專利名稱：：一種具有生理活性的核肽復合物及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種從海產螺中提取制備天然的生理活性的核肽復合物，以及該復合物的制備方法與在醫藥方面的應用，屬于生物醫藥
技術領域：
。技術背景男性自50歲開始，隨著年齡增長睪丸代謝生理性衰退，雄激素合成功能減退，嚴重者引起中老年男性部分雄激素缺乏綜合征(PartialAndrogenDeficiencyinAgingMale,PADAM)，該綜合征的特征為身體和智力領域的變化，該改變與雄激素環境有關，并能通過調節雄激素環境加以糾正。2002年國際老年男子研究學會(ISSAM)將這一綜合征重新命名為遲發性睪丸功能減退(lateonsethypogonadismin腿les，L0H)，把這種疾病界定為發生在中老年男子的一種與年齡相關的睪丸功能減退，并得到了國際男科學學會和歐洲泌尿科學會的認同。他們認為PADAM、男性雄激素缺乏癥(ADAM)、雄激素缺乏癥或繼發性睪丸功能減退是一種癥狀群，主要臨床表現特征是(1)早期征象是性欲和勃起質量減退；(2)情緒改變伴有腦力和空間定向能力下降，容易疲勞、抑郁和易怒；(3)痩體量減少伴肌肉容積和肌力下降；(4)體毛減少和皮膚改變；(5)骨礦密度下降，引起骨量減少和骨質疏松；(6)內臟脂肪增加。上述癥狀不一定全部出現，其中某一種或幾種癥狀可能更為突出。PADAM最典型的生化特征是血清雄激素水平隨年齡老化而降低，不管是否存在基因組的敏感性降低，可出現多個器官或系統功能異常的癥狀和導致生活質量下降。雄激素中最主要的為睪丸酮，睪丸酮通過中樞神經系統和陰莖海綿體局部的作用調節性欲和勃起功能，外傷、手術或藥物去勢可導致性欲喪失和勃起功能障礙(ED)。在排除年齡、性激素結合球蛋白和雌二醇的影響后，睪丸酮有獨立的調節陰莖海綿體平滑肌松弛的作用。除了性分化和生殖器官的生長和發育外，睪丸酮對骨骼、肌肉、脂肪、情緒和認知功能、性功能、血液和心血管等器官和系統都有重要的生理作用，睪丸酮缺乏將會導致這些器官和系統功能失常，出現一系列病理生理學改變。在本發明中，PADAM、ADAM與L0H的定義表述不影響本發明的限定，換言之，本發明的內容涵蓋了用于改善和/或治療PADAM、ADAM與L0H所述的所有臨床癥狀。據統計，中國男子LOH的患病率隨年齡的增長而增高，4(T49歲約為13%，5(T69歲約為30%，70歲以上約為47%。目前，國際提倡PADAM患者進行睪丸酮補充治療，如睪丸酮的脂肪酸酯(安特爾)、甲基睪丸酮、丙酸睪酮、苯丙酸諾龍，通過外源性睪丸酮結構類似物補充提高血中睪丸酮水平，維持正常的性活動。由于涉及到不良的副作用，雄激素僅謹慎地用于治療和激素補充。事實上，雄激素通常僅用于對確診為原發性或繼發性雄激素缺失的男性進行治療。顯然，雄激素的補充治療并非理想的可供長期使用的理想治療方案。
發明內容針對現有技術的不足，本發明提供一種從海洋螺類生物組織中提取的核肽復合物，該復合物具有天然的生理活性。本發明還提供核肽復合物的制備方法及其在醫藥領域的應用。本發明技術方案如下-一種具有生理活性的核肽復合物，其特征在于，該核肽復合物是從海洋螺類生物組織中提取的，其成分包括每毫升含有無機氮820-980yg，無機磷61-85yg，不飽和脂質0.2-1.0yg，水解氨基酸100.0-180.0ug，鳥嘌呤0.15-1.12ug，次黃嘌呤2.82-7.08yg，尿嘧啶4.90-12.85ug。以上列出的各類成分為本發明核肽復合物發揮生物效應的主要物質，其余為與治療作用無關或者暫時未知的雜質成分，這部分物質的存在經過實驗證明并不會對本發明所述的治療作用帶來不良影響。優選的，上述核肽復合物中還可添加有維生素E，使維生素E在終產品中的重量百分比為0.02-0.05%。一種具有生理活性的核肽復合物的制備方法，具體步驟如下將海洋螺類生物的組織原料搗碎或粉碎，用溶劑提取，合并提取液，降溫使提取液溫度低于提取時的溫度，析出沉淀，取上層清液，濃縮去除溶劑，凈化處理，然后使用色譜柱層析分離洗脫得到核肽復合物。所述的海洋螺類生物為軟體動物門新腹足目骨螺科生物；優選脈紅螺、紅螺、骨螺、棘螺或疣荔枝螺；所述海洋螺類生物的組織為除螺殼外的全部組織，優選其中的軀干組織、肝臟組織和/或生殖器官組織。所述原料可以為新鮮狀態，也可以為冷凍狀態。在確保原料生物活性的條件下，為使原料利于生物組織粉碎，優選的原料處理溫度在0'C以下。所述的溶劑提取，提取次數不少于2次，以充分提盡所需物質。所述的溶劑提取在10-4(TC范圍內進行，以保證不破壞原料中所含成分的生物活性。例如可以在室溫狀態進行，也可在低于室溫的狀態下進行。所述的降溫使低提取液溫度低于提取時的溫度，能夠使一類極性較小的雜質析出，達到去除雜質的作用，采用降低溫度的方法，方法簡便，成本低廉，是在一系列的試驗基礎上摸索到的去除雜質的優選方法，優選的，析出沉淀的溫度控制在0-l(TC。所述溶劑提取首次提取采用高濃度醇溶液，優選的，用80—100%的乙醇提取，重復提取時采用較低濃度的醇溶液，優選的，用30—60的％乙醇提取。本發明研究發現采用不同的梯度濃度溶劑進行提取，其提取效果要優于使用相同濃度的溶劑，高濃度乙醇的溶解域較寬，第一次可提取大部分活性復合物，如果繼續用高濃度乙醇提取，提取液中活性復合物比例降低，絕大部分為雜質。從盡量減少雜質混入的角度考慮，后續提取選用低濃度乙醇繼續提取較好。優選的，所述溶劑提取步驟中溶劑調節為酸性，pH4.0—6.5為佳。這樣，一方面可保證活性復合物提取完全，另一方面盡量控制雜質混入提取液中。可以用鹽酸或有機酸調節溶劑為酸性，本發明優選采用有機酸調節提取溶劑為酸性，具體優選的有機酸為乙酸或甲酸。溶劑調節為酸性時提取效果很好，可有效去除糖類、色素、膽固醇氧化產物及其酯等雜質部分。本發明具有生理活性的核肽復合物的制備方法，所述的凈化處理分兩步，先用凈化劑與提取液以體積比(1-5):l混合，除去極性最小的一部分雜質，然后用活性炭處理，脫去色素。優選的，凈化劑選自正己烷、環己烷、石油醚之一或組合，凈化處理中活性炭用量為l-5%wt，進一步優選的，活性炭用量為2y。wt。優選的，在凈化處理后，加入維生素E，使維生素E在終產品組合物中的重量百分比為0.02-0.05%。這樣可以保護復合物在制備過程中不受氧化破壞。本發明具有生理活性的核肽復合物的制備方法，柱層析吸附材料為葡聚糖凝膠，優選的，柱層析吸附材料為葡聚糖凝膠LH20(s印hadexLH20)。該吸附材料具有樣品損失少，分離效果好的優點。本發明具有生理活性的核肽復合物的制備方法，柱層析洗脫液為醇-水復合溶劑，優選的，醇為甲醇、乙醇或丙醇，進一歩優選使用甲醇，其中，復合溶劑中甲醇與水的體積比為5:(1-5)。優選的，調節洗脫液為酸性，可以大幅度提高洗脫效率。優選用乙酸調節洗脫液為酸性。本發明具有生理活性的核肽復合物在醫藥方面的應用，其特征在于是在制備用以治療、預防、改善PADAM患者的癥狀的藥用物質中的應用。本發明的發明人在研究中老年男性部分雄激素缺乏綜合征過程中出乎意料的發現，源自海洋生物的一類核肽復合物具有強大的生理活性。這種生理活性集中體現在能夠調節機體自身有效促進血循環中雄激素，特別是雄激素中最主要的睪丸酮的釋放，通過給男性患者施予該復合物及以該復合物的制劑，可有效治療、預防、改善、抑制或減少該患者由于PADAM引起的性功能障礙、性欲減退、勃起功能障礙、性腺機能減退、少肌癥、骨質減少、骨質疏松癥、認知和情緒變化、抑郁癥、貧血、毛發脫落、良性前列腺增生或前列腺癌的癥狀。本發明提供的核肽復合物可單獨應用，也可將核肽復合物與其他藥物組合應用。還可通過采用藥學上可接受的輔料組合制成藥學上可以接受的各種制劑，如片劑、膠囊、貼劑、膜劑、凝膠劑、鼻噴劑、注射劑等。本發明具有生理活性的核肽復合物在醫藥方面的應用，可采用醫學上可以接受的任何方式，如口服、透皮吸收、注射(靜脈注射、肌肉注射、皮下注射)、黏膜吸收、腔道吸收等。在本發明中，所述的核肽復合物以單獨使用、與其他藥物聯合使用、添加輔料制成制劑的使用時，可以在治療期連續每日給藥，也可以間歇給藥。核肽復合物有效劑量以每日服用多少毫克核肽復合物來計算，一名正常體重的男性患者可采用每日劑量為10mg/天2000mg/天，給藥途徑的不同會導致給藥劑量的不同，例如注射使用的劑量比口服使用該復合物藥劑的劑量小。為了更好說明本發明核肽復合物的獨特性，對復合物的成分進行化學分析，分析數據見下表l。表ut發明提供的核肽復合物的成分分析(n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>從上表中顯示，本發明核肽復合物的構成有別于現有的所有藥物。核肽復合物中的磷、嘌呤和嘧啶反映了其中含有的核苷酸；氮、水解氨基酸反映了其中含有的蛋白成分；此外該復合物中還含有一定量的不飽和脂質。本發明提供的具有生理活性核肽復合物及其方法的優良效果在于-1.采用了溫度控制的提取設備，通過在原料預處理、提取、凈化過程溫度的調節，一方面保證了生物原料的活性不受破壞，另一方面達到了去除雜質的目的；2.所選擇的復合物凈化、精制的方法為不同方式的組合，操作簡便，且凈化效果顯著。3.采用溶劑提取和色譜層析的方法聯用，保證了原料中生物活性成分的利用完全，并且獲得純度較高的核肽復合物，顯示了極其顯著的生理性特性。4.本發明的特點還于本發明提供的核肽復合物本身并非激素，與雄激素補充療法具有本質不同；本發明核肽復合物可以顯著提高血循環中游離睪丸酮水平。具體實施方式下面通過具體實例對本發明進行闡述，但并不以任何形式限制本發明的范圍。實施例1取100g紅螺組織(軀干、肝臟、生殖器官)在冷凍狀態下搗碎，加10倍量95%乙醇提取lh，過濾，再用50%酸性乙醇攪拌提取311，過濾，合并兩次提取液，放冷，析出沉淀，傾出上層清液，濃縮，用3倍量己垸處理，棄去己烷層，下層脂蛋白層用2%活性炭純化，超濾，濃縮，操作溫度始終保持低于4(TC，加入維生素E使終濃度到0.03y。，減壓濃縮去除溶劑，得到粗品，再用s印hadexLH20柱層析分離，體積比為5:3甲醇-水復合溶劑(用乙酸調節洗脫液為酸性)洗脫得到核肽復合物。經化學分析檢測，所得到核肽復合物成分包括每毫升含有無機氮900ug，無機磷85Pg,不飽和脂質0.8yg，水解氨基酸120.0"g，鳥嘌呤O.15"g，次黃嘌呤2.82yg，尿嘧啶5.90ug。實施例2取100g脈紅螺全部組織在冷凍狀態下搗碎，加10倍量50%乙醇，用乙酸調pH值不小于4.5，在一個帶有混合攪拌功能的容器中提取2h，過濾，濃縮，放冷析出沉淀，傾出上清液，用3倍量己烷處理，棄去己烷層，下層脂蛋白層用2%活性炭純化，超濾，濃縮，操作溫度始終保持低于40°C，加入0.02%維生素E，減壓濃縮去除溶劑，得到粗品，再用s印hadexLH20柱層析分離，體積比為5:2甲醇-水復合溶劑洗脫得到核肽復合物。經化學分析檢測，所得到核肽復合物成分包括每毫升含有無機氮850yg，無機磷85ug，不飽和脂質O.5ng，水解氨基酸160.0pg,鳥嘌呤1.10ug，次黃嘌呤5.82ug,尿嘧啶10.85ug。實施例3取100g骨螺組織(軀干、肝臟、生殖器官)在冷凍狀態下搗碎，加8倍量80%乙醇，用乙酸調PH值不小于4.5，攪拌提取3h，過濾，濃縮至原體積的1/10，放冷析出沉淀，傾出上清液，用3倍量己垸處理，棄去己烷層，下層脂蛋白層用2%活性炭純化，超濾，濃縮，操作溫度始終保持低于40'C，加入0.03。/。維生素E，減壓濃縮去除溶劑，得到粗品，再用s印hadexLH20柱層析分離，體積比為5:4乙醇-水復合溶劑(用乙酸調節洗脫液為酸性)洗脫得到核肽復合物。經化學分析檢測，所得到核肽復合物成分包括每毫升含有無機氮830yg，無機磷70yg，不飽和脂質O.6pg，水解氨基酸120yg，鳥嘌呤1.0yg，次黃嘌呤7.08ng，尿嘧啶12.85iig。實施例4:實施例1的核肽復合物藥用制劑核肽復合物10mg;淀粉17mg;糖粉18mg;糊精15mg;47%乙醇適量(制軟材用)；硬脂酸鎂0.6g，制成片劑。實施例5:實施例2的核肽復合物藥用制劑核肽復合物2mg，加入0.02。/。維生素E，加入10%乙醇溶液溶解，超濾，滅菌，灌裝入2ml安瓶，-3(T-4(TC凍干，封口，制成注射凍干粉。實施例6:動物實驗例所用核肽復合物為實施例1-3獲得的產品。考察本發明提供的核肽復合物對老年大鼠睪丸酮水平的影響。取老年雄性大鼠，每日肌內注射藥物O.1rag/kg體重，給藥10天，同時取成年大鼠按照相同劑量給藥，對照組每曰按照相同劑量給予生理鹽水。用放射免疫法測定血中睪丸酮水平。在正常情況下，老年大鼠和成年大鼠的睪丸酮水平都在nmo1/1級，老年大鼠的血中睪丸酮水平約為成年大鼠正常值的十分之一。實驗見表2，結果表明在給予本發明核肽復合物后，老年大鼠的血中睪丸酮相比給藥前水平提高了10倍，達到了與成年雄鼠相當甚至更高的水平。另外試驗中令人驚喜地發現該核肽復合物并不影響正常成年大鼠的睪丸酮水平。結果提示本發明藥物可以明顯提高PADAM的血槳睪丸酮水平，這種作用與雄激素補充療法不同，是通過調節機體自身睪丸酮的釋放達到改善PAD層患者的臨床癥狀，體現了不同于已有抗PADAM藥物的獨特機理，并且服藥方便，效果顯著。同時試驗發現，該復合物安全性高，并不會影響正常動物的荷爾蒙水平。表2:核肽復合物對大鼠血漿睪丸酮水平的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權利要求1、一種具有生理活性的核肽復合物，其特征在于，該核肽復合物是從海洋螺類生物組織中提取的，其成分包括每毫升含有無機氮820-980μg，無機磷61-85μg，不飽和脂質0.2-1.0μg，水解氨基酸100.0-180.0μg，鳥嘌呤0.15-1.12μg，次黃嘌呤2.82-7.08μg，尿嘧啶4.90-12.85μg。2、一種如權利要求1所述的具有生理活性的核肽復合物的制備方法，具體步驟如下將海洋螺類生物的組織原料搗碎或粉碎，用溶劑提取，合并提取液，降溫使提取液溫度低于提取時的溫度，析出沉淀，取上層清液，濃縮去除溶劑，凈化處理，然后使用色譜柱層析分離洗脫得到核肽復合物。3、如權利要求2所述的具有生理活性的核肽復合物的制備方法，其特征在于，所述的海洋螺類生物為軟體動物門新腹足目骨螺科生物；優選脈紅螺、紅螺、骨螺、棘螺或疣荔枝螺；所述海洋螺類生物的組織為除螺殼外的全部組織，優選其中的軀干組織、肝臟組織和/或生殖器官組織。4、如權利要求2所述的具有生理活性的核肽復合物的制備方法，其特征在于，所述的溶劑提取，在10-4(TC范圍內進行，提取次數不少于2次，優選的，首次提取采用80—100%的高濃度醇溶液提取，重復提取時采用較低濃度的30—60%的醇溶液。5、如權利要求2所述的具有生理活性的核肽復合物的制備方法，其特征在于，所述溶劑提取步驟中溶劑調節為酸性，優選的pH4.06.5;可以用鹽酸或有機酸調節溶劑為酸性，優選的有機酸為乙酸或甲酸。6、如權利要求2所述的具有生理活性的核肽復合物的制備方法，其特征在于，所述的凈化處理分兩步，先用凈化劑與提取液以體積比(1-5):l混合，然后用活性炭處理，脫去色素；優選的，凈化劑選自正己烷、環己烷、石油醚之一或組合，凈化處理中活性炭用量為卜5it，優選的，活性炭用量為2%wt。7、如權利要求2所述的具有生理活性的核肽復合物的制備方法，其特征在于，在凈化處理后，加入維生素E，使維生素E在終產品組合物中的重量百分比為0.02-0.05%。8、如權利要求2所述的具有生理活性的核肽復合物的制備方法，其特征在于，柱層析吸附材料為葡聚糖凝膠，優選的，柱層析吸附材料為葡聚糖凝膠LH20(s印hadexLH20)。9、如權利要求2所述的具有生理活性的核肽復合物的制備方法，其特征在于，柱層析洗脫液為醇-水復合溶劑，優選的，醇為甲醇、乙醇或丙醇，進一步優選使用甲醇，其中，復合溶劑中甲醇與水的體積比為5:(1-5)。10、權利要求l所述的具有生理活性的核肽復合物在醫藥方面的應用，其特征在于是在制備用以治療、預防、改善PADAM患者的癥狀的藥用物質中的應用。全文摘要本發明涉及一種從海產螺中提取制備天然的生理活性復合物，以及該復合物在醫藥方面的應用，屬于生物醫藥
技術領域：
。本發明保護一種生理活性核肽復合物及其制備方法與應用，該生理活性復合物是從海洋螺類生物組織中提取，具有獨特的生理活性，可顯著提高PADAM患者血中睪丸酮的水平。文檔編號A61K38/02GK101240015SQ20081001473公開日2008年8月13日申請日期2008年3月7日優先權日2008年3月7日發明者亞斯尼,依士丘克,劉可春,契克曼·伊萬,康尼維特·娜塔麗婭,柳高夫斯卡,考米沙林科·謝爾蓋,莫伊謝耶娃·柳米拉,達特森科·卓婭,韓利文申請人:山東省科學院生物研究所