專利名稱：冬凌草莖水提物、其制備方法、指紋圖譜及作為自由基清除劑的應用的制作方法
冬凌草莖水提物、其制備方法、指紋圖譜及作為自由基清除劑的應用發明領域
本發明涉及冬凌草莖用蒸餾水80°C提取制備水提物、涉及該水提物的HPLC-(-)ES1-Q-TOF-MS/MS指紋圖譜、涉及該水提物的HPLC-(+) ES1-Q-TOF-MS/MS指紋圖譜、進一步涉及該水提物作為自由基清除劑的應用。本發明屬于生物醫藥領域。
背景技術：
輻射、農藥、食物添加劑、酒精、吸煙、新陳代謝、缺氧以及激烈的運動都會使人體產生自由基。人體內的自由基主要有氧自由基、羥自由基和氮氧自由基。自由基可以引發多種疾病。例如自由基可損傷細胞膜導致細胞膜變性、可造成基因突變誘發癌癥、可激活免疫系統引起紅斑狼瘡等自體免疫疾病、可增加毛細血管脆性導致靜脈曲張和水腫、可激發各種炎癥因子釋放引起非菌性炎癥、可損傷腦細胞引起老性癡呆、可氧化血液脂蛋白造成膽固醇向血管壁沉積引起動脈硬化和和中風、可引起關節膜及關節滑液降解導致關節炎以及可損傷胰臟細胞引起糖尿病等疾病。尋找自由基清除劑是藥物研究的重要方向之一。
冬凌草(DLC),是唇形科香茶菜屬植物碎米極Rabdosia rubescens (Hemsl.) Hara的全草。冬凌草為多年生草本植物，廣泛分布于我國黃河長江流域，主產于河南濟源太行山、王屋山區一帶。因具有清熱 解毒、清咽利喉和消腫止痛功能，民間常年將冬凌草葉當作茶葉煮水飲用。在過去的30多年里，冬凌草的化學成分及藥理作用研究主要集中在葉的脂溶性部分，代表性成分為冬凌草甲素和冬凌草乙素。雖然曾經有人研究過冬凌草甲素的自由基清除活性，但是迄今沒有任何與冬凌草莖的水提物化學成分及自由基清除作用相關的研究見諸文獻。與葉相比，冬凌草莖在全草中所占的比例高很多。有效地應用冬凌草莖保護人體免受自由基損傷有重要意義。
通過長期的自由基清除劑研究積累，發明人鎖定酚酸與二萜是具有自由基清除活性的結構類型。通過生源分析發明人預測到冬凌草莖中含豐富的酚酸與二萜。按照這些認識,發明人提出本發明，用 HPLC- (-) ES1-Q-TOF-MS/MS 和 HPLC- (+) ES1-Q-TOF-MS/MS 指紋圖譜指紋圖譜揭示冬凌草莖水提物的化學成分、用自由基清除模型揭示冬凌草莖水提物的自由基清除作用。發明內容
本發明所要解決的第一個技術問題是提供一種制備冬凌草莖水提物的方法。
本發明所要解決的第二個技術問題是建立HPLC-㈠ES1-Q-TOF-MS/MS和HPLC-(+)ES1-Q-TOF-MS/MS分析方法，獲取冬凌草莖水提物的指紋圖譜以便控制冬凌草莖水提物的質量。
本發明所要解決的第三個技術問題是用由基清除模型評價冬凌草莖水提物的由基清除作用，為預防由基清除引起的疾病提供冬凌草莖水提物作為自由基清除活性高無副作用的物質。
本發明涉及冬凌草莖水提物的制備工藝，該工藝包括冬凌草莖用熱水提取、水提物過濾、濾液減壓濃縮至干、得到的干粉用HPLC-㈠ES1-Q-TOF-MS/MS和HPLC- (+)ES1-Q-TOF-MS/MS分析得指紋圖譜、得到的干粉用由基清除模型評價冬凌草莖水提物的由基清除作用。
為了進一步闡述本發明，下面給出一系列實施例。這些實施例完全是例證性的，它們僅用來對本發明進行具體描述，不應當理解為對本發明的限制。


圖1a冬凌草莖水提物在(_)ES1-Q-TOF-MS檢測的離子流指紋圖譜
圖1b冬凌草莖水提物在(+) ES1-Q-TOF-MS檢測的離子流指紋圖譜
圖2a，b冬凌草莖水提物清除DPPH自由基的作用
圖3a，b冬凌草莖水提物清除羥自由基的作用具體實施方式
實施例1冬凌草莖水提物的制備
40g干冬凌草莖自來水洗凈、涼干、切成大約Icm長的莖段、加1000_1800mL溫度為70-900C的熱蒸鎦水滲濾，優選加1200mL溫度為80°C的熱蒸鎦水滲濾。滲濾液流出的速度為10-30mL/分鐘，優選20mL/分鐘。流出液于40_60°C減壓濃縮，優選于50°C減壓濃縮，得到3g冬凌草莖水提物，為淡黃色固體。研成粉末，供后面的研究使用。
實施例2冬凌草莖水提物的HPLC-㈠ES1-Q-TOF-MS/MS指紋圖譜和HPLC- (+)ES1-Q-TOF-MS/MS 指紋圖譜
HPLC:ffaters 2795Separations Module ；
Detector:ffaters 2489Dual absorbance detector ；
Kromasil C18 (Dikma)反相柱(5_ μ m, 250_mm_X_4.6_mm)；
保護柱(5_μ m, 10_mm_X_4.6_mm)；
流動相:乙腈/水(含0.5%和0.05%冰醋酸)；
流動相流速:0.3ml/min ；
進樣量:50yL;
洗脫方式:梯度洗脫(具體梯度見表I)。
表I冬凌草莖水提 物HPLC-分析流動相梯度表a
權利要求
1.冬凌草莖水提物的制備工藝，該工藝包括將干冬凌草莖用自來水洗凈之后切碎，按I: 40 (g/mL)的比例用70-90°C的熱水滲濾，滲濾液流出的速度為10-30mL/分鐘，流出液于40-60°C減壓濃縮，得到冬凌草莖水提物干粉。
2.根據權利要求1所述的方法，其中干冬凌草莖與用于滲濾的熱水的比例為I: 30(g/mL)ο
3.根據權利要求1所述的方法，其中用于滲濾的熱水的溫度為80°C。
4.根據權利要求1所述的方法，其中滲濾液流出的速度為20mL/分鐘。
5.根據權利要求1所述的方法，其中流出液減壓濃縮的溫度為50°C。
6.權利要求1-6的任一方法制備得到的冬凌草莖水提物，其特征在于該冬凌草莖水提物減壓濃縮得到的干粉為淡黃色固體。
7.冬凌草莖水提物的HPLC-PAD/(-)ES1-MS-MS指紋圖譜。
8.冬凌草莖水提物的HPLC-PAD/(+)ES1-MS-MS指紋圖譜。
9.冬凌草莖提物作為自 由基清除劑的應用。
全文摘要
本發明涉及冬凌草莖用蒸餾水80℃提取制備水提物、涉及該水提物的HPLC-(-)ESI-Q-TOF-MS/MS指紋圖譜、涉及該水提物的HPLC-(+)ESI-Q-TOF-MS/MS指紋圖譜、進一步涉及該水提物作為自由基清除劑的應用。
文檔編號A61K135/00GK103142689SQ201110406570
公開日2013年6月12日 申請日期2011年12月7日 優先權日2011年12月7日
發明者彭師奇, 趙明, 姚興河, 唐靜成, 彭莉 申請人:彭莉