專利名稱：假絲酵母對三七的生物轉化方法
技術領域：
本發明涉及酵母菌對中藥三七之主要成分三七皂苷的生物轉化方法，具體地說，本發明涉及利用假絲酵母，特別是利用朗比可假絲酵母對三七皂苷的生物學轉化方法。經過酵母菌的轉化后，三七總皂苷的含量，特別是人參皂苷Rg3、Rh2等稀有人參皂苷的含量得以顯著增加。經過朗比可假絲酵母轉化的三七皂苷可作為原料，用于醫藥、保健品或者化妝品的生產。
背景技術：
三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)為五加科植物，以其干燥的根入藥。三七又稱為山膝、田三七、血參、人參三七。三七用于治療疾病已有悠久的歷史，是我國傳統的中藥。三七中皂苷成分是三七主要的生理活性成分。迄今為止，已從三七的不同部位分離得到60余種單體皂苷成分，這些單體皂苷成分大多數為達瑪烷型的20 (S)-原人參二醇型[20 (S) -protopanaxadiol]和 20- (S)原人參三醇型[20 (S)-peotopanaxatriol]。三七根中主要有效成分是達瑪烷型人參皂苷RbpRgpRcURe和三七特有三七皂苷R1,以及少量的稀有人參皂苷Rg2、Rhlt)其中人參皂苷Rb1和Rg1在天然植物中含量較高，而稀有人參皂苷Rg3、Rh2等含量甚微。現代化學和藥理學研究發現，三七總阜苷(Panaxnotoginoside, PNS)在耐缺氧、抗衰老、提高機體免疫力等方面的藥理作用顯著優于人參總皂苷，且PNS和部分單體皂苷在血液系統、心腦血管系統、神經系統、物質代謝以及抗炎、抗腫瘤等方面均有較好活性。三七皂苷可通過直接殺傷腫瘤細胞、抑制腫瘤細胞生長或轉移、誘導腫瘤細胞凋亡或誘導腫瘤細胞分化使其逆轉、增強和刺激機體免疫功能等多種方式起到抗腫瘤的作用。三七皂苷包括人參皂苷Rbp Rg1等多種活性單體，具有營養局部皮膚、血管和毛囊組織等功能。有研究發現，人參皂苷Rg1具有明顯的抗氧化、抗衰老功能。已有報道，三七皂苷能促進皮膚膠原蛋白合成，具有明顯的抗皮膚衰老作用(王麗紅，吳鐵，吳志華，等.人參皂苷抗皮膚衰老作用實驗研究[J].廣東藥學院學報，2003，19 (I):25-27.)。某些在三七中含量極低的三七皂苷被稱為次級人參皂苷或稀有人參皂苷。天然的皂苷并不一定是生理活性最高的分子結構，藥理學研究表明，稀有人參皂苷(如Rh、Rh2, Rg3等)藥效尤為珍貴(李學哲，樸惠順.人參皂苷Rh2含量測定方法及藥理作用研究現狀.延邊大學醫學學報,2009,32(2):153-156.；ffang CZ, Xie JT, Fishbein A, etal.Antiproliferative effects of different plant parts of Panax notoginseng onSW480human colorectal cancer cells.Phytother Res，2009，23 (I) 6-13)。這些成分在某些難治性疾病如腫瘤治療方面顯示獨特的療效。對皂苷活性的研究還發現，人參皂苷的抗腫瘤活性與皂苷糖鏈結構的關系為:苷元>單糖苷>二糖苷>三糖苷>四糖苷(Don DQ，Jin L，Chen YJ.Advances and prospects of the study on chemical constituents andpharmacological activities of panax ginseng.J Shenyang Pharm Univ，1999，16 (2):151-156;竇德強，靳玲，陳英杰.人參的化學成分及藥理活性的研究進展與展望.沈陽藥科大學學報，1999，16 (2):151-156)。稀有人參皂苷1^3是從紅參(栽培人參經曬干或烘干再蒸制而成)中微量提取的，其提取率僅為0.003%，人參皂苷Rg3可直接作用于癌細胞，誘導其凋亡，抑制腫瘤的生長或誘導其分化使其逆轉。(余新建，20 (R)-人參皂苷Rg3抗腫瘤活性研究近況，世界中西醫結合雜志2007年增刊，2007，235-236)。以人參皂苷Rg3為主要成分的抗癌新藥參一膠囊已獲國家食品藥品監督管理局頒發的中藥一類新藥證書。人參皂苷Rh 2屬微量成分，僅占人參總皂苷含量的萬分之二。人參皂苷Rh 2是一種抗腫瘤天然植物成分，也可由人參皂苷Rg3降解得到。對小鼠的肺癌細胞、B16黑色素瘤細胞、大鼠Morris肝癌細胞的增殖具有明顯的特異性抑瘤作用，是配合放療、化療增效減毒的首選藥物(陳業高，黃榮，桂世鴻，等，三七葉苷制備抗癌活性成分20 (R)-人參皂苷-Rh2和人參皂苷Rg 3，化學研究與應用，2004，16 (I):69-70 ;蔣磊，趙壽經，梁彥龍，李軍華，HPLC法測定酶轉化生產人參皂苷Rh 2的含量，特產研究，2004，I，41-44)。由于次級人參皂苷含量極低，故很難通過傳統的提取方法得到。但如果對天然皂苷的結構進行定向的改變，就會得到生理活性更高、應用價值更大稀有皂苷。通常是先從三七提取含量豐富的人參皂苷，然后再將提取得到的人參皂苷降解，由此獲得稀有的次級人參皂苷。人參皂苷的降解就是將人參皂苷分子上的部分或全部糖基水解，得到含糖基較少的次級人參皂苷或皂苷元。常規使用的人參皂苷降解方法包括酸降解法、堿降解法和酶降解法等。本發明提供了一種用于將三七中人參皂苷轉化為次級人參皂苷或者稀有人參皂苷的微生物學轉化技術，利用本發明的方法可以有效地改變皂苷的糖鏈結構，獲得較大量的稀有人參皂苷，因此本發明的方法具有重要科研意義和產業上的巨大價值。

發明內容
本發明涉及利用酵母菌對`中藥三七之主要成分人參皂苷的生物轉化，特別涉及利用朗比可假絲酵母對三七中人參皂苷的生物學轉化方法。經過酵母菌的轉化后，三七總皂苷的含量，特別是人參皂苷Rg3等稀有人參皂苷的含量得以顯著增加。三七皂苷各種單體的分離純化和藥理活性的研究發現，許多稀有皂苷、特別是許多天然來源有限的人參皂苷，例如人參皂苷Rg3等稀有人參皂苷生理活性更高、應用價值更大，具有很好的開發前景。對多種稀有皂苷獲得方法的比較研究可以發現，微生物轉化方法獲得的稀有皂苷具有很多特有的優點。本發明的目的是利用酵母菌對中藥三七中的人參皂苷的生物學轉化，以獲得具有更高活性的稀有皂苷。其中所說的酵母菌是假絲酵母，特別是朗比可假絲酵母(AS2.1763，Candida lambica,購自中國普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC,中國北京)。一般說來，制備酵母菌轉化三七中人參皂苷的轉化物，通常采用粉碎技術將三七粉碎，過100目網篩，可使三七的轉化濃度為轉化總體積的2.5% 7.5% (重量/體積)。可以在已經粉碎的三七粉0100目)中加入適量飲用水，浸泡I 3小時后，然后于大約115 121°C滅菌40分鐘，即得到繼后用于酵母菌轉化三七的底物。當按上述方法制備的用于酵母菌轉化的三七底物滅菌后，溫度降至30°C左右時，接種預培養的朗比可假絲酵母菌液(占轉化總體積的20% 50%，體積/體積)，于大約25°C 35°C培養2 6天。三七加入朗比可假絲酵母轉化的溫度一般是25°C 35°C，搖床培養或者發酵罐
好氧培養。為了篩選出朗比可假絲酵母對三七中人參皂苷的最佳轉化條件，我們利用正交試驗(三因素三水平)方法，采用薄層色譜法(中國藥典2010版一部附錄VIB)以稀有人參皂苷Rg3峰面積為指標，結果顯示，三七濃度為轉化總體積的5% (重量/體積)接種量占轉化總體積的50% (體積/體積)、培養轉化時間為96小時條件下，假絲酵母轉化三七皂苷的稀有人參皂苷Rg3含量最高。朗比可假絲 酵母對三七中人參皂苷的轉化正交試驗的薄層色譜圖參見附圖1。利用分光光度法(保健食品檢驗與評價技術規范:保健食品中總皂苷的測定)檢測了朗比可假絲酵母轉化前后三七總皂苷的變化，其含量提高了 66.10%。假絲酵母轉化前后三七總皂苷的變化薄層色譜圖參見附圖2。我們的實驗研究表明，經過利用本發明的方法生物轉化的三七，明顯地增加了三七總皂苷的含量，特別是人參皂苷Rg3等稀有人參皂苷的含量。經過生物轉化的三七可作為原料，用于醫藥、保健品或者化妝品的生產。某些在三七中含量極低的人參皂苷即次級人參皂苷或稀有人參皂苷，具有很強的藥理活性。例如稀有人參皂苷Rg3可直接作用于癌細胞，誘導其凋亡，抑制腫瘤的生長或誘導其分化使其逆轉。人參皂苷Rg3還具有抑制腫瘤細胞增殖、抑制血管內皮細胞增殖和免疫調節作用(余新建，20 (R)-人參皂苷Rg3抗腫瘤活性研究近況，世界中西醫結合雜志2007年增刊，2007，235-236)。本發明的意義在于為中藥三七的轉化提供了一種新的、簡便易行的微生物學方法，和用于轉化的無害微生物。從而，為中藥三七在更廣泛的領域內更有效地利用提供了前提條件。


附圖1是實施例1的色譜圖。顯示中藥三七在使用朗比可假絲酵母生物轉化正交試驗的結果。從圖中可以看出，三七經過朗比可假絲酵母的轉化后，稀有皂苷斑點明顯增力口。其中上面的圖是日光下的觀察結果；下面的圖是365nm熒光下觀察結果。圖中O為發酵(轉化)前的樣品；1 9為發酵(轉化)后的樣品；S為RbpRejgpRg^Rh2對照樣品。展開劑為氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(15: 40: 22: 10)。附圖2是實施例2的色譜圖。顯示中藥三七在使用朗比可假絲酵母生物轉化(加朗比可假絲酵母發酵)前和后，三七皂苷薄層色譜圖的變化。色譜圖顯示，三七中的稀有皂苷斑點明顯增加。其中左邊的圖是日光下的觀察結果；右邊的圖是365nm熒光下觀察結果。圖中O為發酵(轉化)前的樣品；1為發酵(轉化)后的樣品JSRbpRhRgpRg^Rhji照樣品。展開劑為氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(15: 40: 22: 10)。
具體實施例方式實施例1:三七轉化濃度、轉化時間、接種量轉化條件對轉化效果的影響利用正交試驗，設計了三個因素包括發酵轉化時間、三七的轉化濃度和朗比可假絲酵母的接種量，每個因素取三個水平(具體參見表I)。取干燥的三七，粉碎后，過100目篩，根據正交試驗的設計組合的9個樣品，稱量如表I所示不同重量的三七粉。各樣品加適量飲用水浸泡3小時后，115°C、40分鐘滅菌。得到不同濃度的三七轉化底物，當溫度降至30°C左右時，按照表I中的接種量，接入預培養的朗比可假絲酵母菌液，30°C搖床培養，轉速IOrpm。不同轉化時間、不同的三七轉化濃度和不同朗比可假絲酵母接種量的各實驗樣品稀有人參皂苷Rg3峰面積的數值參見表2。表I轉化因素水平表
權利要求
1.利用假絲酵母對三七皂苷的進行生物學轉化，以獲得具有更高含量次級或稀有人參皂苷。
2.根據權利要求1的方法，該方法包括首先將三七粉碎，過100目網篩后，在已經粉碎的三七粉中加入適量的飲用水，浸泡I 3小時后，然后于大約115°C 121°C滅菌40分鐘，即得到用于假絲酵母菌轉化三七的底物，當三七底物的溫度降至30°C左右時，接種預培養的假絲酵母菌轉化三七中人參皂苷，于25V 35°C下培養2 6天，以完成三七人參皂苷的生物學轉化。
3.根據權利要求2的方法，其中所說的假絲酵母是朗比可假絲酵母菌。
4.根據權利要求2的方法，其中所說的發酵培養是搖床培養或者發酵罐好氧培養。
5.根據權利要求1或2的方法，其中所說的被轉化的三七中稀有人參皂苷可用于生產醫藥、保健品和化妝品的 原料。
全文摘要
本發明涉及酵母菌對中藥三七之主要成分三七皂苷的生物轉化方法，具體地說，本發明涉及利用假絲酵母，特別是利用朗比可假絲酵母對三七皂苷的生物學轉化方法。經過酵母菌的轉化后，三七總皂苷的含量，特別是人參皂苷Rg3、Rh2等稀有人參皂苷的含量得以顯著增加。經過朗比可假絲酵母轉化的三七皂苷可作為原料，用于醫藥、保健品或者化妝品的生產。
文檔編號A61P25/00GK103099832SQ20111035293
公開日2013年5月15日 申請日期2011年11月10日 優先權日2011年11月10日
發明者馮淑琴, 馮淑霞, 馮淑青 申請人:馮淑琴, 馮淑霞, 馮淑青