專利名稱：一種增強愛德華氏菌疫苗免疫接種效果的佐劑及使用方法
技術領域：
本發明涉及愛德華氏菌疫苗免疫防治技術，具體是一種可以增強愛德華氏菌疫苗免疫接種效果的佐劑及其應用方法。
背景技術：
愛德華氏菌(Edwardsiella sp.)，是當前水產養殖中的主要病原菌之一，目前包含遲緩愛德華氏菌(E. tarda)、鮰魚愛德華氏菌(E.1ctaluri)和保科愛德華氏菌(E.hoshinae)三個種，其宿主范圍十分廣泛，魚類、兩棲類、爬行類、鳥類以及包括人類的哺乳類都有感染報道，且呈世界性分布，普遍存在于淡水和海水環境中，主要分布在中國、澳大 利亞、日本、印度、以色列、馬來群島、美國、巴拿馬等熱帶和亞熱帶國家和地區。從1962年首次報道至今，該病原對多種魚類養殖業造成了巨大損失。采用抗生素和化學藥物等方法進行預防或治療，往往帶來諸如病原的耐藥性、藥物殘留以及水環境的污染等弊端，也引起了食品安全及環境污染等相關問題。當前在水生動物疾病防控方面，以疫苗免疫技術為基礎的綜合防控技術體系是被國際上普遍認可、接受并積極推廣的病害控制技術，具有良好的開發應用前景。目前，國內處對愛德華氏菌疫苗有了較為廣泛的研究，并取得了一系列的研究成果。其中傳統疫苗(包括滅活疫苗、細胞提取物、佐劑疫苗)因具有制作簡單，成本低、安全性高等優點成為各種疫苗形式的首選，但研究表明，愛德華氏菌與其他病原菌不同，常規滅活疫苗所產生的免疫保護效果不盡理想。Gutierrez和Miyazaki (1994)研究中福爾馬林滅活的愛德華氏菌注射免疫日本鰻的相對保護率(RPS)僅為12. 5—25% ;Sun等(2011)報道用愛德華氏菌的單價滅活疫苗免疫牙鲆(Paralichthys olivaceus)的RPS只有33. 3% ;我們前期實驗采用常規技術制作的E. tarda滅活疫苗的相對保護率(RPS)也不到40%。近期,Hossain和Kawai (2009)和Hossain等(2011)報道了米用高壓滅活(600psi,5min)的方式制備的愛德華氏菌滅活疫苗具有較好的免疫效果，腹腔注射日本鰻(Anguillajaponica)后，其RPS在80% — 85%范圍內。但高壓的方法存在技術局限性，例如設備代價非常高，技術難度大，難以對大批量細菌進行生產性的操作。近年來，隨著生物工程技術的迅猛發展，愛德華氏菌新型疫苗不斷涌現，并在水生動物實驗中顯示出良好的應用前景，例如DNA疫苗(Jiao等(2009)、亞單位疫苗(Liu等(2005)，Jiao等(2009)、菌蛻疫苗(Kwon等(2007)、減毒活疫苗(Mo等，2007 ；Xiao等，2011)等也有較多報道，，但出于應用安全性、研制周期及成本等因素考慮，這些新型疫苗仍然得不到商品化的應用。總體來說，愛德華氏菌疫苗的免疫效果不盡理想，近年來，人們已開始重視佐劑在其免疫技術中的應用，并取得了一定的成果。佐劑是非特異性免疫增強劑，與抗原混合使用可以增強機體免疫應答或改變免疫應答類型。Castro等(2008)研究結果用滅活愛德華氏菌疫苗與商業佐劑MontanideISA 763 AVG (Seppic, France)聯合使用，I次注射接種免疫大菱鲆，其RPS在6個月后仍然超過90%，而此時單一注射免疫滅活組的RPS只有20% ;上述的Sun等(2011)的報道中，當滅活的愛德華氏菌與鰻弧菌(Vibrio anguillarum)等另三種菌聯合使用時,其RPS可達到70. 9%，該結果中鰻弧菌等其他三種菌滅活疫苗起到了愛德華氏菌滅活疫苗免疫佐劑的作用。目前在水產養殖中疫苗佐劑種類較少，且應用效果各有差異，其中應用于愛德華氏菌疫苗的佐劑報道甚少，因此開發其新型高效佐劑對于該病原的免疫防控具有重要意義。￠-1, 3-葡聚糖是一種多糖，主要來源于包括谷物、酵母、部分真菌和海藻中。研究證實葡聚糖自身具有特殊的分子結構使其易被免疫系統識別及接受，可有效激活巨噬細胞、嗜中性白血球等，刺激釋放細胞因子及特異性抗體的生成，并誘導機體的體液與細胞免疫應答，提高機體的免疫功能。3 -葡聚糖還具有清除游離基、抗輻射、抗腫瘤、溶解膽固醇，預防高脂血癥作用，對濾過性病毒、真菌、細菌等引起的感染也具有一定的抵抗作用，目前在醫藥、食品、化妝品等行業已有著較廣泛應用。葡聚糖在水產養殖中的應用主要是作為非特異性免疫增強劑使用，例如常見添加到蝦飼料中用于提高對蝦的非特異性抗病力，也有作為魚類飼料添加劑用以非特異性地提高魚的抗病力，葡聚糖的添加具有增強水生動物對病原的抵抗力，促進生長，并可提高動物的生產性能及飼料利用率，但目前沒有將葡聚糖作為愛德華氏菌疫苗的佐劑的研究報道、專利或應用
發明內容
本發明的目的是提供一種增強愛德華氏菌疫苗免疫接種效果的佐劑及其應用方法，以提高愛德華氏菌疫苗抗原接種后的免疫效果。本發明所述的一種增強愛德華氏菌疫苗免疫接種效果的佐劑，為從谷物、酵母、真菌或海藻中獲得的葡聚糖提取物或含葡聚糖成分的制品；以及及具有增強免疫接種效果的，對上述的葡聚糖提取物或含葡聚糖成分的制品進行人工改造、合成的產物。上述葡聚糖提取物或含葡聚糖成分的制品的該制品的￠-1, 3-葡聚糖，或具有增強疫苗接種效果的3 -1, 3-葡聚糖的人工改造、合成產物。本發明的增強愛德華氏菌疫苗免疫接種效果的佐劑的使用方法，包括如下三種方式I)與疫苗抗原混合制成疫苗制劑使用；2)制成不包含疫苗抗原的佐劑制劑，在免疫接種前與疫苗抗原混合后同時使用；3)與疫苗抗原不同時使用。對于第I種方式，加入到包含疫苗抗原的針劑、浸浴劑或口服劑中，上述佐劑有效成分與疫苗抗原重量比為1/10—1000/1，其免疫接種途徑可以為注射免疫、創傷免疫、浸浴免疫、口服免疫或其他將佐劑有效成分和疫苗抗原導入到水生動物體內的任何免疫接種途徑。對于第2種方式，含有上述佐劑有效成分的制劑在疫苗抗原對水生動物進行免疫接種前臨時添加到含有疫苗抗原的制劑中并充分混勻，添加量為疫苗抗原重量的1/10—1000/1，其免疫接種方式可以為注射、創傷、浸浴或口服免疫。對于第3種方式，加入到水生動物飼料或浸浴水體中的上述佐劑的有效成分與飼料或浸浴水體重量比為1/100000—1/100，添加時間為疫苗制劑對待免疫水生動物進行注射、創傷、浸浴或口服免疫接種前3日至接種后30日以內，實施I一5日的投喂或浸浴等免疫增強操作。以上免疫應用方式使佐劑有效成分P -1, 3-葡聚糖在愛德華氏菌疫苗抗原與水生動物免疫系統作用時達到一定的濃度，從而讓免疫細胞在遞呈、加工、識別疫苗抗原的過程中受到葡聚糖的刺激，使免疫細胞的活性得以進一步提高，從而更好地活化免疫系統對疫苗抗原的應答，有效增強疫苗抗原的免疫效果。本發明發現佐劑有效成分的劑量對疫苗免疫效果有重要影響，在佐劑安全濃度范圍以內，兩者具有一定的相關性。當佐劑有效成分的使用劑量超過安全劑量范圍時，會對水生動物有致死作用，因此有必要針對待免疫水生動物種類及具體的免疫方式條件下進行佐劑的給藥方式測試或查明給藥后2— 4周內不會導致水生動物死亡的最高劑量，以此確定上述佐劑有效成分在水生動物中使用時的安全劑量。本發明證實上述佐劑的有效成分在水生動物體內的劑量達到安全劑量的1/100 — 4/5時可增強疫苗的免疫效果。本發明的愛德華氏菌疫苗佐劑可應用于魚類、兩棲類和爬行類的疫苗免疫接種，包括海水養殖魚類(如牙鲆、大菱鲆、半滑舌鰨、石斑魚、鱸魚、真鯛、軍曹魚、大西洋鮭、河飩等)、半咸水養殖魚類(如羅非魚、虹鱒、鯔魚等)、洄游魚類(如鰻鱺、小黃魚等)、淡水養殖魚類(如青魚、鰱魚、鳙魚、鯉魚、鯽魚、鯰魚、鱖魚、鱘魚、澳洲寶石鱸等)、觀賞魚(如金魚、錦鯉等)、兩棲類(如牛蛙、大鯢等)和爬行類(如鱉、龜、蛇等)的疫苗接種。不同的水生動物的安 全劑量和有效劑量不同，對于特定水生動物的具體應用劑量，應該進行單獨測試。本發明的積極效果在于所涉及佐劑可以提高愛德華氏菌疫苗抗原免疫接種后的特異性和非特異性免疫保護力。對于愛德華氏菌這種胞內感染或具有免疫逃避能力的病原的疫苗，本發明佐劑可有效的增強免疫保護作用，使用方法安全，對操作人員和環境無害，因而具有良好的應用前景和市場推廣價值。
具體實施例方式鑒于佐劑有效成分的劑量對疫苗抗原免疫效果有著重要影響，佐劑有效成分的使用劑量過低往往達不到增強免疫的效果，而過高的使用劑量往往會對水生動物產生不利或致死作用。因此上述佐劑在使用中應首先針對具體的水生動物種類、年齡和接種方法等通過疫苗保護實驗確定上述佐劑有效成分在具體疫苗產品中的安全劑量范圍及最佳使用濃度。在愛德華氏菌疫苗制劑中佐劑有效成分的濃度為lmg/g — 20mg/g(佐劑有效成分重量/疫苗制劑重量)，水生動物飼料中佐劑有效成分的濃度為0. lg/kg — 5g/kg(佐劑有效成分重量/飼料重量)，在給藥后水生動物體內佐劑有效成分的濃度達到1. OX 10_3mg/g — 5. Omg/g(佐劑有效成分重量/水生動物體重)。愛德華氏菌疫苗制劑中的抗原成分可以源自于遲緩愛德華氏菌、鮰愛德華氏菌或保科愛德華氏菌等愛德華氏菌屬的細菌的一種或一種以上的的病原的抗原或能在水生動物體內產生相應的抗原，也可以是包含源自愛德華氏菌的抗原和其他病原菌或病毒的抗原制成的聯合疫苗制劑。疫苗抗原的類型可以為滅活菌體、菌蛻成分、弱毒株、減毒株、保護性抗原、抗原亞單位、抗原決定簇或抗原基因的表達載體的任何一種或一種以上，上述抗原在疫苗制劑中可是單一種或一種以上以聯合、整合或多價方式存在，制成的愛德華氏菌疫苗制劑除了抗原或能產生抗原的表達載體以外，還可包含其它的佐劑、保護劑、防腐劑、稀釋齊U、溶劑等多種成分。本發明佐劑在應用中可以與疫苗抗原混合使用，也可以制成單一制劑與疫苗抗原混合后同時使用，還可以與疫苗抗原不同時使用。應用中的免疫接種方式可以為注射免疫、創傷免疫、浸泡免疫或口服免疫。
本發明證明酵母提取物中的￠-1, 3-葡聚糖能有效起到愛德華氏菌疫苗佐劑的作用，應用中與愛德華氏菌滅活疫苗協同使用時，能顯著提高愛德華氏菌滅活疫苗的免疫保護率。所述的￠-1, 3-葡聚糖是從谷物、酵母、真菌或海藻中提取的，本發明證實了^ -1, 3-葡聚糖具有增強愛德華氏菌疫苗免疫接種效果的功效，因此本發明的有效成分的功效包含3-1，3-葡聚糖的天然產物、人工改造產物或人工合成產物。天然的3-1，3-葡聚糖可提取自谷物、酵母、部分真菌和海藻等，對于不改變3 -1, 3-葡聚糖核心分子結構的人工改造產物或人工合成及仿制的產物可能增強或減弱本發明所涉及的功效，只要這種功效依然保留，就仍屬于本專利的保護范圍之內。本發明的使用方法如下(I)佐劑安全劑量的確定制備包含P -葡聚糖的0. 1%—10%的PBS (pH7. 2)溶 液，經0. 22 y m的濾膜過濾除菌，再用不同濃度的上述佐劑接種待免疫水生動物，接種方式可以是注射免疫、創傷免疫、浸泡免疫或口服免疫。免疫水生動物觀察2周，根據實驗結果來確定該佐劑安全劑量。(2)愛德華氏菌疫苗制劑制備及使用滅活疫苗制備中，向愛德華氏菌懸液中加入甲醛(36. 5—38%, w/v)，調節其終濃度為0. 3%—l%，4°C過夜，用PBS (pH7. 2)清洗3次后，制備一定濃度的滅活疫苗。將安全劑量范圍內的佐劑與滅活疫苗按一定的比例混合后對待免疫水生動物進行免疫接種，再將水生動物進行正常養殖管理即可。使用減毒活疫苗時，則無需進行滅活處理。(3)疫苗產品中佐劑最佳劑量的確定疫苗制劑的使用方法可以有以下三種方式1)與疫苗抗原混合制成疫苗制劑使用；或者2)制成單一制劑與疫苗抗原混合后同時使用；或者3)與疫苗抗原不同時使用。對于第I種方式，加入到包含愛德華氏菌疫苗抗原的針劑、浸浴劑或口服劑中上述佐劑有效成分與疫苗抗原重量比為1/10—1000/1，其免疫接種方式可以為注射、創傷、浸浴或口服免疫。對于第2種方式，上述佐劑有效成分在愛德華氏菌疫苗制劑對水生動物進行免疫接種前臨時添加并充分混勻，添加量為疫苗抗原重量的1/10—1000/1，其免疫接種方式可以為注射、創傷、浸浴或口服免疫。對于第3種方式，加入到水生動物飼料或浸浴水體中的上述佐劑的有效成分與飼料或浸浴水體重量比為1/100000—1/100，添加時間為愛德華氏菌疫苗制劑對待免疫水生動物進行注射、創傷、浸浴或口服免疫接種前3日至接種后15日以內，實施I一5日的投喂或浸浴等免疫增強操作。待免疫水生動物經上述疫苗制劑接種后，30— 60天后進行人工感染實驗，通過14—60天后的相關生理生化指標(如增重率、抗體效價等)及相對保護率(RPS)等免疫指標的分析，以確定佐劑的最佳使用劑量。實施例1:0-1，3-葡聚糖對大菱鲆(Scophthatmus maximus)注射安全劑量的確
定選用健康大菱鲆(11. 4±1. 8) g，試驗前在水泥池中暫養2周后，置于圓形玻璃鋼桶(盛水0. 7米3)中，流水養殖，水溫為18±2°C，鹽度28%。±2%。，24小時連續充氣。試驗期間按魚體重3%投喂配合飼料，日投喂3次，每日換水并清污2次。注射前對大菱鲆用MS222(I 9000 )進行浸泡麻醉處理。分別用濃度為2、5、8、10和20 mg/mL的P _1，3-葡聚糖腹腔注射20尾大菱鲆，注射劑量為100 u L/尾，觀察14天。各實驗組大菱鲆14天中死亡情況見表1，由結果確定P -1, 3-葡聚糖對大菱鲆的最大安全腹腔注射劑量為1000 u g/尾，即87. 7 u g/g (葡聚糖/魚體重)。表1. 0 -1, 3-葡聚糖對大菱鲆注射安全劑量試驗
權利要求
1.一種增強愛德華氏菌疫苗免疫接種效果的佐劑，其特征是上述佐劑為從谷物、酵母、真菌或海藻中獲得的葡聚糖提取物或含葡聚糖成分的制品；以及及具有增強免疫接種效果的，對上述的葡聚糖提取物或含葡聚糖成分的制品進行人工改造、合成的產物。
2.如權利要求1所述的增強愛德華氏菌疫苗免疫接種效果的佐劑，其特征在于所述葡聚糖提取物或含葡聚糖成分的制品的有效成分為β -1,3-葡聚糖。
3.如權利要求1所述的增強愛德華氏菌疫苗免疫接種效果的佐劑，其特征在于所述葡聚糖提取物或含葡聚糖成分的制品為β -1, 3-葡聚糖，或具有增強疫苗接種效果的β -1, 3-葡聚糖的人工改造、合成產物。
4.權利要求1所述的增強愛德華氏菌疫苗免疫接種效果的佐劑的應用，是與愛德華氏菌疫苗抗原聯用免疫接種水生動物。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于所述佐劑聯用免疫接種的疫苗抗原包含源自于遲緩愛德華氏菌、鮰愛德華氏菌或保科愛德華氏菌等愛德華氏菌屬的細菌的一種或一種以上的疫苗抗原；疫苗抗原類型包括滅活菌體、菌蛻成分、弱毒菌株、減毒菌株、保護性抗原、抗原亞單位、抗原決定簇或抗原基因表達載體的表達產物的任何一種或一種以上。
6.如權利要求4所述的應用，其特征在于所述佐劑與疫苗抗原聯用免疫接種水生動物的應用包含以下三種方式上述佐劑與疫苗抗原混合制成疫苗制劑使用，或者制成不含疫苗抗原的佐劑制劑但與疫苗抗原同時使用，或者與疫苗抗原不同時使用。
7.如權利要求4所述的應用，其特征在于所述佐劑的三種應用方式是 (1)與疫苗抗原混合制成疫苗制劑使用時，加入到包含愛德華氏菌疫苗抗原的針劑、浸浴劑或口服劑中上述佐劑的有效成分與疫苗抗原重量比為1/10—1000/1 ； (2)制成不含疫苗抗原的佐劑制劑但與疫苗抗原同時使用時，上述佐劑的有效成分在疫苗制劑對水生動物進行免疫接種前臨時添加并充分混勻，添加量為疫苗抗原重量的1/10—1000/1 ； (3)與疫苗抗原不同時使用時，加入到水生動物飼料或浸浴水體中的上述佐劑的有效成分按飼料或浸浴水體重量的1/100000—1/100進行添加，添加時間為疫苗制劑對待免疫水生動物進行免疫接種前3日至接種后30日以內，可以給藥I次或多次。
8.如權利要求6所述的應用，其特征在于所述水生動物進行免疫接種時，可以采用注射免疫、創傷免疫、浸浴免疫、口服免疫或其他將佐劑有效成分和疫苗抗原導入到水生動物體內的任何免疫接種途徑。
9.如權利要求4所述的應用，其特征在于所述佐劑在應用前，針對上述佐劑的不同應用方式，查明在免疫條件下給藥后14日內有效成分對水生動物體的安全劑量范圍，確定上述佐劑的實際用量，使給藥后有效成分在水生動物體內的含量為上述安全劑量的1/100—4/5。
10.如權利要求4所述的應用，其特征在于所述佐劑及共同應用的疫苗免疫接種的水生動物對象包括海水養殖魚類、半咸水養殖魚類、洄游魚類、淡水養殖魚類、觀賞魚類和淡水養殖的兩棲類和爬行類。
全文摘要
本發明涉及一種增強愛德華氏菌疫苗免疫接種效果的佐劑及其應用方法。其特征是上述的佐劑提取自谷物、酵母、部分真菌或海藻等原料，其有效成分為包含β-1，3-葡聚糖和β-1，3-葡聚糖的天然、人工改造或人工合成產物。該佐劑的應用可增強愛德華氏菌的滅活菌體、菌蛻成分、弱毒菌株、減毒菌株、保護性抗原、抗原亞單位、抗原決定簇或抗原基因表達載體的表達產物的任何一種或一種以上的愛德華氏菌疫苗抗原接種后的特異性免疫保護率；應用中可以與疫苗抗原混合使用，也可以制成單一制劑但與疫苗抗原同時使用，還可以與疫苗抗原不同時使用。
文檔編號A61P37/02GK102988981SQ201210539588
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月13日 優先權日2012年12月13日
發明者黃倢, 謝國駟, 隋虎辰, 王秀華, 邊慧慧, 史成銀, 劉莉 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所