專(zhuān)利名稱(chēng)：牛蒡苷及苷元在抗帕金森病中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及兩種中藥單體成分的藥理作用及其應(yīng)用，具體是以牛蒡苷和苷元為活性成分的單體藥物及其在抗帕金森藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
牛蒡子為菊科(Compositae)牛蒡?qū)?Arctium)植物牛蒡(Arctium lappa)的干燥成熟果實(shí)。牛蒡子的主要藥效成分為牛蒡苷，我們的研究結(jié)果(He Fan，Dou De-Qiang, SunYu, Zhu Lin, Xiao Hong-Bin, Kang Ting-Guo. Plasma pharmacokinetics and tissuedistribution of arctiin and its main metabolite in rats by HPLC-UV and LC-MS.Planta Medica 2012, 78:800-806.)和國(guó)外報(bào)道均表明牛蒡苷是通過(guò)在胃腸道中代謝成牛蒡苷元而發(fā)揮其藥效的。帕金森病(Parkinson’ s disease, PD)是以中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元漸進(jìn)性死亡為病理特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。目前治療手段主要以西藥為 主，但只能改善癥狀，不能控制其進(jìn)程，長(zhǎng)期應(yīng)用療效減弱且毒性增大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于公開(kāi)一種牛蒡苷及苷元的新用途，即能有效防治帕金森病。我們的研究結(jié)果表明牛蒡苷元為牛蒡苷的代謝產(chǎn)物和吸收入血的活性成分，而且直接服用牛蒡苷元的生物利用度較低。因此牛蒡苷為牛蒡苷元的前體藥物。我們首先通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)牛蒡苷元具有較好的抗帕金森作用，然后通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)口服牛蒡苷而顯示其具有較強(qiáng)的抗帕金森病的作用。研究結(jié)果證明牛蒡苷和苷元均可應(yīng)用于帕金森病的治療。為證實(shí)牛蒡苷及苷元具有抗帕金森病采用的技術(shù)方案是
一、牛蒡苷和苷元的制備
I、牛蒡苷的制備方法，是取牛蒡子粗粉I. Okg (牛蒡苷含量5. 2%)，用水煎煮提取三次，每次加15倍量水，I小時(shí)。合并提取液，減壓濃縮至藥材的2倍量，加95%乙醇至乙醇濃度達(dá)到80%，4°C醇沉12小時(shí)，過(guò)濾，取上清液，減壓濃縮至近干，得浸膏。浸膏用甲醇溶解，用浸膏I等重量的100-120目硅膠拌樣，用浸膏I等重量的200-300目硅膠分離，用氯仿-甲醇洗脫，得到含有牛蒡苷的餾分，合并含有牛蒡苷的餾分，濃縮后加95%乙醇結(jié)晶，得牛蒡苷30g (牛蒡苷含量大于95%)。2、牛蒡苷元的制備方法，是取牛蒡子粗粉I. OKg (牛蒡苷含量5. 2%)，加3倍量水，40°C溫孵4個(gè)小時(shí)，加95%乙醇和水調(diào)節(jié)成10倍量60%乙醇提取液，加熱回流煎煮I小時(shí)。繼續(xù)用60%乙醇提取兩次，每次I小時(shí)。合并提取液，濃縮近干。經(jīng)硅膠柱分離，用100目硅膠按樣品量I: I拌樣，200-300目硅膠I: I進(jìn)行柱層析，氯仿-甲醇洗脫，合并含有牛蒡苷元的流分，用乙醇重結(jié)晶，得牛蒡苷元25g (牛蒡苷元含量大于95%)。二、細(xì)胞的培養(yǎng)及ro細(xì)胞模型的建立
I.I實(shí)驗(yàn)材料多巴胺能人神經(jīng)母瘤細(xì)胞株(SH-SY5Y細(xì)胞，購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù))，所用牛蒡苷和苷元取自本實(shí)驗(yàn)室。
I. 2細(xì)胞培養(yǎng)含10%滅活小牛血清(購(gòu)自GIBCO公司，批號(hào)8166872)、青霉素100U .mL'鏈霉素 ΙΟΟμ g .mr1 (購(gòu)自 HyClone 公司，批號(hào):J120721)的 DMEM F-12 1:1 培養(yǎng)液(購(gòu)自HyClone公司，批號(hào)NXA0559)培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞，置于37°C、5% C02的培養(yǎng)箱中。隔天更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)至單層細(xì)胞約80%匯合時(shí)，傳代培養(yǎng)，用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。I. 3造模及給藥方法調(diào)節(jié)SH-SY5Y細(xì)胞密度約5X 104/mL，100 μ L/孔接種于96孔板，16h后分別加入不同濃度(I μ Μ、5 μ M和10 μ Μ)的牛蒡苷和牛蒡苷元,每一濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)等量的對(duì)照組(不含處理試劑)和模型組(只加ΜΡΡ+，購(gòu)于Sigma公司，批號(hào)100M4713V)，24h后，對(duì)照組加入完全培養(yǎng)基，模型組和空白組每孔加入用培養(yǎng)液稀釋的ImM的MPP+ (I —甲基一4 —苯基吡啶離子)。I. 4四甲基偶氮唑鹽(MTT+)法檢測(cè)細(xì)胞存活率48h后，不同組細(xì)胞每孔均加入5mg/mL MTT+ 10 μ L，培養(yǎng)4h，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加DMSO 100 μ L，待結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm處各孔的吸收值(0D值)(參考波長(zhǎng)620nm)，計(jì)算細(xì)胞存活率細(xì)胞存活率％ =(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值/對(duì)照組OD值-空白組OD值)X 100% ]01.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(I 土S)表示，用單因素方差分析(one-wayAN0VA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果見(jiàn)表I。表I不同濃度牛蒡苷和苷元對(duì)抗MPP+細(xì)胞毒性后的SH-SY5Y細(xì)胞存活率
權(quán)利要求
1.牛蒡苷及苷元在抗帕金森病中的應(yīng)用，其特征在于所述牛蒡苷及苷元純度大于90%時(shí)具有治療帕金森病作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的牛蒡苷及苷元在抗帕金森病中的應(yīng)用，其特征在于所述牛蒡苷及苷元是由牛蒡子粗粉制成，其中 牛蒡苷的制備方法如下取牛蒡子粗粉I. O kg，牛蒡苷含量5. 2%，用水煎煮提取三次，每次15倍量，I小時(shí)，合并提取液，減壓濃縮至藥材的2倍量，加95%乙醇至乙醇濃度達(dá)到80%，4°C醇沉12小時(shí)，過(guò)濾，取上清液，減壓濃縮至近干，得浸膏，浸膏用甲醇溶解，用浸膏等重量的100-120目硅膠拌樣，用浸膏等重量的200-300目硅膠分離，用氯仿-甲醇洗脫，得到含有牛蒡苷的餾分，合并含有牛蒡苷的餾分，濃縮后加95%乙醇結(jié)晶，得牛蒡苷30g，牛蒡苷含量大于90% ； 牛蒡苷元的制備方法如下取牛蒡子粗粉I. 0K，牛蒡苷含量5. 2%，加3倍量水，40°C溫孵4個(gè)小時(shí)，加95%乙醇和水調(diào)節(jié)成60%乙醇含量的10倍量提取液，加熱回流煎煮I小時(shí)，繼續(xù)用60%乙醇提取兩次，每次I小時(shí)，合并提取液，濃縮近干，經(jīng)硅膠柱分離，用100目硅膠按樣品量I: I拌樣，200-300目硅膠I: I進(jìn)行柱層析，氯仿-甲醇洗脫，合并含有牛蒡苷元的流分，用乙醇重結(jié)晶，得牛蒡苷元25g、牛蒡苷元含量大于93%。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的牛蒡苷及苷元在抗帕金森病中的應(yīng)用，其特征在于采用多巴胺能人神經(jīng)母瘤細(xì)胞株模型，證明牛蒡苷及苷元具有抗帕金森病的生物活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的牛蒡苷及苷元在抗帕金森病中的應(yīng)用，其特征在于采用MTPT所致的C57BL/6小鼠模型，證明牛蒡苷及苷元具有抗帕金森病作用。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的牛蒡苷及苷元在抗帕金森病中的應(yīng)用，其特征在于所述牛蒡子苷及苷元可單獨(dú)或與其他藥物組合治療帕金森病。
全文摘要
牛蒡苷和牛蒡苷元為中藥牛蒡子中的主要活性成分。本發(fā)明公開(kāi)了一種抗帕金森病的中藥牛蒡中活性成分牛蒡苷和苷元在抗帕金森方面的應(yīng)用。通過(guò)體內(nèi)和體外試驗(yàn)結(jié)果表明表明牛蒡苷及其苷元具有較強(qiáng)的抗帕金森病作用。本發(fā)明中的牛蒡苷和苷元在抗帕金森病方面有較強(qiáng)的活性，副作用小，價(jià)格便宜。
文檔編號(hào)A61K131/00GK102895278SQ20121040202
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月22日
發(fā)明者竇德強(qiáng), 李東薇, 康廷國(guó) 申請(qǐng)人:遼寧中醫(yī)藥大學(xué)