專利名稱：一種具有粘接性能的人工骨材料及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種人工骨材料及其制備方法。
背景技術：
高能量損傷導致的粉碎骨折越來越多見，這在一定程度上給臨床醫生的治療帶了困難。特別是近關節的粉碎骨折，較小的碎骨片很難固定，如果去除過多勢必導致骨缺損， 影響骨折的愈合；如果按解剖位置放回又難以維持骨片的穩定性，影響關節面的對合，造成后期創傷性骨關節炎的發生。雖然目前對于粉碎骨折塊的治療可以通過螺釘、鋼針、鋼絲、 絲線等進行固定，或僅保持骨折的力線位置讓其自行愈合，但如果粉碎骨折塊之間間隙較大或對和不良，將會明顯影響骨折的愈合時間及骨折的再塑型時間。采用醫用粘合劑對骨碎塊進行粘合復位是目前較有前途的一種治療方法。然而， 目前普遍使用的醫用粘合劑或多或少都存在一些缺陷。如粘度和聚合速度難以控制，韌性差及耐水性差，凝固后柔軟性差。在骨組織粘接中，如骨折縫較大，膠體涂抹過多，由于降解緩慢會起到板障作用，影響骨折的愈合。分解時會產生有毒的甲醛；纖維蛋白類膠粘劑的粘接強度較低，又是血液制劑，不容易被病人所接受；傳統的骨科粘合劑-聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥，粘合強度較高，但在粘合過程中會產生有毒的單體，且在骨間容易形成較厚的阻隔影響骨折愈合。即使是近年來發展的磷酸鈣、磷酸鎂骨水泥，在改善骨愈合性能上有了很大提高，尤其是在骨缺損填充性能上表現優異，但其粘合強度仍不理想。因此，研制具有生物活性、可控生物降解的人工骨材料，既具有骨缺損填充性能， 又具有較好粘接性能，成為醫用生物型骨粘合劑研究開發的主要目標。隨著骨組織工程學的發展，針對臨床不同需求進行不同類型組織工程骨的構建已成為當今研究的趨勢。羥基磷灰石(Hydroxyapatite，HA)是天然骨的主要無機成分，在骨質中大約占60wt%，其基本單元是針狀磷灰石晶體。HA具有良好的生物活性和生物相容性，大量研究表明HA具有較強的骨傳導和骨誘導性，能與骨組織較好的結合，是一種性能非常優良的骨修復材料。20世紀50年代以來，科學家對人工合成的HA進行了深入的研究， 合成出了純度很高的HA單晶。但是易碎、強度差、韌性差的缺點制約了 HA的臨床應用。納米羥基磷灰石(n-HA)復合材料是指納米尺寸的HA與其他材料復合而成的新型材料。由于在結構上與天然骨更為接近，n-HA復合材料比相應的微米復合材料具有更好的生物學性能；同時優化材料的組成、結構和工藝將可能得到力學性能與天然骨更為匹配的骨修復材料。目前研究的n-HA復合材料可分為兩類非降解的和可降解的。在與n-HA復合的材料中可降解聚合物殼聚糖目前成為國內外研究的熱點。殼聚糖(Chit0San，CQ是一種從海洋生物蝦蟹外殼中提取的天然多糖類物質，在體內可被吸收和利用，無免疫原性，與組織和細胞有很好的相容性。它的分子結構和軟骨基質糖氨多糖(GAG)結構相似，對軟骨細胞有較好的吸附作用，促進細胞在材料上的增殖與分化；促進成骨細胞增值并持續表達I型膠原纖維。目前大量的研究證實納米羥基磷灰石/殼聚糖復合人工骨是一種性能非常優良的骨修復材料。而海藻酸鈉(sodium alginate, SAL)是從天然海藻中提取的一種分子膠體，由于生物相容性好，且有較好的粘合性，已在組織工程中得到了廣泛的應用。上述研究表明，羥基磷灰石、殼聚糖、海藻酸鈉具有良好的生物活性，適合作為生物活性材料。但如何將它們制備成既具有骨缺損填充性能，又具有較好粘接性能的人工骨材料，尚缺乏這方面的報道。

發明內容
本發明一方面提供了一種具有粘接性能的人工骨材料，該人工骨材料由其固相組分和液相組分按照0.8 1 4 1 (g/ml)的比例混合制備而成，所述的固相組分包含羥基磷灰石、羧甲基殼聚糖、海藻酸鈉，其中，羥基磷灰石 羧甲基殼聚糖海藻酸鈉(質量比)=85 10 5 45 35 20 ；所述的液相組分為檸檬酸衍生物的二甲基亞砜溶液，所述檸檬酸衍生物的濃度范圍為 ImmoL/L 10mmoL/L ；所述的檸檬酸衍生物為檸檬酸與N-羥基琥珀亞胺發生反應獲得的酯化產物。在本發明的一個具體實施方式
中，所述的固相組分中，羥基磷灰石羧甲基殼聚糖海藻酸鈉(質量比)優選70 25 5 60 30 10。更優選的，65 28 7。在本發明的一個具體實施方式
中，該人工骨材料的固相組分和液相組分比例優選1. 6 1 2. 5 l(g/ml)。更優選的 2 1。在本發明的一個具體實施方式
中，所述檸檬酸衍生物的濃度范圍優選3mmoL/L 6mmoL/L。更優選的，4mmoL/L。本發明另一方面提供了上述人工骨材料的制備方法，其包括步驟固相組分的制備1)分別配制Ca(N03)2、(NH4)2HPO4、羧甲基殼聚糖和海藻酸鈉的水溶液，配制的這四種水溶液中Ca(NO3)2 (NH4)2HPO4 羧甲基殼聚糖海藻酸鈉(質量比)= 60 25 10 5 30 15 35 20 ；2)將羧甲基殼聚糖溶液和海藻酸鈉溶液混合攪拌均勻后，再加入Ca (NO3) 2溶液混合攪拌均勻；3)在溫度為35°C 55°C的條件下，攪拌步驟(2)獲得的混合溶液的同時加入 (NH4)2HPO4溶液，攪拌速度為15 30轉/min，(NH4)2HPO4溶液的添加速度為0. 4-0. 6mol/ min(以每分鐘添加的(NH4)2HPO4的摩爾數計)，pH值控制在8. 8 10. 3，攪拌12小時以上；4)陳化、過濾，取固相；液相組分的制備 1)將檸檬酸溶解在二甲基甲酰胺中，并在1- (3- 二甲基氨丙基)-3-碳化二亞胺的存在下，加入N-羥基琥珀亞胺進行酯化反應獲得所述的檸檬酸衍生物；2)再制備濃度范圍為ImmoL/L lOmmoL/L檸檬酸衍生物的二甲基亞砜溶液；將上述制得的固相組分與液相組分按照0.8 1 4 1 (g/ml)的比例混合均勻即獲得所述的骨粘合劑。在本發明的一個具體實施方式
中，所述固相組分制備的步驟4)中，將過濾取得的固相洗滌后，置于醇溶劑中超聲分散，再攪拌至少12小時后，再次過濾后取固相。
本發明的人工骨材料，既是具有骨缺損填充性能的骨材料，又是具有較好粘接性能的骨粘合劑，同時也具有生物活性，可控生物降解性。具體的醫用效果方面，本發明的人工骨材料既能將粉碎的骨折塊粘接達到解剖復位，又能在骨折塊間隙及骨缺損處起到有效地填充作用，既保持正常骨的形態、保持了骨片的穩定，又不影響骨折的愈合。
具體實施例方式實施例1固相組分制備1)按照羥基磷灰石的化學摩爾計量比Ca/P = 1. 67分別配制12ml的0. lg/ml的 Ca(NO3)2溶液和IOml的0. 05g/ml的(NH4)2ΗΡ04溶液備用；制備2%羧甲基殼聚糖的水溶液 IOml ；制備2%海藻酸鈉的水溶液5ml ；2)然后將海藻酸鈉溶液和羧甲基殼聚糖溶液混合連續攪拌證使其完全混合均勻；再將Ca(NO3)2溶液加入到混合液中混勻；3)在40°C下劇烈攪拌(攪拌速度為20轉/min)混合液同時將(NH4)2HPO4溶液逐漸滴入，滴加速度^il/min，該過程pH值維持在9 10左右，攪拌M小時后；4)所得漿料于室溫下陳化一天，將沉淀過濾、洗滌沉淀；為防止團聚可以再將沉淀物在乙醇中超聲分散，并攪拌12小時，再次過濾后于80°C真空烘干，并研磨成粉，玻璃瓶密封。液相組分制備將3g檸檬酸加入到15ml 二甲基甲酰胺(DMF)中，在1_(3_ 二甲基氨丙基)-3-碳化二亞胺(EDC)(濃度0. 015% )存在下和N-羥基琥珀亞胺(HOSu)(濃度 0. 4% )反應制得檸檬酸衍生物(CAD)。再將檸檬酸衍生物加入到二甲基亞砜(DMSO)溶液， 使CAD濃度為4mmoL/L，玻璃瓶密封備用。人工骨材料的漿體制備按照固相組分液相組分=1.0 0.5(g ml)，用藥匙攪拌1 2min，形成均勻的漿狀物即獲得實施例1的人工骨材料漿體。實施例2固相組分制備1)按照羥基磷灰石的化學摩爾計量比Ca/P = 1. 67分別配制6ml的0. lg/ml的 Ca(NO3)2溶液和6ml的0. 05g/ml的(NH4)2HPO4溶液備用；制備2%羧甲基殼聚糖的水溶液 35ml ；制備2%海藻酸鈉的水溶液20ml ；步驟2)-4)同實施例1。液相組分的制備同實施例1。人工骨材料的漿體制備按照固相組分液相組分=1.2 0.5(g ml)，用藥匙攪拌1 2min，形成均勻的漿狀物即獲得實施例1的人工骨材料漿體。 人工骨材料性能技術指標測定如下1)ρΗ 值測定分別取實施例1、2獲得人工骨材料的固相組分1. 0g，加入5ml去離子水，再加入 0. 5ml 液相組分，pH 電子測試儀測量 lmin、5min、10min、20min、30min、lh、2h、10h、24h 的 pH值。
結果固化過程中pH值為6. 9 7. 7，符合國際通用標準。2)固化時間參照ISO 3107中關于磷酸鋅水泥的測試方法，在37°C、100%濕度環境中進行測試實施例1、2獲得人工骨材料的漿體。測試5個樣本，取平均值。結果固化時間為12 18min，能滿足臨床操作要求。3)抗壓強度測定將實施例1、2獲得的人工骨材料的漿體制成8mmX 12mm的圓柱體，在37°C、100% 濕度環境中進行固化，24h后取出樣本，生物力學實驗機上測試樣本抗壓縮強度。測試5個樣本，取平均值。結果抗壓強度為4. 5士2. 1MP，與人松質骨的強度相當。4)抗拉強度測定取新鮮豬股骨頭部松質骨標本48對，制備Icm2骨折斷面，隨機分成6組，每組8 對。脈沖槍沖洗骨折斷面骨屑，將實施例1、2獲得的人工骨材料的漿體調和成糊狀，粘接骨斷面后用骨折固定鉗固定，分別于室溫25°C和37°C、100%濕度下(模擬體內環境)固化30min、a!、24h后，于加載速度為lOmm/min條件下，生物力學實驗機上測量股骨頭抗拉強度。結果豬股骨頭粘接體于室溫25 °C和371、100(%濕度下固化301^11，其抗拉強度分別 77. 21 士 7. 3N/cm2 和 79. 47 士 8. 6N/cm2 ；固化 2h 分別為 96. 38 士 10. 15N/cm2 和 103. 22士 12. 06N/cm2 ；固化 24h 后分別為 112. 46士 14. 43N/cm2 和 117. 16士 18. 54N/cm2。固化相同時間后不同室溫條件下抗拉強度差異無統計學意義(P > 0. 05)。不同室溫條件下固化30min和池其平均抗拉強度分別達固化24h最大抗拉強度的72%和94%。5)抗稀散性觀察實施例1、2獲得的人工骨材料的漿體迅速灌入2. 5ml醫用注射器，于混合后60s 注入蒸餾水中，靜置Mh，觀察抗稀散情況。結果獲得的人工骨材料固化物仍保持完整，無潰散現象。6)掃描電鏡(SEM)觀察取實施例1、2獲得的人工骨材料的固化產物，真空干燥后浸入液氮中冷凍，低溫下制造斷裂面，再次干燥后表面噴金，電鏡下直接觀察孔形態、結構、孔徑和孔的貫通性。結果固化產物呈多孔結構，孔徑為100 300um，大多數孔徑為100 150um。各個孔徑之間還有小孔貫通，材料孔內無HA晶體聚集，孔壁上有大量細小的HA晶體，分布相對比較均勻，材料具有很高的孔隙率，有利于細胞的生長。綜上所述，實施例1、2獲得的人工骨材料，其基本性能完全達到了目前對于人工骨材料(醫用粘合劑、骨水泥等)的醫用要求標準。人工骨材料漿體的應用例1取健康成年新西蘭大白兔72只，體重2 2. 5kg,雌雄不限，隨機分為6組，每組 12只，每組隨機選擇6只作為實驗組，另6只作為對照組。動物腹腔內注射2. 5%戊巴比妥鈉Omg/kg)，麻醉滿意后，常規消毒鋪巾，經脛前入路，逐層切開皮膚、皮下組織和深筋膜， 顯露脛骨中段，剝離骨膜后，常規方法鋸斷脛骨制作脛骨中段橫斷骨折模型，實驗組拭干骨折斷端血跡后用實施例1的人工骨材料漿體粘接骨折斷端并將骨折塊間的縫隙及缺損的部位填充抹平，加壓并維持10 15min，以使漿體充分固化。對照組單純用2. 5mm克氏針髓腔內固定。沖洗傷口后逐層縫合切口，術后正常飼養，每日肌肉注射青霉素40萬U。術后 2、4、6、8、10、12周分批分組處死動物。術后大體觀察骨折愈合情況良好。組織切片觀察骨細胞正常長入骨折線，10周的組織骨折線已不清晰，證明骨細胞完全長入與正常骨組織切片一致，達到了與克氏針髓腔內固定同樣的效果。人工骨材料漿體的應用例2成年健康新西蘭大白兔M只，雌雄各半，體重310 3Mkg。于兔耳緣靜脈注入 3%戊巴比妥鈉靜脈麻醉，側臥位固定，后肢驅血后上止血帶。無菌操作下，于兩側脛骨內髁處作皮膚切口，逐層切開，暴露脛骨內髁。在脛骨平臺下約0. 5cm處與平臺成45，制備雙側脛骨平臺骨折模型。隨機選取一側為實驗側，沖凈骨屑，人工骨材料漿體填入骨折斷端，巾鉗固定10 15min后，放松止血帶，縫合。另一側為對照側，采用L形鋼板內固定。術后不作外固定，允許動物自由活動。術后隨機選擇3d，3、6和9周進行觀察，每個時間點6只。X 線片及大體觀察，術后9周實驗一側骨折愈合；組織學觀察9周人工骨材料漿體完全吸收， 骨折完全愈合。本發明的人工骨材料具有一定的粘合性能，可以將粉碎骨折塊粘接是的骨折片拼接達到骨折部位的解剖形態，同時對骨折塊間的縫隙及缺損的部位填充(“抹平”縫隙、缺陷)，達到無縫、無缺損狀態，既保持正常骨的形態、保持了骨片的穩定，又不影響骨折的愈合，加快新骨的形成和改建，縮短骨折的愈合時間及骨折的再塑型時間。
權利要求
1.一種人工骨材料，其特征在于該人工骨材料由其固相組分和液相組分按照 0.8 1 4 1 (g/ml)的比例混合制備而成，所述的固相組分包含羥基磷灰石、羧甲基殼聚糖、海藻酸鈉，其中，羥基磷灰石羧甲基殼聚糖海藻酸鈉(質量比)=85 10 5 45 35 20 ；所述的液相組分為檸檬酸衍生物的二甲基亞砜溶液，所述檸檬酸衍生物的濃度范圍為 ImmoL/L 10mmoL/L ；所述的檸檬酸衍生物為檸檬酸與N-羥基琥珀亞胺發生反應獲得的酯化產物。
2.如權利要求1所述的人工骨材料，其特征在于所述的固相組分中，羥基磷灰石羧甲基殼聚糖海藻酸鈉(質量比)=70 25 5 60 30 10。
3.如權利要求2所述的人工骨材料，其特征在于所述的固相組分中，羥基磷灰石羧甲基殼聚糖海藻酸鈉(質量比)=65 觀7。
4.如權利要求1所述的人工骨材料，其特征在于該人工骨材料的固相組分和液相組分比例為 1.6 1 2. 5 l(g/ml)。
5.如權利要求1所述的人工骨材料，其特征在于所述檸檬酸衍生物的濃度范圍為 3mmoL/L 6mmoL/L0
6.如權利要求1所述的人工骨材料的制備方法，其特征在于其包括步驟固相組分的制備1)分別配制Ca(N03)2、(NH4)2HPO4、羧甲基殼聚糖和海藻酸鈉的水溶液，配制的這四種水溶液中Ca (NO3)2 (NH4)2HPO4 羧甲基殼聚糖海藻酸鈉(質量比)=60 25 10 5 30 15 35 20 ；2)將羧甲基殼聚糖溶液和海藻酸鈉溶液混合攪拌均勻后，再加入Ca(NO3)2溶液混合攪拌均勻；3)在溫度為35°C 55 °C的條件下，攪拌步驟(2)獲得的混合溶液的同時加入 (NH4)2HPO4溶液，攪拌速度為15 30轉/min，(NH4)2HPO4溶液的添加速度為0. 4-0. 6mol/ min，pH值控制在8. 8 10. 3，攪拌12小時以上；4)陳化、過濾，取固相；液相組分的制備1)將檸檬酸溶解在二甲基甲酰胺中，并在1-(3- 二甲基氨丙基)-3-碳化二亞胺的存在下，加入N-羥基琥珀亞胺進行酯化反應獲得所述的檸檬酸衍生物；2)再制備濃度范圍為ImmoL/L lOmmoL/L檸檬酸衍生物的二甲基亞砜溶液；將上述制得的固相組分與液相組分按照0.8 1 4 1 (g/ml)的比例混合均勻即獲得所述的骨粘合劑。
7.如權利要求6所述的制備方法，其特征在于所述固相組分制備的步驟4)中，將過濾取得的固相洗滌后，置于醇溶劑中超聲分散，再攪拌至少12小時后，再次過濾后取固相。
全文摘要
本發明涉及一種人工骨材料及其制備方法，該人工骨材料由其固相組分和液相組分按照0.8∶1～4∶1(g/ml)的比例混合制備而成，所述的固相組分包含羥基磷灰石、羧甲基殼聚糖、海藻酸鈉，所述的液相組分為檸檬酸衍生物的二甲基亞砜溶液。本發明的人工骨材料，既是具有骨缺損填充性能的骨材料，又是具有較好粘接性能的骨粘合劑，既能將粉碎的骨折塊粘接達到解剖復位，又能在骨折塊間隙及骨缺損處起到有效地填充作用，既保持正常骨的形態、保持了骨片的穩定，又不影響骨折的愈合。
文檔編號A61L27/12GK102363049SQ20111036005
公開日2012年2月29日 申請日期2011年11月14日 優先權日2011年11月14日
發明者肖海軍, 薛鋒 申請人:上海市奉賢區中心醫院