ.禾口 Iwatsubo,T. 1996 Neurodegeneration 5,115-120 ；Citron,Μ. φ,1997 Nat Med 3,67-72 ； Selkoe，D. J. 2001 physiol Rev 81，741-766)。A β 是由 β-淀粉樣前體蛋白(APP)的蛋白水解生成(Kang, J.等，1987 Nature 325，733-736 ;Selkoe，D. J. 1998 Trends Cell Biol 8，447-453)，即APP通過β-分泌酶在A β的N-末端和γ-分泌酶在A β的C-末端的順序切割(Haass, C.和 Selkoe，D. J. 1993 Cell 75，1039-1042 ；Simons,Μ.等，1996 J Neurosci 16899-908)。除了在N-末端始于L-Asp的優勢A β肽(Α β-1-42/40)之外，老年斑中存在很多異質性N-末端截短的形式。據報道這種被截短的肽在體外具有更強的神經毒性并且比全長的同工型更迅速聚集(Pike，C. J.等，1995 J Biol Chem 27023895-23898)。 已知N端截短的肽是在早期發作的家族性AD(FAD)患者中過度產生(Saido，Τ. C.等， 1995 Neuron 14，457-466 ;Russo，C.等，2000 Nature 405，531-532)，并已知在唐氏綜合征(DS)患者的腦中于早期出現并且隨年齡增長而增加(Russo，C.等，1997 FEBS Lett 409,411-416，Russo，C.等，2001 Neurobiol Dis 8,173-180 ；Tekirian, T. L.等，1998 J Neuropathol Exp Neurol 57，76_94)。最后，其量反映了疾病進行性的嚴重程度(Russo， C.等，1997 FEBS Lett 409，411-416)。額外的翻譯后過程可能通過1位與7位天冬氨酸的異構化或外消旋化以及殘基3位和11位的谷氨酸的環化進一步修飾N-末端。3位含焦谷氨酰胺的同工型[pGlu3]Ai3 (3-40/42)代表老年斑中N-端截短的物質的顯著形
式-大約占 Αβ 總量的 50% (Mori,H.等，1992 J Biol Chem 267，17082-17086，Saido，
Τ. C.等，1995 Neuron 14,457-466 ；Russo, C.等，1997 FEBS Lett 409,411-416 ；Tekirian, T.L.等，1998 J Neuropathol Exp Neurol 57,76-94 ；Geddes, J. W.等，1999 Neurobiol Aging 20,75-79 ；Harigaya, Y.等，2000 Biochem Biophys Res Commun 276,422-427), 并且它們同樣存在于前淀粉樣病變(pre-amyloid lesion)中(Lalowski, Μ.等，1996 J Biol Chem 271,33623-33631)。[pGlu3]Aβ (3-40/42)肽的堆積很可能是由于增強聚集和賦予對大多數氨肽酶的抵抗性的結構修飾所致(Saido，T. C.等，1995 Neuron 14，457-466;Tekirian, Τ. L.等，1999 J Neurochem 73,1584-1589)。該證據為 AD 發病機理中[pGlu3] Αβ (3-40/42)肽的關鍵作用提供了線索。然而，關于其神經毒性和聚集性方面卻了解得很少(He, W.和 Barrow，C. J. 1999 Biochemistry 38，10871-10877 ；Tekirian, Τ. L.等，1999 J Neurochem 73，1584-1589)。此外，這些同工型對神經膠質細胞的作用及神經膠質對這些肽的反應是完全未知的，不過活性神經膠質確實與老年斑有關并且可能對淀粉樣沉積 (amyloid deposit)具有積極作用。在最近的研究中，在神經元和神經膠質細胞培養物中研究了 Αβ (1-42), Aβ (1-40)、[pGlu3]Ai3 (3-42)和[pGlu3]A^ (3-40)肽的毒性、聚集性以及分解代謝，表明焦谷氨酸的修飾加劇了 Αβ -肽的毒性，同時還抑制其被經培養的星形膠質細胞降解。Shirotani等人在體外研究了感染新培斯病毒(Sindbis Virus)的原代皮質神經元(primary cortical neuron)中[pGlu3]A^肽的生成。它們構建了淀粉樣前體蛋白互補DNA，所述DNA編碼具有氨基酸取代和缺失的[pGlu3]Ai3的潛在前體。對于始于 N-末端谷氨酰胺殘基而不是天然前體中的谷氨酸的人工前體而言，提示存在自發地轉化或通過谷氨酰胺酰基環化酶酶促地轉化為焦谷氨酸。尚未在體內確定[pGlu3]Ai3天然前體的 3 位 N-末端谷氨酸的環化機制(Shirotani，K.，Tsubuki，S.，Lee, H. J.，Maruyama, K.， 和 Saido，T.C. (2002) Neurosci Lett 327，25-28)。
家族性英國型癡呆(FBD)和家族性丹麥型癡呆(FDD)是早期起病的常染色體顯性疾病，其特征在于進行性認知障礙、強直和小腦共濟失調(Ghiso，J. et al. 2000, Ann N Y Acad Sci 903,129-137 ；Vidal, R. et al. 1999, Nature 399,776-781 ；Vidal, R. et al. 2004, J Neuropathol ExpNeurol 63，787-800)。與阿爾茨海默癥相似，患者體內有廣泛性的實質和血管淀粉樣沉積形成，伴有海馬神經變性、補體和神經膠質活化(Rostagno， A. et al. 2002, J Biol Chem 277，49782-49790)。這些疾病由 BRI 基因(SwissProt Q9Y287) 的不同突變引起，這些突變產生的開放讀框較野生型BRI長11個氨基酸。對于FBD，ORF 的改變由BRI (BRI-L)的終止密碼子突變引起，而在FDD，一個10個核苷酸的復制插入產生了更大的 BRI (BRI-D) (Ghiso J. et al. 2001 Amyloid 8，277-284 ；Rostagno, A. etal. 2002 J Biol Chem 277，49782-49790)。BRI是2型跨膜蛋白，由13號染色體編碼，已經發現其通過弗林蛋白酶(furin)和其他激素原轉換酶在C端區域進行處理，釋放一種長度為23 個氨基酸的肽(Kim, S. H. et al. 2000 Ann N Y Acad Sci920，93-99 ；Kim, S. H. et al. 2002 J Biol Chem 277，1872-1877)。突變的BRI蛋白BRI-D和BRI-L的裂解導致產生一些肽 (ABri和ADanJ^* 34個氨基酸)，所述的肽易于聚集，引起非纖維性沉積以及淀粉樣原纖維(amyloid fibrils)(El Agnaf, 0. Μ. et al. 2004 Protein Pept Lett 11，207-212 ;E1 Agnaf, 0. Μ. et al. 2001 Biochemistry 40,3449-3457 ；El Agnaf, 0.Μ. et al. 2001 J Mol Biol 310,157-168 ；Srinivasan et al. 2003 J Mol Biol 333，1003-1023)。ADan 禾口 ABri 肽在其N端22個氨基酸是相同的，但含有不同的C端區域。C端部分被發現對于原纖維形成和神經毒性是必需的(ElAgnaf, 0. M. et al. 2004 Protein Pept Lett 11,207-212) 已經發現，ABri和ADan肽的N端通過焦谷氨酰形成(pyroglutamyl formation) 而被封閉。根據阿爾茨海默癥中Αβ的N端的焦谷氨酰形成，pGlu形成于谷氨酸(Ghiso J.et al. 2001 Amyloid 8 ；Saido et al. 1995 Neuron 14，457-466)。反過來，焦谷氨酰的形成使得肽對于大多數氨肽酶的降解作用變得穩定，由此刺激了疾病的進展。已經發現，聚集物的形成在細胞外進行，但也見于細胞的分泌途徑(Kim et al. 2002 J Biol Chem 277，1872-1877)。因 此，通過抑制谷氨酰胺酰基和谷氨酸環化酶而抑制在具有神經毒性的ABri 和ADan肽的N端形成pGlu，代表了一種治療FBD和FDD的新方法。二肽基肽酶IV(DP IV)是在機體的多種組織包括腎臟、肝臟和腸中發現的在脯氨酸后(在較小程度上為丙氨酸后、絲氨酸后或甘氨酸后)進行切割的絲氨酸蛋白酶，并且可將N-末端的二肽從肽鏈上切割下來。最近已發現DP IV在神經肽的新陳代謝、T細胞活化、 癌細胞對內皮的附著以及HIV進入淋巴樣細胞方面起著重要的作用。參見WO 02/34242、 W002/34243.W0 03/002595 以及 WO 03/002596。WO 99/61431公開的DP IV抑制劑包含一氨基酸殘基和一噻唑烷或吡咯烷基團及其鹽，尤其是L-蘇-異亮氨酰噻唑烷、L-別-異亮氨酰噻唑烷、L-蘇-異亮氨酰吡咯烷、 L-別-異亮氨酰噻唑烷、L-別-異亮氨酰吡咯烷。低分子量的二肽基肽酶IV抑制劑的進一步實例為以下物質，如四氫異喹啉-3-甲酰胺衍生物、N-取代的2-氰基吡咯和2-氰基吡咯烷、N-(N'-取代的甘氨酰基)-2-氰基吡咯烷、N-(取代的甘氨酰基)-噻唑烷、N-(取代的甘氨酰基)-4-氰基噻唑烷、氨基_酰基_ 二羥硼基_脯氨酰_抑制劑、環丙基稠合的吡咯烷和雜環化合物。二肽基肽酶IV抑制劑記載于 US 6，380，398、US 6，011，155、US 6，107，317、US 6，110，949、US 6，124，305、 US 6，172，081、WO 95/15309、WO 99/61431、WO 99/67278、WO 99/67279、DE 19834591、 WO 97/40832、DE 19616486C 2、WO 98/19998、WO 00/07617, W099/3850U WO 99/46272、 WO 99/38501、WO 01/68603、WO 01/40180、WO 01/81337、WO 01/81304、WO 01/55105、WO 02/02560 以及 W002/14271、WO 02/04610、WO 02/051836、WO 02/068420、WO 02/076450、 WO 02/083128、WO 02/38541、WO 03/000180、WO 03/000181、W003/000250、WO 03/002530、 WO 03/002531、WO 03/002553、WO 03/002593、WO 03/004496、WO 03/024942 以及 WO 03/024965，其教導，尤其是涉及這些抑制劑、其定義、應用及其制備的教導全文并入此處作為參考。

發明內容
本發明提供了哺乳動物QC的新的生理底物，其選自GlU1-ABri、Glu1-ADan, Gln3-Aii (3-40/42)、和Gln1-胃泌素(17和34)，并提供了 QC效應物及包含QC效應物的藥物組合物用于治療可通過調節QC活性而治療的疾病的應用，所述疾病優選地選自伴隨或不伴隨幽門螺桿菌的十二指腸癌、結直腸癌和Zolliger-Ellison綜合征、家族性英國型癡呆和家族性丹麥型癡呆。通過抑制試驗發現，人QC是金屬依賴性轉移酶。QC脫輔基酶(apoenzyme)通過鋅離子可最有效地被再活化，并且鋅依賴性氨肽酶的金屬結合基序同樣存在于人QC中。與活性位點結合金屬相互作用的化合物為有效的抑制劑。出乎意料的是，研究表明重組人QC和源自腦提取物的QC活性催化N-末端谷氨酰胺酰基的環化作用以及谷氨酸的環化作用。更驚人的發現是，環化酶催化的Glu1轉化在pH 6. 0左右有利，而Gln1至pGlu-衍生物的轉化的最適pH在8. 0左右。由于pGlu-Αβ相關肽的形成可通過抑制重組人QC及源自豬垂體提取物的QC活性而得以抑制，因此酶QC為研發阿爾茨海默癥治療藥物的靶向之一。本發明提供了用于胃腸外、腸道或口服施用的藥物組合物，其包含至少一種QC效應物，所述效應物任選地與常規的載體和/或賦形劑相組合；或者其包含至少一種QC效應物，所述效應物與至少一種DP IV抑制劑相組合，且任選地與常規的載體和/或賦形劑相組合。本發明提供了可由通式1概括表示的QC抑制劑或其藥用可接受的鹽，包括所有的立體異構體
噻吩-2-基)丙-1-酮
8.權利要求1-5中任一項的用途，其中所述QC抑制劑與至少一種常規載體和/或賦形劑相組合使用。
9.權利要求1-5中任一項的用途，其中所述QC抑制劑與DPIV抑制劑相組合使用。
10.權利要求1-5中任一項的用途，其中所述DPIV抑制劑選自以下一組L-蘇-異亮氨酰噻唑烷、L-別-異亮氨酰噻唑烷、L-蘇-異亮氨酰吡咯烷、L-別-異亮氨酰吡咯烷、 NVP-DPP728A (1- [ [ [2- [ {5-氰基吡啶_2_基}氨基]乙基]氨基]乙酰基]_2_氰基-(S)-吡咯烷)、LAF-237(l-[(3-羥基-金剛烷-1-基氨基)-乙酰基]-吡咯烷_2 (S)-腈)、 TSL-225(色氨酰基-1，2，3，4-四氫異喹啉_3_羧酸)、FE-999011、N-纈氨酰-脯氨酰、 0-苯甲酰羥胺、丙氨酰吡咯烷、H-Asn-吡咯烷、H-Asn-噻唑烷、H-Asp-吡咯烷、H-Asp-噻唑烷、H-Asp (NHOH)-吡咯烷、H-Asp (NHOH)-噻唑烷、H-Glu-吡咯烷、H-Glu-噻唑烷、 H-Glu(NHOH)-吡咯烷、H-Glu(NHOH)-噻唑烷、H-His-吡咯烷、H-His-噻唑烷、H-Pro-吡咯烷、H-Pro-噻唑烷、H-Ile-吡咯烷、H-L-別-Ile-噻唑烷、H-Val-吡咯烷和H-Val-噻唑烷、2-氨基辛酸-Pro-lie、Abu-Pro-IIe> Aib_Pro_Ile、Aze_Pro_Ile、Cha_Pro_Ile、 IIe-Hyp-IIe> lie-Pro-另lj -lie、lie-Pro-叔丁 基-Gly、Ile-Pro-VaU Nle-Pro-Ile、 Nva-Pro-IIe>Orn-Pro-IIe>Phe-Pro-IIe>Phg-Pro-IIe>Pip-Pro-IIe> Ser (Bzl)-Pro-IIe> Ser (P)-Pro-lie, Ser-Pro-Ile、叔丁 基-Gly-Pro-D-Val、叔丁 基-Gly-Pro-Gly、叔丁 基-Gly-Pro-Ile,叔丁 基-Gly-Pro-Ile-酰胺、叔丁 基-Gly-Pro-叔丁 基-Gly, 叔丁基-Gly-Pro-Val、Thr-Pro-Ile、Tic-Pro-Ile、Trp-Pro-Ile、Tyr (P)-Pro-lie、 Tyr-Pro-別-lie、Val-Pro-別-lie、Val-Pro-叔丁基-Gly、Val-Pro-Val、或它們的藥物學可接受的鹽。
11.權利要求1-5中任一項的用途，其中所述DPIV抑制劑選自以下一組2_甲基羰基-I-N- [ (L)-丙氨酰-(L)-纈氨酰]-(2S)-吡咯烷氫溴酸鹽，2-甲基羰基-I-N- [ (L)-纈氨酰-(L)-丙氨酰-(L)-纈氨酰]_(2S)_吡咯烷氫溴酸鹽，2-[(乙酰基-氧-甲基)羰基]-I-N- [ (L)-丙氨酰-(L)-纈氨酰]-(2S)-吡咯烷氫溴酸鹽，2-[(苯甲酰-氧-甲基) 羰基]-I-N-[ {(L)-丙氨酰}-(L)-纈氨酰]-(2S)-吡咯烷氫溴酸鹽，2-{[ (2，6- 二氯芐基) 硫甲基]羰基}-l-N-[{(L)_丙氨酰}-(L)_纈氨酰]_(2S)_吡咯燒，2-[(苯甲酰-氧-甲基)羰基]-I-N-[甘氨酰-(L)-纈氨酰]_(2S)_吡咯烷氫溴酸鹽，2-[([1，3]_噻唑噻唑-2-基)羰基]-I-N- [ {(L)-丙氨酰}-(L)-纈氨酰]-(2S)-吡咯烷三氟乙酸鹽，2_ [(苯并噻唑噻唑-2-基)羰基]-I-N- [N- {(L)-丙氨酰} - (L)-纈氨酰]-(2S)-吡咯烷三氟乙酸鹽，2-[(苯并噻唑噻唑-2-基)羰基]-I-N- [ {(L)-丙氨酰}-甘氨酰]-(2S)-吡咯烷三氟乙酸鹽，2-[(吡啶-2-基)羰基]-I-N-[N-{(L)-丙氨酰}-(L)-纈氨酰]-(2S)-吡咯烷三氟乙酸鹽、1-環戊基-3-甲基-1-氧代-2-戊烷氯化銨，1-環戊基-3-甲基-1-氧代-2- 丁烷氯化銨，1-環戊基-3，3-二甲基-1-氧代-2-丁烷氯化銨，1-環己基-3，3-二甲基-1-氧代-2- 丁烷氯化銨，3-(環戊基羰基)-1，2，3，4-四氫異喹啉氯化物，和N- (2-環戊基-2-氧乙基)環己烷氯化銨，或它們的其它藥物學可接受的鹽。
12.權利要求1至5中任一項的用途，其特征在于所述QC抑制劑與DPIV樣酶抑制劑相組合使用，其中所述DP IV樣酶選自成纖維細胞激活蛋白α、二肽基肽酶IV β、二肽基氨肽酶樣蛋白、N-乙酰化的α-連接的酸性二肽酶、休眠細胞脯氨酸二肽酶、二肽基肽酶 II、吸誘素和二肽基肽酶IV相關蛋白(DPP 8)、DPL1(DPX，DP6)、DPL2、DPP 9和二肽基肽酶 10。
13.權利要求1-5中任一項的用途，其中所述QC抑制劑是競爭性抑制劑。
14.權利要求1-5中任一項的用途，其中所述谷氨酰胺酰基環化酶抑制劑與谷氨酰胺酰基環化酶的活性位點結合金屬離子相互作用。
15.權利要求1-5中任一項的用途，用于胃腸夕卜、腸道或口服施用。
16.權利要求1-5中任一項的用途，用于口服施用。
全文摘要
本發明提供了哺乳動物谷氨酰胺酰基環化酶(QC，EC 2.3.2.5)的新生理底物、QC的新效應物、篩選該效應物的方法、該效應物以及包含該效應物的藥物組合物在治療可通過調節QC活性治療的疾病中的應用。優選的組合物還包括DP IV或DP IV樣酶抑制劑以治療或減輕可通過調節QC和DP IV活性治療的疾病。
文檔編號A61K31/00GK102302781SQ201110259708
公開日2012年1月4日 申請日期2004年10月15日 優先權日2003年10月15日
發明者烏爾里希·海澤, 安德烈·約翰內斯·尼斯特羅杰, 托爾斯滕·霍夫曼, 斯特凡·席林, 漢斯-烏爾里希·德穆特 申請人:前體生物藥物股份公司