專利名稱：香蜂草苷在制備治療或預防出血性疾病的藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及香蜂草苷在制備治療或預防出血性疾病的藥物中的應用。
背景技術：
血具有營養和滋潤的作用。血在脈中循行，內注五臟六腑，外濡皮肉筋骨，如環無端，運行不息，以維持生理活動所需的營養。故《素問，五臟生成篇》說“肝受血而能視，足受血而能步，掌受血而能握，指受血而能攝。”此外，血又是氣的載體，又是機體精神意識思維活動的主要物質基礎，故有“血氣者，人之神”之說。出血過多可出現貧血，嚴重時并發出血性休克，危及生命。隨著生活水平的提高，開發有效安全的止血藥物成為研發熱點。斷血流是唇形科植物蔭風輪或風輪菜的干燥地上部分，在民間廣為用做止血藥物其藥理作用得到廣泛證實韓傳環，周曉琳，葉壽山.斷血流口服液的藥效學研究.中藥藥理與臨床.1998，14(3)27-28，香蜂草苷是從斷血流中提取的一個成分，化學名為5，7-二羥基-4′-甲氧基雙氫黃酮-7-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷。通過試驗，我們驚奇的發現香蜂草苷在預防或治療內出血、外出血等方面具有顯著作用。
香蜂草苷的化學結構式發明內容本發明提供了香蜂草苷在制備治療或預防出血性疾病的藥物中的應用。
本發明提供了香蜂草苷在制備治療或預防內出血的藥物中的應用。
本發明提供了香蜂草苷在制備治療或預防陰道出血的藥物中的應用。
本發明提供了香蜂草苷在制備治療或預防消化道出血的藥物中的應用。
本發明提供了香蜂草苷在制備治療或預防病理性出血(血友病)的藥物中的應用。
本發明所述的香蜂草苷在用于上述任一用途時，其使用劑量范圍為5mg～500mg/天。
本發明提供了以香蜂草苷為活性成分用于治療或預防出血性疾病的藥物組合物。
本發明提供的藥物組合物，其活性成分的含量范圍為5-500mg。
本發明提供的藥物組合物可以通過口服、舌下、經皮、經肌肉或皮下、皮膚粘膜、陰道、靜脈途徑給藥。藥物組合物可以以粉針劑、注射液、栓劑、片劑、膠囊、軟膠囊、滴丸或口服液的形式存在。本發明所提供的各種藥物劑型均可以以藥學常規方法制備而成。
以下詳細的描述將有助于更進一步理解本發明。
外出血——體表可見到。血管破裂后，血液經皮膚損傷處流出體外。
內出血——體表見不到。血液由破裂的血管流入組織、臟器或體腔內。陰道出血包括子宮功能性、功能失調性、子宮肌瘤、子宮肌腺癥、宮頸炎癥、宮頸癌、子宮內膜炎、子宮肌炎、子宮內膜癌、宮頸、宮體惡性腫瘤晚期引起的出血。
消化道出血包括上消化道出血和下消化道出血，前者是指食管、胃、十二指腸、胰腺、膽道等部位的出血；后者是指空腸、回腸和大腸出血被稱為下消化道出血。
創傷性出血是指因事故、手術引起的出血。
本發明人通過下列試驗證實了香蜂草苷具有治療或預防的作用，下面的實施例用來更詳細的說明本發明，但并不意味著本發明僅限于此。
具體實施例方式制備實施例1制備香蜂草苷斷血流藥材粉碎后加入10倍量水，浸泡30分鐘后用水煮，煎煮2小時后，過濾，濾渣再加入10倍量水煎煮，過濾，合并濾液，濾液濃縮至五分之一體積時，加入1倍量的95％乙醇，攪勻，靜置過夜，過濾，濾液用5倍體積水稀釋，用AB-8大孔樹脂吸附，吸附樹脂用去離子水洗后，80％乙醇洗脫，洗脫液減壓濃縮后至無醇味后，用聚酰胺吸附，用40％的乙醇洗脫，洗脫液濃縮后，用制備液相分離，蒸干即得，經HPLC檢測，峰面積歸一化法其純度為98.6％。
薄層層析將分離制得的香蜂草苷用甲醇溶解后點樣10μl于硅膠G預制板(100×100mm)上，展開劑為氯仿-甲醇-冰醋酸-水(70∶30∶10∶3)，顯色劑為10％的硫酸乙醇溶液，噴霧后加熱顯色。檢測結果表明香蜂草苷中無其它雜質斑點。
液相色譜分析將分離制得的香蜂草苷用甲醇溶解后進樣10μl，進行HPLC分析，色譜條件如下色譜柱為LUNA C18粒徑5μm，250mm×4.6mm，SUPELCO公司產品；流動相為甲醇-0.2％的磷酸(v/v)為5050；流速為0.8ml/mim；檢測波長為220nm；峰面積歸一化其純度為98％以上。本品為淡黃色粉末，mp209～211℃，TLC酸水解，產生Glc和Rham。UV(λmax，nm)281，326.ESI-MS595(M+H)+，1H-NMR(DMSO)12.02(1H，s，C5-OH)，7.46，6.97(各2H，d，J＝8.7Hz，2’，6’-H，3’，5’-H)，6.13(2H，s，6，8-H)，5.57(1H，dd，J＝12.6，2.8Hz，2-H)，4.96(1H，d，J＝7.5Hz，Glc1-H)，4.51(1H，brs，Rham 1-H)，3.77(3H，s，OCH3)，2.77(1H，dd，J＝17，2.7，3-H)1.08(3H，d，J＝6.0Hz，Rham-CH3)。1H-NMR譜、13C-NMR譜數據與文獻報道陳靖宇，陳建民等，蔭風輪的化學成分研究(I)*，天然產物研究與開發，1997，9(3)香蜂草苷的波譜數據基本一致。
制備例2制備片劑取香蜂草苷細粉適量，以淀粉為添充劑，以5％的淀粉漿作為粘合劑，制粒，加入硬脂酸鎂，混勻，用壓片機壓制為片劑。或按本領域技術人員公知的技術方法制備口崩片。
制備例3制備膠囊劑取香蜂草苷細粉適量，以淀粉為添充劑，加入硬脂酸鎂，混勻，直接填充為膠囊劑。
制備例4制備口服液取香蜂草苷細粉適量用蒸餾水溶解，再加入總體積10％的糖漿作為調味劑和3％苯甲酸鈉作為防腐劑分裝即得。
制備例5制備外用氣霧劑取香蜂草苷細粉適量用蒸餾水溶解，用0.22μm的微孔濾膜過濾，再加入總體積10％的異丙醇和3％苯甲酸鈉作為防腐劑，分裝并加入異丁烷、二氧化碳等適宜的拋射劑封裝即得。
制備例6制備注射液用生理鹽水將香蜂草苷溶解，以1mol/L鹽酸和1mol/L氫氧化鈉調節pH值為5.5±1.0，加入0.1％的針用活性炭80保溫30分鐘，G3垂熔玻璃漏斗過濾，0.22μm的微孔濾膜過濾；濾液分裝于5ml的安瓿瓶中，熔封，滅菌即得。
制備例7制備凍干粉針用生理鹽水將香蜂草苷溶解，加入10％甘露醇，以1mol/L鹽酸和1mol/L氫氧化鈉調節pH值為5.5±1.0，加入0.1％的針用活性炭80保溫30分鐘，G3垂熔玻璃漏斗過濾，0.22μm的微孔濾膜過濾；濾液分裝于7ml的西林瓶中，凍干，壓塞，壓鋁蓋即得。
試驗例1.小鼠的斷尾出血實驗1.1材料動物清潔級昆明種小鼠，體重18～22g，雌雄各半，由山東省綠葉制藥股份有限公司實驗動物中心提供，動物合格證號為SYXK(魯)20030020。
藥物香蜂草苷片按制備例2制備，批號050415；香蜂草苷注射液按制備例6制備，批號050416；斷血流片，安慶乘風制藥有限公司，批號040804。
2.1方法與結果取健康小鼠60只，雌雄各半，按體重隨機分為空白對照組(生理鹽水)，香蜂草苷注射液(iv給藥)1mg/kg組、10mg/kg組和100mg/kg組，香蜂草苷片100mg/kg，斷血流片1g/kg組。各組連續給藥3天，每天一次，末次給藥0.5小時后，用手術刀將小鼠尾尖50mm處橫斷，待血液自行溢出時計時，每隔30s用濾紙吸血滴1次，直至血液自然停止，計算出血時間。結果見表1。
表1香蜂草苷灌胃給藥后小鼠斷尾出血時間(x±s，n＝10)

*與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01如表1所示，香蜂草苷4個劑量組均能明顯縮短小鼠出血時間。
試驗例2香蜂草苷對小鼠肝素抗凝血的抑制作用2.1材料動物清潔級昆明種小鼠，體重18～22g，雌雄各半，由山東省綠葉制藥股份有限公司實驗動物中心提供，動物合格證號為SYXK(魯)20030020。
香蜂草苷片按制備例2制備，批號050415；香蜂草苷注射液按制備例6制備，批號050416；斷血流片，安慶乘風制藥有限公司，批號040804。
2.2方法與結果取健康小鼠70只，雌雄各半，隨機分成6組，空白對照組(生理鹽水)，模型組(生理鹽水)，香蜂草苷注射液1mg/kg組、10mg/kg組和100mg/kg組，香蜂草苷片100mg/kg；斷血流片1g/kg組。各組連續給藥3天，每天一次，末次給藥0.5小時后，除空白對照組外，其它各組每只小鼠尾靜脈注射肝素60U/kg，15min后由內眥球后靜脈叢取血，按毛細玻管法測定凝血時間(min)，結果見表2。
表2.香蜂草苷對小鼠肝素抗凝血的抑制作用

*與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001如表2所示，香蜂草苷能明顯對抗肝素引起小鼠凝血時間的延長。凝血時間顯著縮短。
試驗例3香蜂草苷對脾胃虛寒出血模型止血作用的影響3.1材料 動物 清潔級昆明種小鼠，體重18～22g，雌雄各半，由山東省綠葉制藥股份有限公司實驗動物中心提供，動物合格證號為SYXK(魯)20030020。
香蜂草苷片按制備例2制備，批號050415；香蜂草苷注射液按制備例6制備，批號050416；消炎痛，邯鄲滏榮制藥有限公司生產，批號020203；乙醇，山東煙臺市化工廠生產，批號021127。平面體視顯微鏡，北京泰克儀器有限公司生產。
3.2方法與結果將昆明種小鼠50只隨機分為空白對照組、模型組，香蜂草苷注射液高(10mg/kg)、低劑量(1mg/kg)組，香蜂草苷片100mg/kg組。空白組對照組飼以普通飲食，模型組及給藥組參照文獻[陳小野.實用中醫證候動物模型學.北京北京醫科大學，中國協和醫科大學聯合出版社，1993.285]造摸，飼養10日后，禁食16h，外，其它各組利用消炎痛加乙醇，每日灌胃造模藥0.25ml/10g體重，連續給藥10d后，胃出血造模參照文獻[沈雅琴，陳光娟，朱自平.中藥蓽澄茄“溫中止痛”藥理研究.中藥藥理與臨床，1991(2)18]用消炎痛加乙醇法，腹腔注射消炎痛7.5mg/ml，0.1ml/10g體重，0.5h后，給藥組灌胃給予香蜂草苷，3h后重復灌胃1次，第2次灌胃2.5h后，模型組再灌胃50％乙醇，0.1ml/10g體重，解剖取胃，福爾馬林固定，解剖鏡下觀察腺胃部糜爛出血點數。結果見表3。
表2.香蜂草苷對脾胃虛寒出血模型止血作用

*與模型組比較，*P＜0.05，***P＜0.001如表3所示，與模型對照組比較，香蜂草苷顯著降低胃潰瘍出血點數。
試驗例4香蜂草苷對早孕大鼠子宮出血的影響4.1材料動物SD大鼠，♀鼠220～250g，♂鼠250～300g，由山東省綠葉制藥股份有限公司實驗動物中心提供，動物合格證號為SYXK(魯)20030020。
香蜂草苷片按制備例6制備，批號050415；香蜂草苷注射液按制備例6制備，批號050416；宮血寧膠囊云南白藥集團有限公司生產，批號030414；米非司酮上海華聯制藥有限公司產品，批號44040807，用時以5g/L羧甲基纖維素鈉配制成混懸液；米索前列醇北京紫竹藥業有限公司制造，批號42040705，用時以5g/L羧甲基纖維素鈉配制成混懸液。
4.2方法與結果造模大鼠每日20:00時♀、♂按2∶1比例合籠，次日08:00時進行陰道涂片檢查，以發現精子為妊娠第1天。于第7天08:00和18:00時分別灌服米非司酮(13.8mg/kg)和米索前列醇(135ug/kg)，引起不完全流產模型。同時陰道內置入定量棉球一個(棉球重75～80mg，用塑料薄膜包裹半側，以防血液漏出和尿液返流)。次日分別于08:00和18:00將棉球取出，放入塑料袋中密閉冷藏保存，同時置換一個新棉球于陰道內，觀察陰道出血情況，連續至第14天。實驗分組和給藥方法取48只妊娠大鼠，未造模的8只大鼠為空白對照組，其余40只造模大鼠隨機分為5組模型對照組、宮血寧組(0.1g/kg)、香蜂草苷注射液高劑量組(10mg/kg)、香蜂草苷注射液低劑量組(1mg/kg)。各組于造模次日(第8天)開始灌胃，連續7d。按照文獻[王曉東，趙軍寧，張白嘉等.藥物致早孕大鼠子宮出血模型的建立.中國藥理學通報，1999；15(2)182～184]的方法測定子宮出血量。結果見表4表4.香蜂草苷對早孕大鼠子宮出血的影響

*與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01如表4所示，與模型對照組比較，香蜂草苷顯著減少早孕大鼠子宮出血量。
試驗例5香蜂草苷對離體家兔動脈條的作用5.1材料動物新西蘭大白兔，雌雄各半，1.5～2.5kg，由山東省綠葉制藥股份有限公司實驗動物中心提供，動物合格證號為SYXK(魯)20030020。
香蜂草苷溶液按制備例4制備，批號050416；去甲腎上腺素上海禾豐制藥有限公司生產，批號0306012，；Krebs液山東省綠葉天然藥物研究開發有限公司藥理室配置；BIOPAC M150多導生理紀錄儀、張力傳感器(TSD105A)均為BIOPAC Systems，Inc.公司生產。
5.2方法與結果家兔胸主動脈條的制備取健康家兔(1.5～2.5kg)，雌雄兼用。猛擊家兔頭部，剪取胸主動脈制成3×30mm的螺旋形肌條，將肌條置于含有改良Krebs液中(38±0.5)℃，pH值為7.2～7.4，通以95％O2+5％CO2。肌條一端固定在通氣鉤上，另一端通過肌張力傳感器記錄在BIOPAC M150多導生理紀錄儀上，負荷2g張力，平衡1.5～2h后開始實驗，用0.01％去甲腎上腺素檢驗血管收縮活性。穩定后加入香蜂草苷溶液(濃度A組、濃度B組、濃度C組)，記錄收縮曲線，作用達高峰后，繼續記錄一段時間，觀察作用維持時間。結果見表5
表5.香蜂草苷溶液對兔主動脈條的作用

表5可見，香蜂草苷可提高血管收縮力，具有較強的縮血管作用。
試驗例6香蜂草苷對正常大鼠離體子宮平滑肌收縮的作用6.1材料動物SD大鼠，♂鼠250～300g，由山東省綠葉制藥股份有限公司實驗動物中心提供，動物合格證號為SYXK(魯)20030020。
香蜂草苷溶液按制備例4制備，批號050416；；Krebs液山東省綠葉天然藥物研究開發有限公司藥理室配置；BIOPAC M150多導生理紀錄儀、張力傳感器(TSD105A)均為BIOPACSystems，Inc.公司生產。
6.2方法與結果取雌性未孕SD大鼠(體重250～300g)50只，隨機分5組，每組10只。實驗前24～48h皮下注射已烯雌酚1mg/kg體重促發情。實驗時將大鼠處死，取子宮約長2cm，一端固定在通氣鉤上，另一端通過肌張力傳感器記錄在BIOPAC M150多導生理紀錄儀上，負荷2g張力，平衡1.5～2h后開始實驗，用0.01％去甲腎上腺素檢驗子宮的收縮活性。穩定后加入香蜂草苷溶液(高濃度組A、中濃度組B、低濃度組C)、縮宮素溶液D，記錄收縮曲線，收縮幅度、收縮頻率，結果見表6。
表6.香蜂草苷溶液對正常大鼠離體子宮平滑肌收縮的作用

*與用藥前比較，*P＜0.05表6可見，香蜂草苷和縮宮素對正常大鼠子宮平滑肌收縮幅度、收縮頻率均有明顯影響，其效果與縮宮素接近，經檢驗與用藥前有顯著性差異(P＜0.05)。
權利要求
1.以香蜂草苷為活性成分的用于治療或預防出血性疾病的藥物組合物。
2.根據權利要求1所述的藥物組合物，其活性成分的含量范圍為5-500mg。
3.香蜂草苷在制備治療或預防出血性疾病的藥物中的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，香蜂草苷在制備治療或預防內出血的藥物中的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，香蜂草苷在制備治療或預防陰道出血的藥物中的應用。
6.根據權利要求4所述的應用，香蜂草苷在制備治療或預防消化道出血的藥物中的應用。
7.根據權利要求4所述的應用，香蜂草苷在制備治療或預防病理性出血(血友病)的藥物中的應用。
8.根據權利要求3所述的應用，香蜂草苷在制備治療或預防外出血的藥物中的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，香蜂草苷在制備治療或預防創傷性出血的藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供了香蜂草苷在制備治療或預防出血性疾病的藥物中的應用，具體地提供了香蜂草苷在制備治療或預防內出血、陰道出血、消化道出血、病理性出血及外出血的藥物中的應用。
文檔編號A61P7/04GK1872083SQ20051004369
公開日2006年12月6日 申請日期2005年5月31日 優先權日2005年5月31日
發明者宋吉倫, 張紅香, 王超云 申請人:山東綠葉天然藥物研究開發有限公司