專利名稱：：修飾的腦膜炎球菌多糖偶聯物疫苗的制作方法
技術領域：
：本發明涉及化學修飾的B類腦膜炎萘瑟球菌(Neisseriameningitidis)多糖。本發明還提供了疫苗，在該疫苗中各個修飾的多糖被偶聯于蛋白質載體等。
背景技術：
：由B類腦膜炎萘瑟球菌和大腸桿菌K1造成的腦膜炎仍然是世界上主要的健康問題。B類腦膜炎有地方性和流行性兩種，它約占所有腦膜炎(雙)球菌腦膜炎記錄病例的一半，而K1陽性大腸桿菌是新生兒腦膜炎的主要病因。目前還沒有市售的、針對B類腦膜炎球菌和大腸桿菌K1所造成疾病的疫苗。這主要是因為B類腦膜炎球菌多糖(groupBmeningococcalpolysaccharide，GBMP)在人中僅有弱免疫原性。天然GBMP的弱免疫原性以及會導致免疫耐受性，被假設為是因為在人和動物組織中存在共同的表位。有幾種最近報道的候選疫苗，這些疫苗以具有外膜蛋白的GBMP復合物為基礎，但是到目前為止還沒有證據表明它們在人中是有效的。最近，發展了一種新的疫苗概念，這種疫苗以人工化學修飾的(N-丙酰基化的)B類多糖-蛋白質(N-Pr-GBMP-蛋白質)偶聯物(或稱綴合物，conjugate)為基礎。該疫苗在小鼠中誘導高效價的IgG抗體，這些抗體不僅起保護作用，而且可與未修飾的GBMP(即N-乙酰基-GBMP)交叉反應。這一概念在1988年2月23日授予HaroldJ.Jennings等人的美國專利No.4,727,136中有描述并提出了權利要求。已有這樣的暗示，導致產生交叉反應性抗體的疫苗(如在美國專利No.4,727,136中所描述的)只能在破壞免疫耐受性的情況下獲得成功。由于在天然的N-Ac-GBMP及人和動物的組織兩者中都鑒別出一共同的表位(Jennings，Contrib.Microbiol.Immunol.，Basel，Karger，1989，Vol.10，151-165)，該表位由α-(2-8)-連接的唾液酸殘基鏈(最低要求為10個殘基)構成，所以使這種假設得以成立。這些多唾液酰基鏈(polysialosylchain)的功能是作為發育抗原，而且最主要地是與胎兒階段的胚胎神經細胞粘附相關(Finne等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1983，112，482)。在出生后的成熟過程中，該抗原是負調控的(friedlander等人，細胞生物學雜志(J.Cell.Biol.)，1985，101，412)，但是在成熟的人中在得病肌肉的再生期間(Cashman等人，Ann.Neuron.，987，21，48)、在腫瘤細胞中(Roth等人，美國科學院院報，1988，85，299)以及在天然殺傷細胞(NK)和CD3+T細胞中(Husmann等人，歐洲免疫學雜志(Eur.J.Immunol.)，1989，19，1761)是表達的。盡管破壞對這些胎兒抗原的耐受性的后果還不清楚，但是需要開發出對人表位有更低免疫原性的疫苗。因此，本發明的一個目的是開發修飾的B類腦膜炎球菌多糖，它有免疫原性并可誘導出對宿主天然表位的交叉反應性更低的抗體。本發明的另一目的是提供包含這些修飾多糖的多糖-蛋白質偶聯物。本發明的另一目的是提供具有免疫原性的疫苗，它與GBMP的交叉反應性大大下降。發明概述本發明主要提供化學修飾的B類腦膜炎萘瑟球菌多糖。本發明還提供了疫苗，在該疫苗中各個修飾的多糖被偶聯于蛋白質載體。具體地，本發明提供了不飽和的B類腦膜炎萘瑟球菌N-酰基衍生多糖，共價連于蛋白質的不飽和N-酰基衍生多糖偶聯物，含有腦膜炎萘瑟球菌不飽和N-酰基衍生多糖的偶聯物分子的藥物組合物，以及這些組合物作為疫苗的用途。在本發明的一個方面，提供了一種修飾的B類腦膜炎萘瑟球菌多糖，其唾液酸殘基的N-乙酰基(C2)被不飽和的C3-4酰基所取代。另一方面，提供了一種抗原偶聯物，它包含偶聯于免疫學上合適的蛋白質的、不飽和C2-4N-酰基衍生多糖，并且與天然多糖相比具有更高的免疫原性和對交叉反應抗體的誘導性更低。在另一方面，提供了一種疫苗，它含有不飽和的N-酰基衍生多糖-蛋白質偶聯物以及合適的載體或稀釋劑。本發明的疫苗還可含有治療有效量的適用于人體的佐劑，如磷酸鋁、氫氧化鋁或硬脂酰基酪氨酸。在另一方面，提供了一種使哺乳動物對腦膜炎萘瑟球菌和大腸桿菌K1感染產生免疫的方法，該方法包括給可能受到這種感染的哺乳動物(包括人)腸胃外施用免疫有效量的本發明疫苗。疫苗的典型給藥量為約1-50微克/千克體重，例如5-25微克/千克體重。在另一方面，本發明提供了能夠防止B類腦膜炎萘瑟球菌和大腸桿菌K1造成的腦膜炎的血清和γ-球蛋白組份。該組份的產生是通過用本發明的疫苗免疫一哺乳動物，然后最好將γ-球蛋白組份從免疫血清中分離出來。接著可將該組份施用于個體，以防止由上述生物體造成的感染或者治療正發生的感染。根據這一點，并考慮到其有利的免疫原性和對GBMP交叉反應抗體的最低誘導性，就會理解本發明的免疫原性疫苗偶聯物是治療用抗血清的來源。本發明的偶聯物還可用于產生單克隆抗體，而且還可產生抗獨特型抗體。我們發現，用上述授予Jennings等人的美國專利4,727,136中所描述的N-Pr-GBMP-蛋白質偶聯物所誘導出的絕大多數殺菌保護性抗體，與GBMP交叉反應抗體并不相關。事實上，絕大部分保護活性屬于一個并不與GBMP交叉反應的N-Pr-GBMP-特異性抗體群。考慮到這一點，人們認為N-Pr-GBMP模擬了B類腦膜炎球菌表面的一個獨特的殺菌表位。本發明基于這樣的發現可以合成化學修飾的GBMP，這種化學修飾的GBMP模擬殺菌表位并且當處于偶聯形式時，不僅表現出更高的免疫原性而且還基本上避免了誘導與GBMP交叉反應的抗體的情況。在完成本發明的過程中，已合成了不同的化學修飾的GBMP，并將其各自偶聯于蛋白質，然后將偶聯物注射入小鼠，將效果與N-Pr-GBMP蛋白質偶聯物產生的效果相比較。出人意料的是，現在已發現在N-酰基中存在不飽和鍵尤其會產生免疫原性偶聯物。通過研讀下面本發明具體實施例的詳細描述，可以更好地理解本發明的這些特征和其他特征。本發明的范圍只受所附權利要求書的限定。發明詳述本發明總體而言提供了新的B類腦膜炎萘瑟球菌不飽和N-酰基衍生多糖，新的B類不飽和N-酰基衍生物的偶聯物，含有共價連于蛋白質的B類腦膜炎萘瑟球菌不飽和N-酰基衍生多糖片段的偶聯物分子的藥物組合物，以及這些組合物作為疫苗的用途。本發明涉及式(I)的B類腦膜炎萘瑟球菌不飽和N-酰基衍生多糖其中，R1是含有至少一個雙鍵的C2-C4不飽和烷基。在本發明的一個例子中，式I的R1有3或4個碳原子，而且有兩個非相鄰雙鍵。在本發明的另一例子中，式I的R1是2個、3個或4個碳原子，而且距酰基碳原子最遠的碳原子通過雙鍵而相連。可用于本發明式I的修飾的B類腦膜炎球菌多糖N-酰基衍生多糖的具體(但非限定性)例子包括下列N-戊烯酰基(CH2＝CH-CH2-CH2-CONH-)；和N-巴豆酰基(3-丁烯酰基)(CH2＝CH-CH2-CONH-)B類腦膜炎球菌多糖是從腦膜炎萘瑟球菌中，用本領域中已知的方法分離出的。在一種這樣的方法中，B類腦膜炎球菌(981B株)是在發酵罐中于37℃生長，其中對每升蒸餾水用30克脫水ToddHewittBroth(DifcoLaboratoriesDetroit，Michigan)。在發酵生長之前，凍干的菌株先在燭式瓶(candlejar)中，于37℃，在5％(v/v)Sheeps′BloodAgar(DifcoLaboratoriesDetroit，Michigan)平板上生長。然后將細菌轉移至錐形燒瓶中的1.0升ToddHewittBroth(如上)中，在37℃于190rpm下振蕩培養7小時。接著將接種物轉移至發酵罐。在發酵生長(16小時)后，通過加入甲醛至終濃度為0.75％而殺死細菌。通過連續離心去除菌體，從上清液中分離出B類腦膜炎球菌多糖。然后基本上按Bundle等人，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)，249，4797-4801(1974)所述的方法進行純化，不同點在于將粗制多糖溶液與冷的(4℃)90％苯酚(而不是50-60℃的熱苯酚)進行攪拌，從而將蛋白質抽提出。后一步驟保證產生高分子量形式的GBMP。大腸桿菌(018K1H7)(NRCC4283)在發酵罐中，在含脫水BrainHeartInfusion(BHI；37克/升)(DifcoLaboratoriesDetroit，Michigan)的蒸餾水中于37℃生長。在發酵生長之前，凍干的菌株先在錐形燒瓶中的50毫升BHI溶液(同上)中，在37℃于200rpm下振蕩培養7小時。然后將這種生長物轉移至1.5升BHI(同上)中并在與上述相同的條件下生長7小時。接著將接種物轉移至發酵罐。在分離和純化大腸桿菌K1的莢膜多糖中所用的程序，與上述用于分離B類腦膜炎球菌多糖的程序是相同的。應理解，上述的分離和純化程序并不是唯一可用的程序，可以使用其他出版的程序，如Watson等人，免疫學雜志(J.Immunol.)，81，331(1958)和上述美國專利4,727,136中所描述的程序。天然的多糖被N-脫乙酰基化，以便在分子的唾液酸殘基部分提供反應性胺基。N-脫乙酰基化可用任何已知方法進行，例如在高溫如約90-110℃和約pH13-14時，在堿性水性介質中進行。該堿性水性介質合適地是堿金屬氫氧化物的水溶液，例如濃度約2M的氫氧化鈉。或者，可以使用肼的水溶液。N-脫乙酰基化的程度可在約30-100％之間隨條件而有所變動。較佳地是90-100％N-脫乙酰基化。N-脫乙酰基后的產物可通過例如冷卻、中和、純化(如果需要)和凍干而回收。N-脫乙酰基化的結果是，通常產生平均分子量為約3,000-50,000道爾頓的多糖片段。在本發明中，可使用全長的多糖或多糖片段。N-脫乙酰基的多糖片段或全長的多糖然后被N-酰基化，以產生相應的N-酰基化產物。N-酰基化可這樣進行將N-脫乙酰基的多糖溶解在pH約7.5-9.0的水性緩沖介質中，然后加入適當的不飽和酰基酐(以及任選的醇，以提高溶解度)，冷卻至低于10℃直至反應結束。如果需要，可以對反應介質進行純化。可以采用的純化方法的非限制性例子包括透析，然后通過凍干回收N-酰基化產物。反應大致在約10-20小時內完成。用分析技術(通常為1H-NMR)測得的N-酰基化的程度至少為90％，而且最好接近100％。N-酰基化反應不會導致片段分子量的大幅下降。本發明的偶聯物分子具有式II結構其中R2是不飽和的C2-4酰基。因此，該偶聯物可包含本發明的不飽和多糖，而且還可包含丙烯酰基衍生物。根據本發明，為了偶聯目的，優選選擇平均分子量對應于約10-200個唾液酸殘基的C2-4N-酰基化材料。因此，優選的偶聯物是N-丙烯酰基(2-丙烯酰基)衍生物。這一般可使用Ultragel(商品名)AcA44柱(珠直徑為60-140微米)，并將PBS用作洗脫劑，通過凝膠過濾N-酰基化的GBMP而實現。或者，采用合適的篩分膜(sizingmembrane)。平均分子量為30,000-40,000道爾頓如10,000-15,000道爾頓的不飽和N-酰基化材料，被優選用于本發明。這可通過收集平均分子量在該范圍內的N-酰基化GBMP材料的柱洗脫組份而獲得。平均分子量更高例如在30,000-40,000道爾頓范圍內的N-酰基化材料，已表明也可用于本發明。在本發明的偶聯物分子中多糖對蛋白質的摩爾比優選為1摩爾蛋白質對20摩爾多糖之間。更佳地該比例為1摩爾蛋白對約2-15摩爾多糖。最佳地，該比例為1摩爾蛋白質對4-7摩爾多糖。通過調節偶聯反應中原料組份的比例，可改變蛋白質/多糖之比。為了提供包含偶聯于蛋白質的不飽和N-酰基衍生多糖的偶聯物分子，本發明還設計了多價的偶聯物及其疫苗，其中不同類型的多糖被偶聯于單個蛋白質上。本發明的疫苗，是通過將不飽和的N-酰基多糖偶聯于免疫學上合適的載體蛋白而制得的。較佳地，該載體蛋白本身是免疫原。這種合適的載體蛋白的非限制性例子是細菌蛋白；或包括破傷風毒素、白喉毒素、交叉反應物質(CRM)尤其是CRM197(從SclavoLtd.，Siena，Italy獲得)、和細菌蛋白載體的多肽，如腦膜炎球菌外膜蛋白。可用任何的偶聯方式將修飾過的多糖片段與載體蛋白相偶聯。一種優選的方法是在美國專利4,356,170中所描述的方法，即將末端醛基(通過順式鄰位羥基的氧化)引入N-酰基化多糖中，然后通過還原性胺化作用將醛基偶聯于蛋白質的氨基。這樣，多糖和蛋白質便通過-CH2-NH-蛋白質鍵而連接在一起。但是，應理解，本發明的偶聯物疫苗并不局限于那些通過還原性胺化反應而產生的偶聯物。因此，還可通過用己二酰基二肼間隔體(如Schneerson，R.，等人，Preparation，CharacterizationandImmunogenicityofHaemophilusinfluenzaetypebPolysaccharide-ProteinConjuates，《實驗醫學雜志》(JExp.Med.)，1952，361-476(1980)和授予LanceK.Gordon的美國專利4,664,059中所述的)，將N-酰基化多糖與載體蛋白偶聯在一起，從而產生疫苗。或者，也可使用Merck開發的二元間隔體技術，如Marburg，S.等人，″BiomolecularChemistryofMacromoleculesSynthesisofBacterialPolysaccharideConjugateswithNeisseriameningitidisMembraneProtein″，J.Am.Chem.Soc.，108，5282-5287(1986)中所述的技術，或用還原末端法。根據本發明而制備的偶聯物分子通常包含一蛋白質，在該蛋白質上通過多糖片段骨架末端上的單一結合位點而結合有至少一個本發明的腦膜炎球菌多糖片段。因此，如果需要，本發明提供了產生腦膜炎球菌偶聯物分子的能力，其中多糖組份除了一個末端之外沒有被蛋白質所掩蓋。通過支鏈的末端唾液酸將腦膜炎球菌多糖偶聯于蛋白質的其他方法可造成交聯，以及多糖被連于蛋白質的多個位點。本發明還包括用這些混合方法產生的偶聯物分子。形成的、沒有顯著交聯的N-酰基多糖蛋白質偶聯物在水溶液中是可溶的。這使本發明的這些偶聯物特別適合用作疫苗。形成的本發明的不飽和N-酰基-多糖蛋白質偶聯物，已經用小鼠進行了體外測試，并已表明與N-丙酰基-多糖相比具有更佳的免疫原性。此外，觀察到交叉反應抗體的形成顯著下降。另外，與其他被測試的偶聯物相比，不飽和的偶聯物顯示了出人意料的高殺菌效價。考慮到這一點，認為本發明的疫苗可用于針對B類腦膜炎萘瑟球菌或大腸桿菌K1生物體造成的腦膜炎。特別感興趣的是這些疫苗可用于保護人類嬰幼兒，他們對細菌性腦膜炎最敏感。本發明的疫苗可含有本領域技術人員已知的、對疫苗合適的標準載體、緩沖劑或防腐劑。此外，在制劑中還可包含佐劑如明礬或硬脂酰基酪氨酸，以增強免疫原性應答。本發明的疫苗，一般是通過將偶聯物分散于任何合適的藥學上可接受的載體如生理鹽水或其他可注射液體中而形成的。本發明疫苗的給藥可用任何熟知的方法進行，包括(但并不限于)皮下、腹腔內或肌內給藥。疫苗的優選給藥方式是非腸胃給藥。還可存在疫苗的常規添加劑，例如穩定劑如乳糖或山梨糖醇以及佐劑如磷酸鋁、氫氧化物或硫酸鹽。本發明的疫苗的給藥量應足以引發免疫原性應答。一般，約1-50微克多糖的劑量可有效地產生這樣的應答。可根據接受疫苗的個體的大小、體重或年齡等，調整劑量。個體的抗體應答可通過測定抗體效價或殺菌活性加以監測，如果需要可進行加強免疫以增強應答。對于人類嬰幼兒的疫苗合適劑量一般為約5-25微克，或約1-10微克/千克體重。實施例此處的實施例部分用于闡述實施本發明的各個不同方面，而不用于以任何方式限制本發明范圍。實施例1合成N-丙烯酰基GBMPN-丙烯酰基GBMP的合成描述于RoyR.等人，GlycoconjugateJ.(1990)73-12。將N-脫乙酰基化的GBMP(150毫克)溶解在2.0毫升蒸餾水中。將溶液冷卻至0℃；然后用50微升(1eq)丙烯酰基氯(AldrichChemicalCo.)分批地處理，總計500微升丙烯酰基氯。通過自動滴定設備，用4MNaOH將溶液的pH維持在8.5。在添加酰基氯完成(2小時)后，將pH升至12，并在該pH下維持30分鐘。通過相對4℃蒸餾水的完全透析而純化材料，然后凍干形成163毫克。對材料的H-NMR揭示，N-酰基化程度為100％，并且具有合適的丙烯酰基取代基的整合模式。實施例2N-丙烯酰基GBMP的活化將N-丙烯酰基GBMP(150毫克)溶解在蒸餾水(1.25毫升)中，然后加入3.75毫升0.2MNaIO4水溶液(約50eq)。該溶液在室溫下于黑暗中放置1小時，然后加入乙二醇(400微升，10eq)。在室溫下1小時后，溶液直接上樣于已經在水中平衡過的SephadexG-10(1.6×100)柱(PharmaciaFineChemicals)上。將活化產物從柱上于空體積峰處洗脫出來，然后收集和凍干。氧化產物再在用磷酸鹽緩沖液(pH7.6)平衡過的BioGelA.5柱(1.6×100)(BioRad)上進行分級。根據選定的洗脫物質組份的HPLC(高效液相色譜)分析(Pharmacia-Superose，12柱)結果，將獲得分子量的合并物。將各組份的相對Kav值與預先制作的校正曲線進行比較，從而選擇出氧化的丙烯酰基GBMP的一個11KD洗脫組份。如上通過透析純化各組份。分級后材料的H-NMR波譜分析與氧化的N-丙烯酰基GBMP是相符的。實施例3制備N-丙烯酰基GBMP與破傷風毒素的偶聯物將新鮮制備的破傷風毒素單體(TT-m；3.5毫克)與10.5毫克氧化的丙烯酰基GBMP的11KD洗脫組份在Pierce反應管中合并。加入氰基氫硼化鈉(7.0毫克)，然后將混合物溶解在233微升的磷酸鹽緩沖液(0.1M，pH7.5)。溶液在37℃總共溫育5天。定期地，通過分子排阻HPLC(Superose-12柱，Pharmacia)監測偶聯情況，以觀察隨著偶聯的進展向更高分子量變遷的情況。最終的偶聯物在已用PBS平衡過的BioGelA.5柱上通過分級而與原料分開，然后進行透析和凍干處理。對總唾液酸(Svennerholm法)和蛋白質(BCA法，Pierce)的比色分析表明，偶聯物含有12-30％唾液酸。實施例4對小鼠進行免疫一般，用一定量的相當2微克唾液酸的偶聯物(0.2毫升)，通過腹膜內方式對10只雌性CF1小鼠(8-10周大小)進行免疫，可以添加或不添加佐劑如明礬(Alhydrogel，SuperfosBiosector)或RIBI完全或部分佐劑系統(RIBIImmunochem)。在最初接種后，在第21和35天進行加強免疫，然后在第45天進行放血。通過心臟穿刺術收集血液，并將血清分份儲存于-86℃。實施例5殺菌測定殺菌測定是在96孔的組織培養微量滴定板(Corning)上進行的。所有的血清在使用前于56℃加熱滅活30分鐘。B類腦膜炎球菌(株80-165B2bp.l)在巧克力瓊脂平板(QueLab)上，于37℃在5％CO2中生長過夜，然后接種于第二個平板并溫育5小時。用Hank′s平衡鹽溶液(Hank′sbalancedsaltsolution，HBSS)作為稀釋劑，直接在平板上對抗血清進行適當的稀釋，使終體積為50微升/孔。制備GBM在HBSS中的懸浮液，其O.D.(λ580)＝0.1吸光度。該懸浮液在HBSS中稀釋40,000倍，得到用于分析的最終的細菌工作稀釋液。將新融化的幼兔補體(Pel-FreezeBiologicals)加至每個孔中(20微升)，然后加入30微升細菌工作稀釋液。然后，平板在37℃振蕩培養1小時。每個孔的內含物混合后，接種于巧克力瓊脂平板上(35微升)。然后將平板在37℃/5％CO2下溫育過夜，對菌落形成單位(CFU)數目進行計數。相對HBSS對照孔或無關抗血清的平均值，根據下式確定殺死百分比殺死％＝(CFU對照-CFU抗血清/CFU對照)×100實施例6被動保護測定從用N-酰基GBMP-TT免疫而獲得的小鼠抗血清，一般在無菌鹽水或PBS(磷酸鹽緩沖液)中進行稀釋。給幾組雌性CF1小鼠(每組5只)(8-10周大小)靜脈內注射200微升稀釋的抗血清。在1小時后，每組小鼠通過腹膜內注射B類腦膜炎萘瑟球菌(GMB80165B2bP.l)懸浮液(500微升；800-1200CFU/毫升)而進行攻擊。在5小時后，從各小鼠中通過心臟穿刺術收獲血液，然后將10微升血液接種于巧克力瓊脂平板。平板在37℃和5％CO2下溫育，在15-20小時后測定菌落形成單位(CFU)的數目。被動保護測定是以特異性抗體存在時細菌減少或消失為基礎的，它是相對于沒有特異性抗體的對照組進行測量的。由小鼠抗-N-酰基GBMP偶聯物血清所提供的保護程度，用相對于無關對照抗血清或PBS時每種抗血清的CFU下降的百分比來表示。實施例7針對腦膜炎萘瑟球菌B血清群(serogroup)的疫苗的合成及其生物活性合成針對腦膜炎萘瑟球菌B血清群的新的偶聯物疫苗，其設計以天然多糖的獨特修飾形式為基礎。天然多糖(N-AcGBMP)通過在氨基末端用N-丙烯酰基(NH-CO-CH＝CH2)完全取代N-乙酰基，對天然多糖(N-AcGBMP)進行衍生。物理方法，如1H和13C-NMR波譜分析可以確切地確定新物質的種類和均質程度，而分子排阻HPLC可顯示在解聚過程中多糖分子大小沒有改變。按與上述程序相似的方式，制備連于蛋白質的偶聯物。簡而言之，從制備N-丙烯酰基GBM多糖開始，制備2批不同的N-丙烯酰基GBMP-破傷風毒素偶聯物。對兩種偶聯物的比色分析揭示，總唾液酸對偶聯物之比分別為13％和20％。偶聯物的1H-NMR揭示在蛋白質上存在未改變的修飾多糖。在各自的動物試驗中，在一個例子中將N-丙烯酰基GBMP-TT偶聯物與鹽水、氫氧化鋁，或者與RIBI′s完全佐劑(MPL+TDM+CWS)一起注射入小鼠；而在另一例子中N-丙烯酰基GBMP-TT偶聯物僅與RIBI佐劑一起注射。觀察表明小鼠可很好地耐對各種抗血清的血清學測試表明，兩種偶聯物都引發的特異性應答都相當于或高于用N-丙酰基GBMP-TT構建物和RIBI′s佐劑系統時所見的應答(見表1)。對N-丙烯酰基GBMP-TT抗血清的交叉反應性的初步研究表明，它與用N-丙酰基GBMP-TT抗血清時所見的交叉反應程度相類似(見表2)。兩批N-丙烯酰基GBMP-TT抗血清中的一批，與同一試驗中施用的N-丙酰基GBMP-TT構建物相比，對天然GBMP的交叉反應顯著下降。對兩批N-丙烯酰基GBMP-TT都測試了他們對活GBM的殺菌活性，結果表明相對于N-丙酰基GBMP-TT抗血清而言有明顯的活性。這些結果總結于表1和3。在表1中的數據是重復進行的殺菌測試的結果，它與用相同材料進行的其他測試中的稀釋度是相同的。表1的數據與丙烯酰基特別具有有效殺菌活性是相符的。表3比較了兩批N-丙烯酰基GBMP-TT抗血清的殺菌活性，以及在相同的動物試驗中用N-丙酰基GBMP-TT抗血清獲得的結果。測試使用15倍的細菌，因此僅檢測出具有強活性的抗血清。從N-丙烯酰基GBMP-TT抗血清與N-丙酰基GBMP-TT抗血清的比較中可看出，殺菌活性幾乎相同。用不同的稀釋度進行被動保護研究，所有的稀釋度都顯示出明顯的清除情況，這暗示存在對小鼠的保護作用(見表1)。在不同稀釋度下與N-丙酰基GBMP-TT抗血清的比較，給出了幾乎相同的結果。在被動保護試驗中，兩批N-丙烯酰基-GBMP-TT抗血清的比較表明，兩批對小鼠的保護情況相同(在試驗誤差內)(見表3)。表1試驗RPV-1-63的總結，用于比較修飾的B類腦膜炎球菌多糖-破傷風毒素偶聯物在不同佐劑中的性能</tables>aELISA效價被定義為O.D.×稀釋度，對曲線上的3點進行平均。鹽水、明礬和RIBI是產生抗血清中所用的佐劑。b殺滅50％或90％GBM80-165所需的抗-修飾的GBMP-TT/RIBI血清的倒數稀釋度。數值被精確到+/-1稀釋度。c相對于HBSS對照而言，在抗-修飾的GBMP-TT/RIBI血清的不同稀釋度下GBM80165被清除的百分比。表2修飾的N-酰基GBMP-TT抗血清(RPV-1-63)對天然N-乙酰基GBMP抗原的交叉反應</tables>aELISA效價被定義為O.D.×稀釋度，對曲線上的3點進行平均。鹽水、明礬和RIBI是產物抗血清中所用的佐劑。bN-酰基表示作為包被抗原的同源多糖-人血清白蛋白偶聯物。cN-乙酰基表示作為包被抗原的N-乙酰基GBMP-人血清白蛋白偶聯物。表3相對于N-丙酰基GBMP-TT抗血清而言兩批N-丙烯酰基GBMP-TT抗血清保護性能的總結a抗血清是用RIBI佐劑系統產生的。b殺滅50％GBM870165所需的抗血清倒數稀釋度。注意，相對于所述的程序使用15倍數量的GBM(2600cfu/100微升)。這導致僅可測出強殺菌抗血清的殺菌活性。c相對PBS對照而言，用1∶4稀釋的各種抗血清清除GBM80165的百分比。實施例8用N-酰基修飾的GBMP-TT偶聯物進行的進一步研究按基本與上述相同的方法，合成一系列的N-酰基修飾的GBM多糖(N-丙酰基GBMP(NPr)、N-丁酰基GBMP(NBu)、N-戊酰基GBMP(NPe)和N-丙烯酰基GBMP(NAcryl))，不同點在于控制pH以限制多糖的解聚。1H和13C-NMR波譜分析可完全確定修飾后多糖的種類，而且已確定每種多糖都100％得以衍生。根據在標準柱上的SEC-H-PLC曲線，產生一系列的相同分子量(11KD)的氧化的多糖片段。所有的偶聯物都在完全相同的條件下合成。對偶聯物的比色分析得到如下的唾液酸摻入情況NPr-28％、NBu-30％、NPe-18％、NAcryl-19％。用在鹽水中吸附在氫氧化鋁上的，或者乳化在RIBI佐劑上的2微克唾液酸/偶聯物免疫小鼠。所有的偶聯物都能被小鼠很好地耐受，沒有觀察到不適的癥狀。不同抗血清對同源多糖抗原的ELISA效價總結于表1。發現產生最高效價的佐劑是RIBI系列(從N-丙酰基至N-戊酰基依次增加)，證實了以前用其他疏水性佐劑系統得到的發現。在諸如明礬之類的佐劑系統中，并沒有相應的效價增加趨勢。對免疫多糖的特異性還隨著酰基鏈(從N-丙酰基至N-戊酰基)長度的增加而提高，最明顯的是在RIBI系列中(見表2)。這個結果也與以前顯示相同趨勢的結果相符。盡管效價和特異性增加了，但是在殺菌測試和被動產生測試中對天然殺菌的活性并沒有相應增加。在50％和90％殺菌水平時，N-Pr抗血清顯示出比N-Bu和N-Pe抗血清高得多的殺菌效價(高14-25倍)。相應地，對不同稀釋度的抗血清的被動保護研究表明，與N-Pr抗血清不同(即使在1∶6稀釋度下也有明顯清除效果)，N-Bu和N-Pe只有在高濃度下才有明顯的清除效價的效果。權利要求1.一種修飾的B類腦膜炎球菌多糖，其特征在于，N-乙酰基被式(I)所示的N-酰基衍生物所取代其中，R1是含有至少一個雙鍵的C3-C4不飽和烷基。2.如權利要求1所述的多糖，其特征在于，R1有4個碳原子并且有2個非相鄰的雙鍵。3.如權利要求1所述的多糖，其特征在于，R1有4個碳原子并且有1個雙鍵。4.如權利要求1所述的多糖，其特征在于，R1有3個碳原子。5.如權利要求2所述的多糖，其特征在于，R1是CH2＝CH-CH2-CH2。6.如權利要求3所述的多糖，其特征在于，R1是CH2＝CH2-CH2。7.如權利要求1所述的多糖，其特征在于，距酰基碳原子最遠的碳原子是通過雙鍵而連接的。8.如權利要求7所述的多糖，其特征在于，R1有4個碳原子。9.如權利要求7所述的多糖，其特征在于，R1有3個碳原子。10.一種偶聯物分子，其特征在于，它具有至少一個式II多糖片段其中R2是不飽和的、具有至少一個雙鍵的酰基，而且該片段共價地連于蛋白質。11.如權利要求10所述的偶聯物分子，其特征在于，該蛋白質來自細菌。12.如權利要求11所述的偶聯物分子，其特征在于，該細菌是是腦膜炎萘瑟球菌。13.如權利要求10所述的偶聯物分子，其特征在于，該蛋白質來自細菌并選自下組破傷風毒素、白喉毒素、CRM197和腦膜炎球菌外膜蛋白(OMP)。14.如權利要求10所述的偶聯物分子，其特征在于，該多糖片段是N-酰基衍生多糖，蛋白質是破傷風毒素和DMP，以及多糖片段的分子量在約3-50千道爾頓之間。15.如權利要求10所述的偶聯物分子，其特征在于，該多糖片段是N-酰基衍生多糖，蛋白質是破傷風毒素，以及多糖片段的分子量為約10,000道爾頓。16.如權利要求19所述的偶聯物分子，其特征在于，多糖對蛋白質的摩爾比為約20多糖和1蛋白質之間。17.如權利要求20所述的偶聯物分子，其特征在于，多糖對蛋白質的摩爾比為約4-7摩爾多糖對1摩爾蛋白質。18.如權利要求10所述的偶聯物分子，其特征在于，它包含N-酰基衍生片段。19.一種偶聯物分子的疫苗組合物，其特征在于，它包含共價地連于蛋白質的B類腦膜炎球菌的不飽和的C3-5N-酰基衍生多糖。20.如權利要求19所述的疫苗組合物，其特征在于，該蛋白質組份來自細菌并選自下組破傷風毒素、白喉毒素、CRM197和腦膜炎球菌外膜蛋白。21.如權利要求19所述的疫苗組合物，其特征在于，該多糖片段是N-酰基衍生多糖，以及多糖片段的分子量在約3-50千道爾頓之間。22.如權利要求19所述的疫苗組合物，其特征在于，蛋白質組份來自腦膜炎萘瑟球菌。23.一種免疫血清，其特征在于，它含有用權利要求10所述的偶聯物免疫的哺乳動物所產生的抗體。24.如權利要求23所述的免疫血清，其特征在于，偶聯物的多糖是不飽和的C3-5N-酰基衍生多糖的片段。25.一種針對腦膜炎萘瑟球菌和大腸桿菌K1感染而免疫哺乳動物的方法，其特征在于，給該哺乳動物施用免疫有效量的權利要求19所述的疫苗。全文摘要本發明涉及化學修飾的B類腦膜炎萘瑟球菌(Neisseriameningitidis)多糖。本發明還提供了疫苗,在該疫苗中各個修飾的多糖被偶聯于蛋白質載體等。更具體地,本發明還提供了新的B類腦膜炎球菌不飽和的N－酰基衍生多糖、新的B類腦膜炎球菌不飽和的N－酰基衍生多糖偶聯物、含有共價連于蛋白質的B類腦膜炎球菌不飽和N－酰基衍生多糖片段的偶聯物分子的藥物組合物,以及這些組合物作為疫苗的用途。文檔編號A61P31/04GK1187136SQ96194582公開日1998年7月8日申請日期1996年6月7日優先權日1995年6月7日發明者H·J·詹寧斯,R·蓬尼,M·呂西耶,F·米雄申請人:加拿大國家研究院