專利名稱：組合物,其提取物及它們的藥物用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及包括羌活，獨活，黃芩，黃連和葛根的組合物，其提取物，其制備方法及上述組合物或其提取物的藥物用途，尤其是在鎮痛解熱，由病毒尤其是流感病毒引起的感冒，抗炎及增強免疫功能方面的用途。
背景技術：
目前用于預防或治療發燒，炎癥，由病毒引起的感冒或增強免疫功能的藥物大多數為化學合成藥，這些藥物在治療中或多或少都會帶來一些藥物不良反應。因此，尋找并開發療效明確且藥物不良反應小的來自植物或動物的產品仍是十分需要的。

發明內容
本發明人經研究現已發現包括來自植物的羌活、獨活、葛根、黃芩和黃連的組合物或其提取物具有優良的解熱鎮痛、緩解或減輕或治療由病毒尤其是流感病毒引起的感冒癥狀、抗炎及免疫調節作用且基本無藥物不良反應。
因此，本發明涉及組合物，其包括來自植物的羌活、獨活、葛根、黃芩和黃連。
本發明還涉及提取物，其特征在于該提取物是來自植物的羌活、獨活、葛根、黃芩和黃連混合物的C1-4烷基醇提取物。
本發明還涉及提取物的制備方法，其包括a.用含水C1-4烷基醇提取羌活、獨活、葛根、黃芩和黃連的混合物；b.過濾a)中提取液，減壓濃縮濾液至浸膏，其相對密度為1.15-1.20；
c.將b)中浸膏與水攪拌，室溫靜置，抽濾；d.干躁c)中抽濾后的沉淀物。
本發明還涉及藥物組合物，其包括來自植物羌活、獨活、葛根、黃芩和黃連的提取物和/或藥用載體。
本發明還涉及來自植物的羌活、獨活、葛根、黃芩和黃連的組合物或其提取物在制備用于預防或治療發燒、由病毒引起的感冒，炎癥或與免疫功能有關癥狀或疾病的藥物中的用途。
根據本發明，本發明中所用的羌活優選為傘形科植物羌活(Notopterygium incisum Ting ex H.T.Chang)的干躁根莖，其通常應符合《中國藥典》2000年版(一部)第144頁羌活項下的有關規定。進一步講，所述羌活優選含異歐胡前素(C16H14O4)不少于0.3％。
根據本發明，本發明中所用的獨活優選為傘形科植物重齒毛當歸(Angelica pubescens Maxin.F.biserrata Shan et Yuan)的干躁根，其通常應符合《中國藥典》2000年版(一部)第215頁獨活項下的有關規定。進一步講，所述獨活優選含蛇床子素(C15H16O3)不少于0.3％。
根據本發明，本發明中所用黃芩優選為唇形科植物黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干躁根，其應符合《中國藥典》2000年版(一部)第248頁黃芩項下的有關規定。
根據本發明，本發明所用的黃連優選毛茛科植物黃連(Coptischipensis Franch)的干躁根莖，其應符合《中國藥典》2000年版(一部)第250頁黃連項下的有關規定。
根據本發明，本發明中所用葛根優選為蘭科植物苷葛藤(Puerariathomsonii Benth)的干燥根，其應符合《中國藥典》2000年版(一部)第273頁葛根項下的有關規定。
根據本發明，本發明的組合物可以經煎煮后使用。
根據本發明，本發明的提取物可以單獨或與藥物載體混合通過口服或非腸道途徑給藥。適于口服給藥的劑型舉例講有片劑，膠囊，口服液或懸浮液等。適于非腸道給藥的劑型舉例講有注射液。進一步講，本發明提取物也可為單位劑型，如0.1-0.8g本發明提取物/粒膠囊。
根據本發明講，本發明中所述含水C1-4烷基醇優選為80％乙醇水溶液。根據本發明，本發明中所述藥用載體為制藥領域中已知的藥用載體，舉例講，如國家藥品注冊中允許使用的藥用載體或賦形劑或輔料。
根據本發明，本發明所述提取物的制備可以如下進行將羌活，獨活，葛根，黃芩和黃連的混合物用80％乙醇回流提取兩次，每次1小時。第1次提取所加80％乙醇量為羌活，獨活，葛根，黃芩和黃連量的8倍，然后濾過；第二次提取所加80％乙醇量為所述混合物的6倍量，濾過。合并第一次和第二次的乙醇提取液，減壓濃縮至浸膏，加6倍量水到浸膏中，充分攪拌，靜置6小時，抽濾。所得沉淀于60-100℃下干燥，然后粉碎，過60目篩，得粉末狀物。提取率6-48％。根據本發明，本發明提取物(下面簡稱本品)具有下面性質(1)取本品0.3g，加無水乙醚20ml，室溫放置2小時，濾過，濾液低溫揮去乙醚，殘渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作為供試品溶液。取異歐前胡素對照品，加甲醇制成每ml含1mg的溶液，作為對照品溶液。另取羌活對照藥材0.2g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2000年版一部附錄VIB)試驗，吸取供試品溶液4μl、對照品溶液2μl、對照藥材溶液4μl，分別點樣于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-苯-乙酸乙酯(3∶1∶1)為展開劑，展開，取出，105℃加熱約5小時至斑點清晰，冷卻，日光下檢視。供試品色譜中，在與對照品及對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；(2)取本品0.3g，加無水乙醚20ml，室溫放置2小時，濾過，濾液低溫揮去乙醚，殘渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作為供試品溶液。取蛇床子素對照品，加甲醇制成每ml含1mg的溶液，作為對照品溶液。另取獨活對照藥材0.2g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2000年版一部附錄VIB)試驗，吸取供試品溶液4μl、對照品溶液2μl、對照藥材溶液4μl，分別點樣于同一硅膠G薄層板上，以石油醚-乙醚-冰醋酸(10∶10∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品及對照藥材色譜相應的位置上，顯示相同藍紫色的熒光斑點；
(3)取本品0.2g，加甲醇10ml，室溫放置1小時，濾過，濾液即作為供試品溶液。取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每ml含1mg的溶液，作為對照品溶液。另取黃連對照藥材0.1g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2000年版一部附錄VIB)試驗，吸取供試品溶液2μl、對照品溶液1μl、對照藥材溶液2μl，分別點樣于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品及對照藥材色譜相應的位置上，顯示相同亮黃色的熒光斑點；水分不得超過5.0％(《中國藥典》2000年版一部附錄IX H水分測定法項下烘干法)。
總香豆素含量對照品溶液的制備精密稱取蛇床子素對照品適量，加無水乙醇制成每ml含0.087mg的溶液，作為對照品溶液。
標準曲線的制備分別精密吸取對照品溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，置于25ml量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，搖勻。以無水乙醇為空白。照分光光度法(《中國藥典》2000年版一部附錄V)，在322nm波長處測定吸收度，以吸收度為縱坐標、濃度為橫坐標，繪制標準曲線。
測定法取本品約50mg，精密稱定，置50ml三角瓶中，加無水乙醚30ml，超聲提取30分鐘，濾過，用無水乙醚分次洗滌濾紙和漏斗，洗滌液與濾液合并，回收乙醚，殘渣以無水乙醇溶解，置于25ml量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，靜置。精密量取上述溶液1ml置25ml量瓶中，以無水乙醇稀釋至刻度，搖勻。照標準曲線制備項下的方法，測定吸收度，從標準曲線上讀出供試品溶液中總香豆素的含量，計算，即得。
本品含總香豆素以蛇床子素(C15H16O3)計，不得低于6.5％。
總黃酮對照品溶液的制備精密稱取黃芩苷對照品適量，以80％乙醇溶解，制成濃度為0.088mg/ml的對照品溶液。
標準曲線的制備分別精密吸取對照品溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，置于25ml量瓶中，以80％乙醇稀釋至刻度，搖勻。以80％乙醇為空白。照分光光度法(《中國藥典》2000年版一部附錄V)，在276nm波長處測定吸收度，以吸收度為縱坐標、濃度為橫坐標，繪制標準曲線。
測定法取本品約30mg，精密稱定，置50ml量瓶中，加80％乙醇30ml，超聲提取10分鐘，以80％乙醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液1ml拌入0.5g聚酰胺粉(80-120目)，水浴加熱揮干溶劑后，加到已裝有0.5g聚酰胺粉的層析柱中，用水洗脫40ml，棄去，改用80％乙醇洗脫，收集洗脫液約100ml，減壓濃縮至小體積，轉移至25ml量瓶中，加80％乙醇稀釋至刻度，搖勻。照標準曲線制備項下的方法，測定吸收度，從標準曲線上讀出供試品溶液中總黃酮的含量，計算，即得。
本品含總黃酮以黃芩苷(C12H18O11)計，不得低于24.3％。
總生物堿對照品溶液的制備精密稱取鹽酸小檗堿對照品適量，以水溶解，制成濃度為0.022mg/ml的對照品溶液。
標準曲線的制備分別精密吸取對照品溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，置于50ml分液漏斗中，加水補充至同一體積，依次精密加入pH5.20的鄰苯二甲酸氫鉀溶液5ml、0.1％溴麝香草酚藍溶液1ml、氯仿10ml，用力振搖2分鐘，靜置40分鐘，分取下層氯仿液，以相應的試劑為空白。照分光光度法(《中國藥典》2000年版一部附錄V)，在416nm波長處測定吸收度，以吸收度為縱坐標、濃度為橫坐標，繪制標準曲線。
測定法取本品約30mg，精密稱定，置50ml量瓶中，加80％乙醇30ml，超聲提取10分鐘，以80％乙醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液0.5ml，照標準曲線制備項下的方法，自“加水補充至同一體積”起，依法測定吸收度，從標準曲線上讀出供試品溶液中總生物堿的含量，計算，即得。
本品含總生物堿以鹽酸小檗堿(C20H17NO4·HCl)計，不得低于19.2％。
具體實施例方式
下面的實施例及試驗例用來進一步說明本發明，但其并不意味著對本發明的任何限制。
實施例1本發明組合物的組成成份 量(克)羌活(干燥根莖) 700獨活(干燥根) 525黃芩(干燥根) 525黃連(干燥根莖) 525葛根(干燥根) 525實施例2本發明提取物的制備將羌活700g，獨活525g，葛根525g，黃芩525g和黃連525g混合，往其中加入80％乙醇回流提取2次，每次1小時。其中第一次提取加入的80％乙醇量為所述混合物的8倍量，提取后濾過；第二次提取加入的80％乙醇量為所述混合物的6倍量，提取后過濾。合并第1次提取和第二次提取的80％乙醇提取液，減壓濃縮(65℃，0.095MPa)至浸膏(50℃，相對密度1.15-1.20)，加水至浸膏總重的6倍，充分攪拌，室溫清置6小時，抽濾，沉淀物80℃下真空干躁，粉碎，過60目篩，得到提取率為6.48％的本發明提取物。
實施例3實施例2提取物對正常和發熱大鼠體溫的作用材料與方法受試藥物實施例2。清華大學生物科學與技術系藥物藥理室提供。批號010318。用時以蒸餾水溶解藥物至所需濃度。
雄性Wistar大鼠，非近交系封閉群。體重195.58±10.56g(正常體溫)。178.73±11.13g(發熱大鼠治療給藥)，185.42±13.55g(發熱大鼠預防給藥)。由中國醫學科學院實驗動物研究所繁育場提供。合格證號SCXK11-00-0006。每組12只。
干酵母粉。100g/袋。批號990608。丹麥合資丹保利酵母廠生產。用時以生理鹽水調至所需濃度。
HP-200液晶溫度計。測溫探頭Φ2mm。北京師范大學實驗儀器廠生產。
對正常大鼠體溫的影響取大鼠隨機分組，測量體溫兩次，間隔30分鐘，取兩次體溫差值在0.4℃以內者作為試驗對象。灌胃不同劑量的藥物，給藥后分別于1，2，3，4，5，6小時測量體溫，并記錄之。計算體溫波動值和曲線下面積。做組間比較。
對發熱大鼠的治療作用取大鼠隨機分組，測量體溫兩次，間隔30分鐘，取兩次體溫差值在0.4℃以內者，作為試驗對象。背部皮下注射15％干酵母生理鹽水液，1mL/100g體重。注射后放入籠中，禁食不禁水，于注射后3-5小時測體溫，取體溫升高0.8以上者納入試驗組，灌胃不同劑量的藥物。分別于藥后1，2，3，4，5，6小時測量體溫并記錄之，計算體溫升高值和曲線下面積。
對大鼠體溫升高的預防作用取大鼠隨機分組，測量體溫兩次，間隔30分鐘，取兩次體溫差值在0.4以內者，作為試驗對象。口服不同劑量的藥物，于給藥后即刻背部皮下注射酵母液，劑量同上。于注射后1，2，3，4，5，6小時測量體溫，計算體溫升高值和曲線下面積(AUC)，以此來反應體溫抑制指數。
大鼠測深部直腸溫度(探頭6cm)來反應體溫。
體溫升高值＝藥后體溫-正常平均體溫。
體溫抑制指數(TRI)＝∑[(Ci+Ci-1)/2*Δt](C體溫變化值，i采樣點。t測試時間。
劑量設置

給藥途徑與體積灌胃，1mL/100g體重。
1.空白對照蒸餾水。
2.陽性藥對照感冒軟膠囊。北京同仁堂制藥廠生產，批號8170098。本品由羌活、麻黃、荊芥穗、川芎、薄荷等藥物組成，具有散風解熱的作用，用于外感風寒引起的頭痛身熱、鼻塞流涕、惡寒無汗、骨節酸痛、咽喉腫痛等癥，450mg/粒。zz-3242-京衛藥準字(1993)第004008號。
阿斯匹林。0.3g/片。具有解熱鎮痛的作用。批號001208。北京市曙光制藥廠生產。
試驗數據以EXCEL軟件處理。組間t檢驗。以P＜0.05，P＜0.01為顯著性檢驗水平。
結果見表1-1至1-5。
表1-1對正常大鼠體溫的影響(x±s)

與對照組相比，*P＜0.05。n＝10
表1-2不同藥物對發熱大鼠的預防作用(x±s)

與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。n＝10
表1-3不同藥物對發熱大鼠體溫的抑制作用(x±s)

與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。n＝10
表1-4不同藥物大鼠體溫指數比較(x±s)

與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。n＝10
表1-5不同藥物對發熱大鼠體溫的升高百分率(x±s)

*體溫升高百分率＝[(給藥后體溫升高均值-給藥前體溫升高均值)/給藥前體溫升高均值*100％]**“-”體溫降低。“+”體溫升高。
討論與結論1對正常大鼠體溫的影響。給藥后不同時間內對照組體溫略有下降。阿斯匹林體溫下降較明顯，但由于標準差過大，與對照組相比無統計學意義。實施例2提取物三劑量組體溫變化無明顯差異。感冒軟膠囊在藥后2，3小時體溫無明顯下降，略有升高，與對照組相比有統計學意義，但由于體溫升高在0.2℃之內，無實際意義。
2對酵母液給大鼠背部皮下注射導致體內產生內生致熱原，從而引起發熱。這種發熱需要3-5小時。在體溫升高之前有一個明顯體溫下降的過程，在這一時期大鼠明顯地表現為倦縮、寒顫等。此與體內產熱過程有關。而且這種體溫下降越明顯，之后的發熱越高。實驗結果表明，實施例2提取物能夠明顯減輕造模后大鼠體溫下降，并能在一定程度上抑制其后的發熱。大中劑量在注射酵母后3，5，6小時與對照組相比，差異有統計學意義(P＜0.05)。陽性藥阿斯匹林在注射酵母后2小時體溫明顯降低，并與對照組相比有統計學意義。在5，6小時能夠明顯抑制體溫的升高。感冒軟膠囊與阿斯匹林有相同的效應。只是作用輕于阿斯匹林。對注射酵母后的體溫下降無明顯抑制作用。
3在注射酵母后待大鼠體溫升高至0.8℃以上者作為發熱模型，然后口服不同劑量的藥物，以觀察其解熱作用。實驗結果表明，給藥后實施例2提取物對發熱大鼠的體溫有明顯的抑制作用，大劑量組藥后1小時體溫下降16.9％，2，3小時體溫分別下降33.8％和50.7％。相同時間對照組體溫則分別上升7.07％，7.07％和11.11％。陽性藥阿斯匹林表現出作用快但持續時間短特點，藥后1-3小時體溫分別下降35.3％，63.3％和52.1％。以后體溫回升。感冒軟膠囊解熱作用弱于實施例2提取物，藥后1-3小時，體溫分別下降9.95％，25.3％和22.6％。具體結果參表5.4 TRI(temperature resistant index)為不同時間點體溫變化值所描繪曲線下面積(AUC)之和。它不但反應某一時間點體溫的高低，而且全面反應在實驗觀察時間內整個體溫變化的情況。是一個綜合評價藥物解熱作用的指標。結果表明，實施例2提取物對發熱大鼠體溫整體有明顯的抑制作用，大中小三劑量TRI6小時分別為3.060±1.152，3.690±1.617和4.040±1.515，與對照組相比(5.230±0.947)，差異有顯著性(P＜0.05)。阿斯匹林有明顯的作用，TRI6小時為3.060±0.909。感冒軟膠囊也有明顯的抑制作用，其TRI6小時為3.990±1.051，但不及實施例2提取物大劑量組，僅相當于中劑量組效應。
對正常大鼠及發熱預防作用的TRI6小時，由于個體差異較大，標準差過大，雖有一定的趨勢，但無統計學意義。
但總地來說，實施例2提取物對正常大鼠體溫無明顯影響，對發熱大鼠的體溫有明顯的抑制作用。
二對發熱家兔體溫的作用實施例2提取物能夠明顯的抑制發熱家兔的體溫升高.
觀察實施例2提取物對發熱家兔的體溫影響。
材料與方法受試藥物實施例2提取物。批號及來源同前。用時以蒸餾水溶解藥物至所需濃度。
動物為雄性日本大耳白家兔，非近交系封閉群。體重1.78±0.14kg。由中國醫學科學院實驗動物研究所繁育場提供。合格證號SCXK11-00-0002。每組6只。
大腸桿菌內毒素。購自上海第二醫科大學微生物教研室。批號001116。肝素為Sigma產品。
HP-200液晶溫度計。測溫探頭Φ2mm。北京師范大學實驗儀器廠生產。AS-2100恒溫水浴振蕩儀。上海醫用儀器廠生產。LD5-2A型離心機。北京醫用離心機廠。
試驗主要步驟內生致熱原制備參文獻[7-9]進行。
將正常雄性大鼠肝素化(1200ug/kg，iv)，然后頸總動脈取血，在全血中加入大腸桿菌內毒素(5ug/100mL全血)，38℃水浴振蕩溫育1小時，2000轉離心15分鐘，用無菌生理鹽水洗滌沉淀，再離心15分鐘，去上清。在沉淀中加入與原上清等體積的無菌生理鹽水，38℃水浴培養18小時，2000轉離心15分鐘，取上清液，用Φ0.22um的微孔濾膜超濾。取濾液(EP液)分裝，-20℃保存備用。
發熱家兔模型的制備及給藥取正常家兔隨機分為6組，測兩次體溫，取均值作為正常體溫。每只家兔耳緣靜脈注射EP液，3mL/kg體重。注射完即刻灌胃不同劑量的藥物。分別于給藥后0.5，1，2，3，4，5，6小時測1次體溫。計算體溫變化值和曲線下面積。做組間比較。
3兔測深部直腸溫度(探頭6cm)來反應體溫.
5體溫升高值＝藥后體溫-正常平均體溫。
體溫抑制指數(TRI)＝∑[(Ci+Ci-1)/2*Δt](C體溫變化值，i采樣點。t測試時間。
劑量設置
灌胃，2mL/kg體重。
1.空白對照蒸餾水。
2.陽性藥對照感冒軟膠囊。北京同仁堂制藥廠生產，批號8170098。本品由羌活、麻黃、荊芥穗、川芎、薄荷等藥物組成，具有散風解熱的作用，用于外感風寒引起的頭痛身熱、鼻塞流涕、惡寒無汗、骨節酸痛、咽喉腫痛等癥，450mg/粒。zz-3242-京衛藥準字(1993)第004008號。
阿斯匹林。0.3g/片。具有解熱鎮痛的作用。批號001208。北京市曙光制藥廠生產。
試驗數據以EXCEL軟件處理。組間t檢驗。以P＜0.05，P＜0.01為顯著性檢驗水平。
結果表2-1不同藥物對發熱家兔體溫的抑制作用(x±s)

與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。n＝6表2-2不同藥物家兔體溫指數比較(x±s)

與對照組相比，*P＜0.05，*P＜0.01。n＝6
表2-3不同藥物對發熱家兔體溫的升高百分率的影響

*體溫升高百分率＝[(給藥后體溫升高均值-0.5小時體溫升高均值)/0.5小時體溫升高均值*100％]**“-”體溫降低。“+”體溫升高。
討論與結論1在注射EP后各組家兔體溫均明顯升高，唯小劑量組升高幅度較小。對照組體溫升高持續5小時，待6小時時體溫下降。
2實施例2提取物三劑量組對發熱家兔體溫有明顯的抑制作用。以大劑量明顯，并呈一定的量效關系。一般在藥后2小時體溫明顯下降，并能持續至5-6小時。陽性藥阿斯匹林作用較快，在藥后1小時即使體溫明顯下降，下降率為38.3％。感冒軟膠囊解熱特點基本同實施例2提取物。
3結果表明，實施例2提取物對發熱大鼠體溫整體有明顯的抑制作用，大中小三劑量TRI6小時分別為3.358±1.066，4.019±1.067和2.854±0.978，與對照組相比(5.325±1.03)，差異有顯著性(P＜0.05)。以大、小劑量組明顯。阿斯匹林有明顯的作用，TRI6小時為2.850±0.788。感冒軟膠囊也有明顯的抑制作用，其TRI6小時為3.708±1.175，但不及實施例2提取物大、小劑量組，僅相當于中劑量組效應。
實施例2提取物對對發熱家兔的體溫有明顯的抑制作用。
實施例4實施例2提取物的抗病毒作用在MDCK細胞中研究實施例2提取物對細胞的毒性，及對流感病毒甲型，流感病毒乙型的抑制效果。實驗表明對流感病毒甲型，實施例2提取物兩批實驗的半數有效濃度(IC50)平均為0.055±0.011mg/mL，對流感病毒乙型，兩批實驗的半數有效濃度平均為0.048±0.0014mg/mL，對細胞的半數毒性濃度(TD50)平均為0.188±0mg/mL。實施例2提取物0.078mg/mL在VERO細胞內對COXB3感染的CPE無抑制作用。
觀察觀察實施例2提取物對感染小鼠的抗病毒作用，以及在細胞培養內對流感病毒甲、乙型，COXB3的抑制作用。具體如下所示。
對小鼠感染病毒的保護作用材料與方法[受試藥物]實施例2提取物。批號及來源同前。用時以蒸餾水溶解藥物至所需濃度。
KM小鼠，非近交系封閉群，雄性。體重15.24±0.81g。由中國預防醫學科學院微生物流行病研究所提供。合格證號96-36號。每組15只。
購自中國預防醫學科學院病毒所。流感病毒(A31.四川97-315)。牛肉湯粉。購自中國藥品生物制品檢定所，批號001224。試驗步驟稀釋病毒用肉湯將流感病毒稀釋成2個LD50/0.05ml，置冰水浴中備用。感染小鼠選健康小鼠，隨機分為7組，每組15只，于乙醚輕度麻醉下滴鼻感染(小鼠用乙醚麻醉，使其頭部仰起，用注射針頭插入鼻腔，緩慢滴入流感病毒接種物)，用0.25ml注射器每只小鼠接種50ul。
藥物防治于病毒感染前一天開始灌胃給藥，每天兩次，共給藥3天。連續觀察14天。逐日記錄動物發病癥狀和死亡數。設病毒、藥物、陽性藥和正常對照組等。
灌胃，0.2ml/10g體重。
1.空白對照蒸餾水。
2.陽性藥對照。感冒軟膠囊。北京同仁堂制藥廠生產，批號8170098。本品由羌活、麻黃、荊芥穗、川芎、薄荷等藥物組成，具有散風解熱的作用，用于外感風寒引起的頭痛身熱、鼻塞流涕、惡寒無汗、骨節酸痛、咽喉腫痛等癥，450mg/粒。zz-3242-京衛藥準字(1993)第004008號。
病毒唑。50mg/片。批號010414。蘇中制藥廠生產。抗病毒藥。結果表3-1實施例2提取物對流感病毒感染小鼠存活率的影響(x±s)

x2檢驗，與病毒對照組相比，*P＜0.05。
對流感病毒的抑制試驗每mL20-30萬個細胞接種于96孔板中，每孔0.1mL，37℃ 2.5％CO2培養24小時，棄培養液，加入適量病毒，37℃ 2.5％CO2吸附2.5-3小時，棄病毒液，加入列毒濃度的藥液，作2倍系列稀釋，8個稀釋度分別為5，2.5，1.25，0.625，0.3125，0.15625，0.079，0.039mg/mL.每濃度2個孔，37℃ 2.5％CO2培養48小時，觀察細胞病變，完全破壞為4；75％破壞為3；50％破壞為2，25％破壞為1；無病變為0。計算每濃度藥液平均細胞病變程度。共進行兩批實驗，設細胞對照，病毒對照，陽性藥病毒唑對照.
藥物效果計算計算藥物半數有效濃度(IC50)及治療指數(TI).
IC50＝Antilog[(A+(50-A)/(B-A))×C]A＝Log＜50％藥物濃度。B＝Log＞50％藥物濃度。C＝Log稀釋倍數。
TI＝TD50/IC504VER細胞培養液及實驗方法同MDCK細胞.
結果實施例2提取物對MDCK細胞的毒性二批實驗濃度為2，1，0.5，0.25，0.125，0.0625，0.03125，0.015625mg/mL，顯微鏡觀察細胞病變，二批實驗結果表明實施例2提取物對MDCK細胞半數有毒濃度TD50為0.188±0mg/mL。
表3-2實施例2提取物體外抗流感病毒甲型及乙型細胞的IC50(x±s)

注兩批實驗用藥物為同一批號。
結論1小鼠抗病毒試驗結果表明，實施例2提取物具有一定抗病毒作用。可以改善感染小鼠的生命質量，延長生存時間，降低死亡率。三劑量死亡抑制率分別為57.13％，42.87％和28.51％。大中劑量的差異與病毒對照組相比有統計學意義(P＜0.05)。陽性藥病毒唑表現出明顯的抑制作用，其抑制率為64.31％。感冒軟膠囊為42.87％，效果同實施例2提取物中劑量組。
2實施例2提取物對MDCK細胞的半數有毒濃度為0.188±0mg/mL，對VERO細胞的TD50為0.156±0mg/mL.實施例2提取物抑制流感甲型病毒IC50為0.055±0.011mg/mL，治療指數為3.4，對流感病毒乙型IC50為0.048±0.0014mg/mL，治療指數為3.9.實施例2提取物最大無毒濃度0.078mg/mL對COXB3病毒無抑制作用.
實施例5
實施例2提取物的體內外抗菌作用(一)對小鼠感染金葡菌的對抗作用材料與方法[受試藥物]實施例2提取物。批號及來源同前。用時以蒸餾水溶解藥物至所需濃度。
KM小鼠，非近交系封閉群，雌雄各半。體重18.77±0.67g。由中國預防醫學科學院微生物流行病研究所提供。合格證號96-36號。每組20只。
金黃色葡萄球菌ATCC25923。由中國醫學科學院醫藥生物技術所藥理室提供。牛肉湯粉。購自中國藥品生物制品檢定所，批號001224。
1.稀釋菌液。用金黃色葡萄球菌的肉湯過夜培養物作系列稀釋(10-1，10-2，10-3......)，取每稀釋液0.05ml腹腔注射于小鼠，引起小鼠全部死亡的最低細菌量(稀釋度)為最小致死量(MLD)，選取引起80-90％小鼠死亡的的細菌液備用。
2.感染小鼠。選健康小鼠，隨機分為6組，每組20只，腹腔注射經預試實驗測得LD80-90稀釋度的金黃色葡萄球菌液感染各組小鼠，每鼠注射0.5ml。
3.藥物防治于感染接種前1h，感染接種后6h，24h各給藥一次，每次0.5ml。設細菌、藥物、陽性藥和正常對照組等，連續觀察10天，逐日記錄動物發病癥狀和死亡數。
4.數據處理死亡率＝每組死亡數/每組數×100％死亡抑制率(％)＝(細菌對照組死亡率-實驗組死亡率)/細菌對照組死亡率×100％[給藥途徑與體積]灌胃，0.5ml/只。

1.空白對照蒸餾水。
2.陽性藥對照感冒軟膠囊，北京同仁堂制藥廠生產，批號8170098。本品由羌活、麻黃、荊芥穗、川芎、薄荷等藥物組成，具有散風解熱的作用，用于外感風寒引起的頭痛身熱、鼻塞流涕、惡寒無汗、骨節酸痛、咽喉腫痛等癥，450mg/粒.zz-3242-京衛藥準字(1993)第004008號。
結果表4-1對小鼠抗菌作用的影響(x±s)

x2檢驗，與細菌對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
二體外抗菌作用材料與方法[藥物]實施例2提取物和對照藥感冒軟膠囊，均同上。
MH瓊脂培養基由中國藥品生物制品檢定所購進。MH肉湯培養基和腦心浸液培養基為美國DIFCO公司產品。
試驗菌株為25株實驗室保存標準菌株和近兩年北京地區醫院臨床分離菌，質控菌選用金黃色葡萄球菌ATCC29213、大腸桿菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853。
最低抑菌濃度(MIC)測定。采用平皿稀釋法和DENLAY多點接種進行藥敏實驗，試驗菌用營養肉湯及腦心浸液增菌；藥物加少量乙醇助溶后用MH肉湯二倍稀釋成各種所需濃度，分別加適量到平皿中，MH瓊脂培養基溶化后定量注入含藥液平皿內混勻，藥物的終濃度分別為0.1，0.2，0.4......50mg/mL。肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌和糞腸球菌的培養基內含5％脫纖維的羊血，平皿中培養基凝固后用多點接種器接種試驗菌(105cfu/點)，置35℃恒溫培養18小時(肺炎球菌、化膿鏈球菌和糞腸球菌置5％CO2培養箱培養24小時)后觀察結果，無菌生長的平皿中所含藥物最小的濃度即為最低抑菌濃度(MIC)。
結果表4-2實施例2提取物的抗菌譜測定


結論1實施例2提取物對革蘭氏陽性菌中金葡菌、表葡菌、化膿鏈球菌和肺炎鏈球菌均有一定抗菌活性。其中對化膿性鏈球菌和肺炎鏈球菌的抗菌活性較強，MIC分別為0.8和1.56mg/mL，但對糞腸球菌的抗菌活性較弱，MIC≥50mg/mL；實施例2提取物對革蘭氏陰性菌中銅綠假單胞菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、摩根變形桿菌、雷極變形桿菌、陰溝腸桿菌、醋酸鈣不動桿菌、粘質沙雷氏菌、弗勞地枸櫞酸桿菌和流感嗜血桿菌均有一定抗菌活性，其中對摩根變形桿菌和流感嗜血桿菌的抗菌活性較強，MIC分別為3.125和6.25-12.5mg/mL對產氣腸桿菌和肺炎克雷白桿菌的MIC均≥50mg/mL。
2以體外有明顯抑菌作用的菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923做小鼠體內接種，結果表明，實施例2提取物具有明顯抑制感染小鼠死亡率的作用。三劑量由大到小死亡抑制率分別為76.47％，58.82％和41.18％。感冒軟膠囊在體外實驗中效果不明顯，但在體內實驗中表現出一定的活性，其對感染小鼠死亡抑制率為52.94％。
實施例6實施例2提取物對化學刺激所致疼痛及炎癥腫脹的抑制作用。
觀察實施例2提取物對醋酸所致小鼠疼痛的抑制作用。對巴豆油所致小鼠耳腫脹的抑制作用。
材料與方法[受試藥物]實施例2提取物。批號及來源同前。用時以蒸餾水溶解藥物至所需濃度。
雄性KM小鼠，非近交系封閉群。體重19.68±1.27g(醋酸扭體)。19.23±0.78g(巴豆油致炎)。由中國預防醫學科學院微生物流行病研究所提供。合格證號96-036號。每組12只。
冰醋酸。分析純。北京化學試劑廠。批號001116。巴豆油。由中國醫學科學院藥用植物研究所植化室提供。
AR1520/B電子天平(精密度0.0001g)。美國OHAUS有限公司。電子秒表，上海儀表廠生產。
1對醋酸所致小鼠扭體試驗將小隨機分為6組，每組12只，連續給藥3天，于第3天給藥后1小時，每只鼠腹腔注射(IP)0.6％冰醋酸生理鹽水(0.1mL/10g體重)。計算注射后15分鐘內小鼠扭體次數和扭體潛伏期。
2對巴豆油所致小鼠耳腫脹的抑制作用將小隨機分為6組，每組12只，連續給藥3天，于第3天給藥后即時給小鼠左耳部涂以2％巴豆油(V/V)(20％無水乙醇和78％乙醚配制)。4小時后處死小鼠，取左右耳，并用Φ9mm打孔器分別取左右耳組強。測重量。計算耳腫脹率[＝(左耳重量-右耳重量)/右耳重量×100％]。腫脹抑制率[＝(對照組腫脹率-給藥組腫脹率)/對照組腫脹率×100％]。該試驗為自身對照，右耳為空白對照，左耳涂巴豆油。
灌胃，0.2mL/10g體重。
1.空白對照蒸餾水。
2.陽性藥對照感冒軟膠囊。北京同仁堂制藥廠生產，批號8170098。本品由羌活、麻黃、荊芥穗、川芎、薄荷等藥物組成，具有散風解熱的作用，用于外感風寒引起的頭痛身熱、鼻塞流涕、惡寒無汗、骨節酸痛、咽喉腫痛等癥，450mg/粒。zz-3242-京衛藥準字(1993)第004008號。
阿斯匹林。0.3g/片。具有解熱鎮痛的作用。批號001208。北京市曙光制藥廠生產。
試驗數據以EXCEL軟件處理。組間t檢驗。以P＜0.05，P＜0.01為顯著性檢驗水平。
結果表5-1不同藥物對小鼠醋酸扭體的影響(x±s)

與對照組相比，*P＜0.05，*P＜0.01。n＝12
表5-2不同藥物對小鼠耳腫脹的影響(x±s)

與對照組相比，*P＜0.05，*P＜0.01。
討論與結論1實施例2提取物能夠明顯抑制醋酸引起的小鼠疼痛的扭體反應，延長反應的潛伏期。大中小三劑量扭體抑制率分別為43.05％、46.67％和48.17％。無明顯量效關系。陽性藥阿斯匹林和感冒軟膠囊具有同樣的效應，其扭體抑制率分別為37.49％和36.04％。
2實施例2提取物三劑量對巴豆油所致小鼠耳腫脹有明顯的抑制作用，大中小三劑量腫脹抑制率分別為41.99％34.46％和37.79％。陽性藥阿斯匹林也有明顯的抑制作用，其腫脹抑制率為30.86％。感冒軟膠囊有抑制趨勢，但無統計學意義，其腫脹抑制率為14.25％。
3結果表明，實施例2提取物對化學刺激所致疼痛及炎癥腫脹均具有明顯的抑制作用。
實施例7對小鼠對免疫功能的影響 觀察實施例2提取物對小鼠碳粒廓清功能的影響。對小鼠脾臟T細胞轉化能力的影響。
材料與方法[受試藥物]實施例2提取物。批號及來源同前。用時以蒸餾水溶解藥物至所需濃度。
雄性昆明種小鼠，非近交系封閉群。體重20.48±1.07g(碳粒廓清)，每組10只。。雌性昆明種小鼠19.66±0.78g(淋轉)，每組3只。。由中國預防醫學科學院微生物流行病研究所提供。合格證號96-036號。[試劑]印度墨汁。北京化工廠生產。批號991008。用時以生理鹽水稀釋(1∶4，V/V)。人參皂苷，含量92％。由北京醫科大學天然與仿生藥物國家重點實驗室植化組提供。MTT(四氮唑蘭)，購自Sigma公司。RPMI1640培養基，購自Gibco公司，新生牛血清，購自浙江省金華清湖牛利用研究所(批號001018)。巰基乙醇，分析純，北京化工廠生產。[實驗儀器]BIO-RAD 550型酶標儀。日本BIO-RAD公司。MCO-15AC CO2培養箱。日本SANYO公司。150-C潔凈工作臺。北京半導體設備一廠。CK-40倒置顯微鏡。日本OLMPUS公司。CK-30生物顯微鏡。日本OLMPUS公司。800型離心機，上海市手術器械廠生產。96孔培養板，美國CASTER公司產品。
1對小鼠碳粒廓能功能的影響[2]將小隨機分為6組，每組10只，連續給藥3天，于第3天給藥后1小時，每只鼠尾靜脈注射生理鹽水配制的印度墨汁。0.1mL/10g體重。分別于注射后0分和6分鐘眶上靜脈叢采血，每次采血25uL。采血后即刻加入2mL0.1％Na2CO3溶液中混勻。于675nm處測試吸光度(A675nm)。取小鼠肝、脾臟稱重。計算k值[＝(logA1-logA2)/(t2-t1)]，碳粒廓清α值[＝(3√k×體重g)/(肝重g+脾重g)]。A10分鐘時吸光度。A26分鐘時吸光度。
2對小鼠脾臟T細胞增殖能力的影響將小隨機分為6組，每組3只，連續給藥7天，于第7天給藥后1小時，脫頸處死，即刻浸泡于75％乙醇中滅菌3分鐘。取出后無菌條件下取脾臟，依文獻[10-11]制備脾臟淋巴細胞，經1640液洗2遍后，用含20％新生牛血清的RPMI1640液調整細胞濃度至5×106個/mL，分別加入96孔板中，每孔100uL。在加入細胞之前，須先加入20mg/mLConA，每孔20uL.對照孔加入等體積的1640液。將培養板放入5％CO2培養箱中37℃54小時。54小時后取出每孔加入10mg/mLMTT液20uL，繼續培養4小時，之后吸取上清，加入巰基乙醇，每孔200uL，在酶標儀570nm處測吸光值。計算T細胞增殖百分率[＝(A加入ConA-A未加ConA)/A未加ConA×100％][劑量設置][給藥途徑與體積]灌胃，0.2mL/10g體重。
1.空白對照蒸餾水。
2.陽性藥對照感冒軟膠囊。北京同仁堂制藥廠生產，批號8170098。本品由羌活、麻黃、荊芥穗、川芎、薄荷等藥物組成，具有散風解熱的作用，用于外感風寒引起的頭痛身熱、鼻塞流涕、惡寒無汗、骨節酸痛、咽喉腫痛等癥，450mg/粒。zz-3242-京衛藥準字(1993)第004008號。
試驗數據以EXCEL軟件處理。組間t檢驗。以P＜0.05，P＜0.01為顯著性檢驗水平。
結果表6-1不同藥物對小鼠碳粒廓清能力的影響(x±s)

與對照組相比，*P＜0.05，*P＜0.01。n＝10表6-2不同藥物對小鼠脾臟T淋巴細胞增殖能力的影響(x±s)

與對照組相比，#P＝0.0688，##P＝0.063。n＝3與對照組相比，*P＜0.05。
討論與結論1實施例2提取物能夠明顯增強小鼠外周淋巴細胞的吞噬能力，三劑量組均有明顯作用，與對照組相比差異有顯著性，但無明顯量效關系。感冒軟膠囊也具有明顯的作用。人參皂苷未表現出明顯的作用。其原因尚待進一步研究。
2實施例2提取物三劑量對小鼠脾T細胞增殖能力有一定的促進作用。其增殖率分別為對(46.99±22.83)％，(32.25±16.17)％和(20.39±22.45)％。對照組為(10.50±9.53)％。人參皂苷增殖率為(47.17±23.86)％。明顯高于對照組。但由于對照組標準差過大，故無統計學意義，其P值分別為0.0688(人參皂苷)和0.063(實施例2提取物大劑量)。感冒軟膠囊無明顯作用。
3綜上表明，實施例2提取物對正常小鼠特異性和非特異性免疫功能均有一定的促進作用。其中對非特異性免疫功能作用更加明顯。
權利要求
1.組合物，其包括來自植物的羌活、獨活、葛根、黃芩和黃連。
2.提取物，其特征在于該提取物是來自植物的羌活、獨活、葛根、黃芩和黃連混合物的C1-4烷基醇提取物。
3.藥物制劑，所述制劑包括權利要求2的提取物。
4.藥物制劑，其中所述制劑為片劑、膠囊、口服液、懸浮液或注射液。
5.權利要求3或4的制劑，其中所述制劑的單位劑型中含0.1-0.8g權利要求2的提取物。
6.權利要求2的提取物，其中所述提取物含不得低于6.5％的總香豆素。
7.權利要求2的提取物，其中所述提取物含不得低于24.3％的總黃酮。
8.權利要求2的提取物，其中所述提取物含不得低于19.2％的總生物堿。
9.權利要求2提取物的制備方法，其包括a.用含水C1-4烷基醇提取羌活、獨活、葛根、黃芩和黃連的混合物；b.過濾a)中提取液，減壓濃縮濾液至浸膏，其相對密度為1.15-1.20；c.將b)中浸膏與水攪拌，室溫靜置，抽濾；d.干躁c)中抽濾后的沉淀物。
10.權利要求1的組合物或權利要求2的提取物在制備用于預防或治療發燒、由病毒引起的感冒，炎癥或與免疫功能有關癥狀或疾病的藥物中的用途。
全文摘要
本發明涉及包括羌活，獨活，黃芩，黃連和葛根的組合物，其提取物，其制備方法及上述組合物或其提取物的藥物用途，尤其是在鎮痛解熱，由病毒尤其是流感病毒引起的感冒，抗炎及增強免疫功能方面的用途。
文檔編號A61P37/00GK1907350SQ20051008900
公開日2007年2月7日 申請日期2005年8月2日 優先權日2005年8月2日
發明者杜力軍, 鐘睒睒 申請人:養生堂有限公司