專利名稱：一種含有小檗胺類藥物的脂質體制劑及其制備方法
技術領域：

本發明屬于藥物制劑領域，具體涉及一種含有小檗胺類藥物的脂質體制劑及其制備方法。
背景技術：
:
小檗胺是從我國中草藥 小檗屬植物中提取的一種雙芐基異喹啉類生物堿，小檗胺及其衍生物具有免疫調節，對抗心肌、腦、腎缺血，抗高血壓，抗肝、肺纖維化，降低門靜脈高壓，抗缺氧性肺動脈高壓等多種生理活性。同時具有來源廣泛、價格低廉、不良反應小且長期毒性低的特點。目前僅有小檗胺片劑上市，用于改善放、化療后的白細胞減少癥狀，其臨床升白有效率高達91.3%，相關作用機制可能在于提高造血干細胞集落因子的含量，促進骨髓造血干細胞和粒祖細胞的增殖并向粒系細胞分化(朱燦陽.小檗胺藥理作用分析[J]中國熱帶醫學，2005，5(1):109-110)。近年來的研究發現，小檗胺類藥物對多種惡性腫瘤細胞在體外有明顯的增殖抑制作用，例如白血病細胞、肝癌細胞、腹水癌細胞、宮頸癌細胞、乳腺癌細胞、胃癌細胞、骨髓瘤、前列腺癌、人鼻咽癌、黑色素瘤細胞和腦惡性膠質瘤，而且它們對正常細胞的毒性較小。這種高效低毒的潛在優勢使其逐漸成為腫瘤治療領域的研究熱點。據文獻報道，小檗胺類藥物抑制多種腫瘤細胞生長，誘導其凋亡，預防惡性腫瘤的復發和轉移的可能機制如下:(I)通過減小線粒體的跨膜電勢、激活細胞凋亡蛋白酶、抑制分子伴侶熱休克蛋白90、上調bax/bcl-2比值,下調bcr/abl基因、降低survivin基因和/或p210的的表達水平等調控介導方式；(2)抑制鈣調蛋白的活性；(3)抑制端粒酶和端粒的結合等(1、朱燦陽.小檗胺藥理作用分析[J]中國熱帶醫，2005，5(1):109-110 ;2、吳東.小檗胺抗白血病作用及其機制的體外及體內實驗研究[D]浙江大學博士學位論文，2003 ;3、WANG Guan-yu, HANGJia-wei, Li) Qing-hua et al.Berbamine induces apoptosis in human hepatoma cellline SMMC7721 by loss in mitochondrial transmembrane potential and caspaseactivation [J] Zhejiang Univ Sci B, 2007 8 (4): 248-255 ;4、張金紅，毛啟龍，許乃寒等.小檗胺衍生物EBB體內抗腫瘤作用初探[J].中草藥，1998，29(4):243-246 ； 5、張金紅，耿朝暉，段江燕等.小檗胺及其衍生物的結構對宮頸癌細胞生長增殖的影響[J]南開大學學報(自然科學)1995，9(2) 159-160 ;6、韓艷秋，武淑蘭.小檗胺下調MCF7及MCF7/ADR細胞Suivivin表達[J].中國醫師雜志，2005，7 (5):610-611 ;7、朱陵君.小檗胺與紫杉醇納米微球的構建及其體外協同抑瘤效應評價[D].南京中醫藥大學博士學位論文，2009 ;8、梁贊.小檗胺和小檗胺衍生物抗骨髓瘤細胞增殖及其機制的研究[D].浙江大學博士學位論文，2010 ;9、張金紅，段江燕，耿朝暉等.小檗胺及其衍生物對惡性黑色素瘤細胞增殖的影響[J].《中草藥》1997，28 (8):483-485 ; 10、趙勇.小檗胺誘導前列腺癌細胞凋亡及其機制的研究[D].山東大學博士學位論文，2006 ;11、唐亞林，徐筱杰，李騫等.雙芐基異喹啉類生物堿的新用途101371839A [P], 2009-2-25)。多藥耐藥性(multidrug resistance, MDR)是腫瘤化學治療面臨的一大障礙,系指腫瘤細胞對一種化療藥物耐藥的同時也對同此藥物結構無關、作用機制不同的其它藥物產生交叉耐藥的現象。目前嘗試的逆轉耐藥措施主要是開發針對P-糖蛋白等耐藥相關因子的化療增敏劑。體外研究發現某些化合物，如維拉帕米、環孢菌素A等，均可逆轉MDR，但由于其嚴重的心血管不良反應、免疫抑制及腎毒性，以及作用靶點單一、選擇性低、可能導致抗腫瘤藥毒副作用加劇等問題，致使臨床應用受到限制。因此，尋找更安全有效的多藥抗藥逆轉劑具有重要的臨床意義。近年的研究表明，小檗胺及其衍生物是一類高效低毒的多藥耐藥逆轉劑，同時具有放療增敏，減輕放、化療毒性反應等作用。其逆轉多藥耐藥性的機制可能是通過下調多藥耐藥基因致使pl70蛋白合成減少或直接抑制pl70蛋白，減少藥物外排，增加細胞內有效藥物濃度而產生作用。亦有文獻報道，當小檗胺與抗腫瘤藥物如阿霉素、表阿霉素、長春新堿、長春瑞濱、伊馬替尼等聯合應用時可逆轉腫瘤細胞對它們的多藥耐藥性，發揮協同增效作用并降低藥物劑量限制性毒性(1、韓艷秋，武淑蘭.小檗胺下調MCF7 及 MCF7/ADR 細胞 Suivivin 表達[J].中國醫師雜志，2005，7 (5):610-611 ;2、韓艷秋，袁家穎，石永進等.小檗胺逆轉K562/A02細胞耐藥性及其機制[J].《中國實驗血液學雜志》2003，11(6):604-608 ;3、韓艷秋，袁家穎，石永進等.小檗胺逆轉MCF7 /ADR細胞耐藥性及其機制探討[J].《解剖學報》2004，35 (2):161-164 ;4、田暉，潘啟超.雙芐基異喹啉類生物堿粉防己堿與小檗胺逆轉多藥抗藥性的比較研究[J].《藥學學報》1997，32
(4):245-250 ;5、董慶華，鄭樹，徐榮臻.小檗胺對多藥耐藥K562/ Adr細胞作用的研究[J].《中國中西醫結合雜志》2004，24(9):820-822 ;6、張蕾 小檗胺對慢性粒細胞白血病K562格列衛耐藥細胞株K562/G01細胞增殖抑制作用及其機制研究[M]浙江大學碩士學位論文，2008 ;7、魏艷淋.小檗胺對耐藥的人慢性粒細胞白血病細胞的體內外作用及機制的實驗研究[D]浙江大學博士學位論文，2009 ;8、齊淑玲，劉杰文，付津.鈣調素拮抗劑EBB逆轉K562/VCR細胞系多藥耐藥性的研究[J]《實驗血液學雜志》1996，4 (3):294-298 ;9、趙攀.小檗胺與STI571單獨及聯合作用誘導K562細胞凋亡的研究[M]鄭州大學碩士學位論文，2006 ;10、朱陵君.小檗胺與紫杉醇納米微球的構建及其體外協同抑瘤效應評價[D]京中醫藥大學博士學位論文，2009)。
(0005)綜上可見，小檗胺類藥物用于腫瘤的治療前景廣闊，其高效低毒、多作用靶向的優點賦予它躋身為化療一線藥物的潛力。但目前小檗胺僅 用于化療后的升白，其主要原因在于此類藥物的體內抗腫瘤活性不理想，這種體內/外間藥效的巨大差別可能源于它們較短的血液循環半衰期和在肝、腎、肺、脾等器官的集中分布，從而難以發揮抗腫瘤作用。因此，開發小檗胺類藥物的緩控釋制劑或靶向制劑對于提高其體內抗腫瘤效果、實現與其他靶向抗腫瘤藥物的聯合應用意義重大。脂質體，特別是聚乙二醇脂質衍生物修飾的長循環脂質體(又稱為PEG化脂質體)尤為適合作為靶向藥物載體，并已有Doxil 等極為成功的案例。若將小檗胺類藥物也制備為PEG化脂質體，則其和同樣裝載于PEG化脂質體中的化療藥物均能借助 EPR (enhanced permeability and retention effect)效應蓄積于腫瘤組織，并發揮協同抗腫瘤作用。此外，脂質體作為藥物載體還具有諸多優點:(I)脂質體的主要成分是磷脂和膽固醇，具有生物相容性，可生物降解、無毒性和低免疫原性；(2)脂質體的大小、磷脂成分、表面電荷等有很大的選擇空間；(3)脂質體能包裹親水性和親脂性藥物，將藥物包封入脂質體中，可保護藥物在體內不被降解，同時避免藥物對受體識別配體的干擾；(4)易獲得適宜的藥物-載體比，制備簡單；(5)脂質體可提高藥物的療效并降低其毒副作用；
(6)與固體聚合物載體系統(如微粒、納米粒)不同，脂質膜具有較好的柔性，允許表面結合的靶向分子有更大的自由度，因此靶向分子能以最優構型與靶部位受體結合；(7)脂質體可為所包裹藥物的靶向性提供了新的可能，包括細胞外釋放、細胞膜融合和內吞，提高了藥物的靶向范圍；(8)脂質體與藥物間無共價鍵連接，利于藥物在溶酶體內釋放；(9)在載藥脂質體表面結合不同的配基如抗體、糖酯等可將藥物遞送到特定靶組織和靶細胞；(10)脂質體適合多種途徑給藥。除商業化可獲得的片劑之外，目前關于小檗胺類藥物的制劑專利中僅有殼聚糖-瓊脂納米粒(201010603372.5)，但試驗數據顯示其僅能提升藥物的體外藥效。此外，未見此類藥物的脂質體專利或文獻。我們將小檗胺類藥物制備成長循環脂質體，以期提高藥物的體內抗腫瘤活性，或在與其他化療藥物合用時體現出協同增效，降低毒副作用的效用。發明內容:
本發明的目的是提供一種載有小檗胺類藥物的脂質體的處方，同時提供一種簡單易行、質量可控，便于工業化生產的脂質體制備方法。為實現上述目的，本發明提供一種載有小檗胺類藥物的脂質體的處方組成: 一種小檗胺類藥物脂質體，其含有小檗胺類藥物、磷脂、膽固醇、親水性脂質衍生物和
建立梯度物質；其中藥物和磷脂的質量比為1:5 1:100，優選為l:l(Tl:20，最優選為1:10 ;膽固醇和磷脂的質量比為1:2 1:4，優選為1:3 ;親水性脂質衍生物與磷脂的質量比為1:2 1:6。

此處所述的小檗胺類藥物為小檗胺、0-乙基-小檗胺、0- 丁基-小檗胺、0-辛基-小檗胺、0- (4-乙氧基-丁基)小檗胺、0-苯基-小檗胺、0-乙酰基-小檗胺或0-丹磺酰基小檗胺的鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽、蘋果酸鹽、草酸鹽、重酒石酸鹽或檸檬酸鹽中的一種或幾種。作為優選，選擇鹽酸小檗胺、0-(4-乙氧基-丁基)小檗胺鹽酸鹽、0-丹磺酰基小檗胺的鹽酸鹽。小檗胺類藥物脂質體處方中的磷脂可以是天然磷脂、半合成磷脂、合成磷脂或它們的衍生物及上述物質氫化產物中的一種或多種，包括大豆卵磷脂(SPC)、蛋黃卵磷脂(EPC)、氫化大豆卵磷脂(HSPC)、氫化蛋黃卵磷脂(HEPC)、磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)及其鈉鹽或磷脂酰肌醇(PI)、心磷脂(雙磷脂酰甘油，cardiolipin)、神經鞘磷脂(SM)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酸(PA)等中的一種或多種的組
八
口 o磷脂酰膽堿選自但不限于二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)、硬脂酰油酰磷脂酰膽堿、硬脂酰亞油酰磷脂酰膽堿、棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿、棕櫚酰亞油酰磷脂酰膽堿、二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿(DMPC)、二月桂酰磷脂酰膽堿(DLPC)、二癸酰磷脂酰膽堿、二辛酰磷脂酰膽堿、二己酰磷脂酰膽堿或硬脂酰花生四烯酰磷脂酰膽堿等中的一種或多種。磷脂酰乙醇胺選自但不限于二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、硬脂酰油酰磷脂酰乙醇胺、硬脂酰亞油酰磷脂酰乙醇胺、棕櫚酰油酰磷脂酰乙醇胺、棕櫚酰亞油酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蘧酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二月桂酰磷脂酰乙醇胺(DLPE)、二癸酰磷脂酰乙醇胺、二辛酰磷脂酰乙醇胺或二己酰磷脂酰乙醇胺等中的一種或多種
磷脂酰甘油及其鈉鹽選自但不限于二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)及其鈉鹽、二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)及其鈉鹽、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)及其鈉鹽、棕櫚酰油酰磷脂酰甘油及其鈉鹽、二肉豆蘧酰磷脂酰甘油(DMPG)及其鈉鹽、二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG)、二癸酰磷脂酰甘油、二辛酰磷脂酰甘油、二己酰磷脂酰甘油、雙二硬脂酰磷脂酰甘油及其鈉鹽、雙二棕櫚酰磷脂酰甘油及其鈉鹽、雙二肉豆蘧酰磷脂酰甘油及其鈉鹽或雙二月桂酰磷脂酰甘油等中的一種或多種。磷脂酰肌醇選自但不限于二硬脂酰磷脂酰肌醇(DSPI)、二棕櫚酰磷脂酰肌醇(DPPI)、二油酰磷脂酰肌醇(DOPI)、二肉豆蘧酰磷脂酰肌醇(DMPI)或二月桂酰磷脂酰肌醇(DLPI)等中的一種或多種。作為優選，本發明中的磷脂使用SPC、EPC、HEPC, HSPC, DSPC、DPPC, DSPE, DPPE 或DSPG中的一種或多種。本發明中所述的親水性脂質衍生物選自聚乙二醇與磷脂或聚乙二醇與膽固醇連接所得的聚乙二醇脂質衍生物、吐溫80、吐溫20、聚乙二醇維生素E琥珀酸酯(TPGS)或神經節苷脂中的一種或多種。聚乙二醇脂質衍生物選自但不限于聚乙二醇-留醇類衍生物如聚乙二醇-膽固醇、聚乙二醇-膽固醇琥珀酸酯(PEG-CHEMS)、聚乙二醇-膽固醇碳酸甲酯等，聚乙二醇-磷脂類衍生物如聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)、聚乙二醇-二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DPPE)、聚乙二醇-二油酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-棕櫚酰油酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-二肉豆蘧酰磷脂酰乙醇胺等，聚乙二醇-二酸甘油酯或單酯如聚乙二醇-二硬脂酰甘油、聚乙二醇-二棕櫚酰甘油、聚乙二醇-二肉豆蘧酰甘油等，聚乙二醇-脂肪酸或脂肪酸酯衍生物等如聚乙二醇-硬脂酸、聚乙二醇-棕櫚酸、芐澤、賣澤等中的一種或多種，其中聚乙二醇的分子量為10(T10000，PEG與脂質部分的連接鍵為但不限于二硫鍵、酯鍵、釀鍵、酸胺鍵等，PEG端基為但不限于輕基、竣基、氣基或含氣基團、燒氧基等。作為優選，親水性脂質衍生物選自PEG-DSPE、PEG-CHEMS、TPGS、單唾液酸四己糖神經節苷脂(GM1)或吐溫80中的一種或多種。
親水性脂質衍生物，特別是聚乙二醇脂質衍生物修飾脂質體時，親水鏈(以PEG鏈為代表)在膜表面形成的水化層可以阻止脂質體之間的相互融合聚集，降低脂質體粒徑的同時使粒徑分布趨向均一；而且PEG層的脫水作用使磷脂分子排列的更加緊密，增加藥物在脂質體內水相的滯留穩定性，提高脂質體的物理化學穩定性；PEG層的空間位阻效應亦可減弱血漿成分對脂質體的破壞或識別與吸附作用，降低單核巨噬細胞系統的攝取量，延長載藥脂質體的血液循環半衰期，提高腫瘤靶向效率，增強藥物療效并降低其毒副作用(AGabizonj D Gorenj AT Horowitz.Long-circulating liposomes for drug delivery incancer therapy:a review of biodistribution studies in tumor-bearing animals[J].Advanced Drug elivery Review.1997, 24(17):337-344) 0 但是當聚乙二醇-脂質衍生物的濃度較大時，脂質體內外膜表面致密的PEG層可能影響藥物的包封速度和程度，同時PEG分子間的相互作用可能在一定程度上限制了 PEG分子的高柔順性而影響其長循環特性，甚至有可能破壞磷脂雙分子層的穩定性(DE.0wens, N.Peppas.0psonization,biodistribution, and pharmacokinetics of polymeric nanoparticles [J].1nt JPharm 2006, 307: 93-102)。所以親水性脂質衍生物在脂質體表面的修飾比例對制劑的體內療效和穩定性影響重大。
作為優選方案，所述親水性脂質衍生物和磷脂的質量比為1: 2^1: 6，此時脂質體的粒徑較小且粒度分布均勻，包封率高達90%以上，制劑穩定性良好。本發明中所述建立梯度物質選自乙二胺四乙酸銨、硫酸銨、乙二胺四乙酸三乙胺、乙二胺四乙酸二乙胺、乙二胺四乙酸乙醇胺或枸櫞酸銨；優選為乙二胺四乙酸銨或硫酸銨。脂質體中的膽固醇具有雙向調節磷脂雙分子層流動性的作用，因此磷脂和膽固醇的比例會顯著影響脂質體的膜穩定性和藥物的裝載速度與程度。Patel等發現增加脂質體中膽固醇的含量可顯著降低肝臟的攝取，并提高骨髓的攝取(Harish M.Patel, Nilden
S.Tuzel, Brenda E.Ryman.1nhibitory effect of cholesterol on the uptake ofliposomes by liver and spleen.Biochim Biophys Acta，1983，761:142-151.)。作為優選方案，小檗胺類藥物的處方組成中膽固醇和磷脂的質量比為1:2 1:4，此時脂質體的粒徑較小且粒度分布均勻，包封率高達90%以上，制劑穩定性良好。本發明的小檗胺類藥物脂質體中還可以含有生育酚及其衍生物、蔗糖、木糖醇、海藻糖、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇中的一種或多種。本發明所述的小檗胺類藥物脂質體的制備工藝，包括以下步驟:
(a)將建立梯度物質配制為0.1(T0.30 mo I/L的水溶液，即水化介質，將水化介質加熱至50飛5 °C保溫待用；作為優選，水化介質中建立梯度物質的濃度選擇為0.15、.25 mol/L ;作為最優選，水化介質中建立梯度物質的濃度選擇為0.20 mol/L ;同時,水化介質的pH在5.5^7.5間均能獲得良好的載藥結果；
(b)以適量乙醇于5(T651:下將磷脂、膽固醇、親水性脂質衍生物以及可以選擇性加入的生育酚及其衍生物溶解，之后揮除乙醇，加入步驟(a)的水化介質，攪拌分散，得到脂質體初品，其中磷脂濃度為KTlOO g/L ；
(c)將脂質體初品過微射流儀、過擠出儀或通過探頭超聲降低粒徑，得空白脂質體；作為優選方案，特別是用于工業化生產時，選擇過微射流儀或過擠出儀的方式降低脂質體的粒徑，探頭超聲的方式適合于小批量的實驗室研究；
(d)使用透析、切向流過濾、凝膠過濾或離子交換劑處理的方法處理空白脂質體，得到梯度脂質體；作為優選的方案，使用切向流過濾或離子交換劑處理空白脂質體，以獲得梯度脂質體；這里所述的切向流設備如中空纖維透析器(膜孔徑30KD，大連化學物理研究所)，或是A/G Technology公司的中空纖維膜組件UFP-30-C-6A，30000NM, 4800 cm2 ;而離子交換劑處理是指使用離子交換樹脂、離子交換纖維、離子交換膜或電滲析裝置(EDI)將脂質體外水相的離子或分子除去。(e)將小檗胺類藥物溶液與梯度脂質體混合，于50 65°C孵育1(T30 min，得到含有小檗胺類藥物的脂質體制劑。由于工業化生產過程中各項參數出現±10%的波動是難以避免的，所以在本專利所述的處方組成和工藝參數的上限值或下限值的±10%范圍內仍將認為是本專利的保護范圍。本發明的小檗胺類藥物脂質體可以制成注射液、凍干粉針劑或其它劑型如但不限于口服液、膠囊劑 、氣霧劑、滴鼻劑、凝膠劑。
部分實施例中采用陰陽混合離子交換樹脂或交換纖維微柱離心法建立離子梯度，具有設備簡單、價格低廉、操作方便、脂質體體積變化小等優點。所述陽離子交換樹脂選自含強酸性反應基團如磺酸基-SO3H的強酸型樹脂、含較弱反應基團如羧基-COOH或酚羥基-OH的弱酸型樹脂或大孔樹脂中的一種。所述陰離子交換樹脂選自含較強反應基團如具有四面體銨鹽官能基團之一一 N+(CH3)3的強堿型樹脂、含弱酸性基團如羧基-COOH的弱堿型樹脂或大孔樹脂中的一種，兩者的體積比為0.r2.5。作為優選方案，選擇強酸型的陽離子交換樹脂如國產732型陽離子交換樹脂與強堿型的陰離子交換樹脂如國產717型陰離子交換樹脂混合除鹽建立脂質體內外水相的離子跨膜梯度，兩者的體積比為0.2 2。本發明帶來的有益結果
制備方法切實可行、質量可控，便于工業化生產；
所得小檗胺類藥物脂質體的粒徑小且分布均一、包封率高、穩定性良好； 將小檗胺類藥物制備為脂質體后可有效延長藥物的血液循環時間，提高腫瘤組織的靶向效率，增強藥物體內抗腫瘤效果，或在與其他化療藥物合用時發揮協同抗腫瘤效應及降毒并提高機體免疫力。
具體實施方式
:
所用各成分的簡稱如下:
HSPC:氫化大豆卵磷脂 DSPC: 二硬脂酰磷脂酰膽堿 EPC:蛋黃卵磷脂 SPC:大豆卵磷脂 CHOL:膽固醇
mPEG2_-CHEMS:聚乙二醇單甲醚(2000)-膽固醇琥珀酸酯 mPEG2_-DSPE:聚乙二醇單甲醚(2000)- 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 (NH4)2SO4:硫酸銨 NH4EDTA:乙二胺四乙酸銨
鹽酸小檗胺購買自成都龍泉高科天然藥業有限公司，純度約為96.2%。0- (4-乙氧基-丁基)小檗胺鹽酸鹽和0-丹磺酰基小檗胺鹽酸鹽按照文獻中的方法進行合成及表征(謝進文，浙江大學博士論文，2009，吲哚啉-2-酮和小檗胺衍生物的設計、合成及其生物活性研究)，兩者純度均約為95%。下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但這些實施例不能被理解為限制了本發明的范圍，本發明的保護范圍由權利要求書所限定，任何在本發明權利要求基礎上的改動都是本發明的保護范圍。本發明中的水化介質為乙二胺四乙酸銨溶液、乙二胺四乙酸三乙胺溶液、乙二胺四乙酸二乙胺溶液或乙二胺四乙酸乙醇胺溶液時，水化介質的濃度代表其中乙二胺四乙酸根的濃度，水化介質的PH值通過其中加入的氨水、三乙胺、二乙胺或乙醇胺的量進行控制。本發明的部分實施例采用離子交換的方法建立脂質體的跨膜梯度，具體實施手段是采用陰陽混合離子交換樹脂或交換纖維微柱離心法建立離子梯度，此方法具有設備簡單、價格低廉、操作方便、脂質體體積變化小等優點。所用的陽離子交換樹脂選自含強酸性反應基團如磺酸基-SO3H的強酸型樹脂、含較弱反應基團如羧基-COOH或酚羥基-OH的弱酸型樹脂或大孔樹脂中的一種。所用的陰離子交換樹脂選自含較強反應基團如具有四面體銨鹽官能基團之一一 N+(CH3)3的強堿型樹脂、含弱酸性基團如羧基-COOH的弱堿型樹脂或大孔樹脂中的一種。在某些具體方案中，選擇強酸型的陽離子交換樹脂如國產732型陽離子交換樹脂與強堿型的陰離子交換樹脂如國產717型陰離子交換樹脂混合除鹽建立脂質體內外水相的離子跨膜梯度。本發明中小檗胺類藥物脂質體包封率的測定方法如下:
取已制備好的小檗胺類藥物脂質體100 μ L各兩份。一份加入1.0 mL體積分數為10%的Tween-80或Triton X-100溶液破乳(檢測波長為212 nm)，用流動相稀釋至10 mL，或直接用甲醇破乳并稀釋定容至10 mL(檢測波長282 nm)，搖勻，以HPLC法測定峰面積，計算總藥量(CtJ。另一份上樣于陽離子交換樹脂柱(使用732型陽離子交換樹脂或ZB-1陽離子交換纖維，柱高均約為1.5 cm), 2000 r.mirT1離心4 min ;繼續加400 μ L重蒸水于柱的頂端，2000 r.mirT1離心4 min洗脫，連續操作4次，合并洗脫液，加入1.0 mL體積分數為10%的Tween-80或Triton X-100溶液破乳(檢測波長為212 nm)，用流動相稀釋至10 mL，或直接用甲醇破乳并稀釋定容至10 mL (檢測波長282 nm)，搖勻，以HPLC法測定峰面積，計算脂質體內藥量(Clip)。包封率根據公式EE%=Clip/CtotX 100%計算。
實施例1被動載藥法制備鹽酸小檗胺類藥物脂質體 HSPC:200 mg
CHOL:66.7 mg
mPEG2_-CHEMS:66.7 mg
將上述脂質體膜材以適量無水乙醇在65 1:水浴中加熱溶解，揮除乙醇，加入預熱至相同溫度的5 mg.ml/1的鹽酸小檗胺溶液4 mL(藥脂比為1:10, w/w)水化2(T30 min,得脂質體初品。將初品探頭超聲，超聲功率和時間為200 wX2 min +400 wX6 min，然后依次通過0.8,0.45,0.22 Mm微孔濾膜各3 5遍，即得。脂質體粒徑約100 nm，包封率小于20%。同時進行了下列處方的被動載藥試驗:
處方I
SPC:200 mg
CHOL:30 mg
mPEG2_-CHEMS:50 mg
處方2
DSPC:200 mg
CHOL:66.7 mg
mPEG2_-DSPE:66.7 mg
處方3
DPPC:200 mg
CHOL:100 mg
mPEG2_-DSPE:66.7 mg
處方4 HEPC:200 mgCHOL:20 mg
mPEG2000-CHEMS:65 mg
處方5
DSPG:200 mg
CHOL:66.7 mg mPEG2_-DSPE:66.7 mg
脂質體膜材組成見處方I至處方5，并按照本實施例的前述方法制備鹽酸小檗胺脂質體(藥脂比為1:10，w/w)，所得載藥粒徑均在95 110 nm之間，但包封率均未超過30%。使用0-(4-乙氧基-丁基)小檗胺鹽酸鹽進行相同的實驗，包封率也未超過30%。可見釆用被動載藥法難以制得高包封率的小檗胺類藥物脂質體。實施例2 pH梯度法制備鹽酸小檗胺類藥物脂質體 處方:
HSPC:200 mg
CHOL:66.7 mg
mPEG2_-DSPE:66.7 mg
按處方將脂質體膜材以適量無水乙醇在65 1:水浴中加熱溶解，揮除乙醇，加入4 mL預熱至相同溫度的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液(300 mmol L'pH4.0)水化20 30 min,得到空白脂質體初品。將初品探頭超聲，超聲功率和時間為200 wX2 min +400 wX6 min，然后依次通過0.8,0.45,0.22 Mm微孔濾膜各3飛遍，得空白脂質體混懸液。取空白脂質體混懸液1.0 mL，加入500 mmol L—1的磷酸鈉溶液調節外水相pH為
6.5，按藥脂比為1:10 (w/w)加入鹽酸小檗胺溶液，50 60 °〇恒溫孵育1(T20 min，冰水浴終止載藥，所得包封率為94.20%±1.13%、平均粒徑為142.0 nm。將藥物更換為0-丹磺酰基小檗胺鹽酸鹽，使用相同膜材和制備工藝，包封率為83.10%，粒徑 155.0 nm。可見使用pH梯度法裝載小檗胺類藥物可以取得較好的包封率，但脂質體粒徑較大。而且采用枸櫞酸梯度法制備的的脂質體粒徑較大且放置穩定性不好(脂質體在4 ± 2 °C下充氮密封放置30 d后出現混濁、絮凝沉淀和長菌等現象)。實施例3枸櫞酸銨梯度法制備鹽酸小檗胺類藥物脂質體 處方1:
HSPC:200 mg
CHOL:66.7 mg
mPEG2_-DSPE:66.7 mg
按處方將脂質體膜材以適量無水乙醇在50 1:水浴中加熱溶解，揮除乙醇，加入4 mL預熱至相同溫度的枸櫞酸銨溶液(300 mmol -T1, pH 6.5)水化20 30 min，得空白脂質體初品。將初品探頭超聲，超聲功率和時間為200 wX2 min +400 wX6 min，然后依次通過0.8,0.45,0.22 Mm微孔濾膜各3飛遍，得空白脂質體混懸液。精密移取0.2 mL空白脂質體于3 mL的陰陽混合離子交換樹脂柱上(陰:陽=2:1，v/v),同時加入0.2 mL重蒸水,停留10 30 min后,2000 rpm離心4 min,再于柱頂端加入0.1 mL重蒸水2000 rpm離心4 min,合并洗脫液,混勻,得最終磷脂濃度約為20 mg mL-1的梯度脂質體。精密移取一定量的枸櫞酸銨梯度脂質體，按藥脂比為1:10 (w/w)加入BBM溶液，50°〇恒溫孵育20 min，冰水浴終止載藥，所得脂質體的包封率為91.63%±1.17%、平均粒徑為149.2 nm。當使用相同方法裝載0- (4-乙氧基-丁基)小檗胺鹽酸鹽時，包封率為86.97%，脂質體粒徑為134 nm。實施例4硫酸銨梯度法制備鹽酸小檗胺類藥物脂質體 處方1:
SPC:200 mg
CHOL:20 mg
mPEG2000- CHEMS:100 mg 處方2:
HSPC:200 mg
CHOL:100 mg
mPEG2_- DSPE:70 mg 處方3:
HSPC:200 mg` CHOL:66.7 mg
mPEG2_-DSPE:66.7 mg 處方4:
HSPC:200 mg
CHOL:50 mg
mPEG2000-CHEMS:20 mg 處方5:
HSPC:200 mg
CHOL:66.7 mg
mPEG2_-DSPE:30 mg 處方6:
DSPC:200 mg
CHOL:66.7 mg
mPEG2_-DSPE:66.7 mg 處方7:
HSPE:200 mg
CHOL:66.7 mg
mPEG2_-DSPE:66.7 mg 處方8:
DPPC:200 mg
CHOL:66.7 mg
mPEG2_-DSPE:66.7 mg處方9:
DSPG:200 mg
CHOL:66.7 mg
mPEG2_-DSPE:66.7 mg
處方10:
DSPC:100 mg
DPPC100 mg
CHOL:66.7 mg
TPGS:30 mg
處方11:
HSPC:180 mg
DSPG20 mg
CHOL:66.7 mg
吐溫 80:30 mg
按上述各處方將脂質體膜材以適量無水乙醇在65 1:水浴中加熱溶解，揮除乙醇，加入4 mL預熱至相同溫度的硫酸銨溶液(200 mmol. ΛρΗ5.5)水化25 min，得到空白脂質體初品。將初品探頭超聲，超聲功率和時間為200 wX2 min+400 wX6 min，然后依次通過0.8、
0.45,0.22 Mm微孔濾膜各:Γ5遍，得空白脂質體混懸液。精密移取0.2 mL空白脂質體于3 mL的陰陽混合離子交換樹脂柱上(陰:陽=2:1，v/v),同時加入0.2 mL重蒸水,停留10 30 min后,2000 rpm離心4 min,再于柱頂端加入
0.1 mL重蒸水2000 rpm離心4 min,合并洗脫液,混勻,得最終磷脂濃度約為20 mg.ml/1的梯度脂質體。
精密移取一定量的硫酸銨梯度脂質體，按藥脂比為1:10 (w/w)加入鹽酸小檗胺溶液，65 1:恒溫孵育10 min，冰水浴終止載藥，所得脂質體包封率及粒徑測定結果如表I。
權利要求
1.一種含有小檗胺類藥物的脂質體制劑，其特征是含有小檗胺類藥物、磷脂、膽固醇、親水性脂質衍生物和建立梯度物質；其中藥物和磷脂的質量比為1:5 1:100，膽固醇和磷脂的質量比為1:2 1:4，親水性脂質衍生物與磷脂的質量比為1:2 1:6。
2.根據權利要求1所述的含有小檗胺類藥物的脂質體制劑，其特征在于，所述的小檗胺類藥物為小檗胺、O-乙基-小檗胺、0-丁基-小檗胺、0-辛基-小檗胺、0-(4-乙氧基-丁基)小檗胺、0-苯基-小檗胺、0-乙酰基-小檗胺或0-丹磺酰基小檗胺的鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽、蘋果酸鹽、草酸鹽、重酒石酸鹽或檸檬酸鹽中的一種或幾種。
3.根據權利要求1所述的含有小檗胺類藥物的脂質體制劑，其特征在于，所述的磷脂選自大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂、氫化大豆卵磷脂、氫化蛋黃卵磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油及其鈉鹽、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、磷脂酰絲氨酸或磷脂酸中的一種或多種。
4.根據權利要求 1所述的含有小檗胺類藥物的脂質體制劑，其特征在于，所述的親水性脂質衍生物選自聚乙二醇與磷脂或聚乙二醇與膽固醇連接所得的聚乙二醇脂質衍生物、吐溫80、吐溫20、聚乙二醇維生素E琥珀酸酯或神經節苷脂中的一種或多種。
5.根據權利要求1所述的含有小檗胺類藥物的脂質體制劑，其特征在于，所述建立梯度物質選自乙二胺四乙酸銨、硫酸銨、乙二胺四乙酸三乙胺、乙二胺四乙酸乙醇胺、乙二胺四乙酸二乙胺或枸櫞酸銨。
6.根據權利要求1所述的含有小檗胺類藥物的脂質體制劑，其特征在于，其中還含有生育酚及其衍生物、蔗糖、木糖醇、海藻糖、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇中的一種或多種。
7.制備權利要求1所述的含有小檗胺類藥物的脂質體制劑的方法，其特征在于，包括以下步驟: (a)將建立梯度物質配制為0.1(T0.30 mo I/L的水溶液，即水化介質，將水化介質加熱至50 65 1:保溫待用； (b)以適量乙醇于5(T651:下將磷脂、膽固醇、親水性脂質衍生物以及可以選擇性加入的生育酚及其衍生物溶解，之后揮除乙醇，加入步驟(a)的水化介質，攪拌分散，得到脂質體初品，其中磷脂濃度為KTlOO g/L ； (c)將脂質體初品過微射流儀、過擠出儀或通過探頭超聲降低粒徑，得空白脂質體； (d)使用透析、切向流過濾、凝膠過濾或離子交換劑處理的方法處理空白脂質體，得到梯度脂質體； (e)將小檗胺類藥物溶液與梯度脂質體混合，于50 65°C孵育1(T30min，得到含有小檗胺類藥物的脂質體制劑。
8.根據權利要求1-7任何一項所述的含有小檗胺類藥物的脂質體制劑，其特征在于:所述的脂質體與藥學上接受的賦形劑制成注射液、凍干粉針劑、口服液、膠囊劑、氣霧劑、滴鼻劑、凝膠劑。
全文摘要
本發明屬于藥物制劑領域，具體涉及一種含有小檗胺類藥物的脂質體制劑及其制備方法。所述的脂質體中，含有小檗胺類藥物、磷脂、膽固醇、親水性脂質衍生物和建立梯度物質；其中藥物和磷脂的質量比為1:5~1:100，膽固醇和磷脂的質量比為1:2~1:4，親水性脂質衍生物與磷脂的質量比為1:2~1:6。本發明的制備方法切實可行、質量可控，便于工業化生產；所得小檗胺類藥物脂質體的粒徑小且分布均一、包封率高、穩定性良好；將小檗胺類藥物制備為脂質體后可有效延長藥物的血液循環時間，提高腫瘤組織的靶向效率，增強藥物體內抗腫瘤效果，或在與其他化療藥物合用時發揮協同抗腫瘤效應及降毒并提高機體免疫力。
文檔編號A61P35/00GK103181896SQ20111045357
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月30日 優先權日2011年12月30日
發明者鄧意輝, 徐洋, 佘振南 申請人:沈陽藥科大學