專利名稱：一種八角茴香殺線蟲提取物及其制備方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種八角茴香殺線蟲提取物及其制備方法。
背景技術：
根結線蟲(Meloidogyne spp.)為植物根系專性寄生物，是當前影響農業生產的一類重要病原物。從20世紀80年代開始，利用植物提取液防治線蟲的研究逐漸引起人們的重視，至今已報道的殺線蟲植物約有102科226屬316種，其中研究較多的有菊科、楝科、豆科、十字花科、茄科、禾本科、大戟科、罌粟科、夾竹桃科、含羞草科、百合科等，但自然界植物資源極為豐富，許多具有殺線蟲作用的植物還未被發現，《中國有毒植物》一書列入有毒植物1300 多種，其中，許多種類都具有殺蟲活性。且很多植物都可以就地取材，應用方便，效果明顯， 因此，目前國內對殺線蟲植物資源的篩選及毒殺活性測定等方面有較多研究，充分調查和挖掘出更多更有效的新殺線蟲植物種類將成為未來發展的方向。八角茴香為木蘭科八角茴香植物(Illicium verum)的果實。秋季采收，曬干入藥。 《全國中草藥匯編》描述其果實含揮發油4 9%，一般約為5%、脂肪油約22%及蛋白質、 樹膠和樹脂等。揮發油中主要成份為茴香醚(anethole)約80 90%，其余為α-萜品醇、 d-菔烯及少量甲基胡椒酚(methyl chavicol)等。其活性成分在人類醫學上應用較多，八角茴香的乙醇提取物對金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、傷寒桿菌、肺炎球菌、白喉桿菌、痢疾桿菌、大腸桿菌及一些常見致病性皮膚真菌均有較強的抑制作用。在植物醫學上的應用，只有防治貯糧害蟲和農業害蟲小菜蛾的少量研究報道，在植物根結線蟲病防治上未見報道。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種制備八角茴香無水乙醇提取物的方法。本發明提供的方法，包括如下步驟1)將八角茴香與無水乙醇混勻，得到混合物；2)將步驟1)得到的混合物進行超聲處理，即得到八角茴香無水乙醇提取物。所述八角茴香為八角茴香的果實。步驟1)中，所述八角茴香與無水乙醇的配比為IOg (45-55)ml ；步驟2)中，所述超聲的功率為300-500W，所述超聲的工作頻率為28KHz_100KHz， 所述超聲的時間為25min-35min ；所述超聲的溫度為23°C _28°C。步驟1)中，所述八角茴香與無水乙醇的配比為IOg (45,50或55)ml ；步驟2)中，所述超聲的功率為300W、400W或500W，所述超聲的工作頻率為28KHz、 45KHz或IOOKHz，所述超聲的時間為25min、30min或35min ；所述超聲的溫度為23°C、25°C 或 28°C。在步驟1)前，還包括將所述八角茴香粉碎至35目-45目大小的步驟；所述八角茴香粉碎至具體為35目、40目或45目大??；
在步驟2)后，還包括如下步驟將所述超聲處理得到的超聲產物依次經抽濾、濾液濃縮至膏狀，得到八角茴香無水乙醇提取物。由所述的方法制備的八角茴香無水乙醇提取物也是本發明保護的范圍。所述的八角茴香無水乙醇提取物在殺線蟲和/或防線蟲中的應用也是本發明保護的范圍。所述的八角茴香無水乙醇提取物在制備線蟲的生防制劑中的應用也是本發明保護的范圍。所述線蟲為根結線蟲(Meloidogyne spp.)。本發明的另一個目的是提供一種線蟲的生防制劑。本發明提供的生防制劑，其活性成分為所述的八角茴香無水乙醇提取物。所述線蟲為根結線蟲(Meloidogyne spp.)。本發明的實驗證明，本發明采用無水乙醇對八角茴香進行提取，并將提取液對根結線蟲的毒殺效果測試，結果為該提取物對根結線蟲有強的毒殺活性；說明本發明的提取物為今后根結線蟲生防制劑的開發和應用奠定基礎。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、八角茴香無水乙醇提取物的獲得高速粉碎機，6202型，北京環亞天元機械技術有限公司制造；臺式三頻數控超聲波清洗器，KQ-500VDV型，昆山市超聲儀器有限公司；旋轉蒸發儀，RE-2000型，上海亞榮生化儀器廠；體視顯微鏡，Motic SMZ-140型，麥克奧迪實業集團有限公司；微量可調移液器，GILS0N，法國；96孔一次性細胞培養板，JET BIOFIL 型，加拿大；電熱恒溫培養箱， SKP-02. 420型，黃石市恒豐醫療器械有限公司；無水乙醇(分析純)，北京化工廠；供試的八角茴香(Illicium verum)購自北京市同仁堂大藥房，屬于木蘭科，使用果實。供試根結線蟲(Meloidogyne spp.)從田間發病地塊采集番茄根結線蟲病的病根， 按照馬喆等人(兩種農藥對南方根結線蟲的室內毒力測定，北京農學院學報，2009，24(3) 17-19)介紹的方法，通過從病根上挑去卵囊和孵化獲得。1、根結線蟲二齡幼蟲懸浮液的制備從田間采集番茄根結線蟲病的病根，取產生大量根結的番茄根系，自來水輕輕沖洗干凈，用解剖針輕輕挑取病根上的乳白色卵囊，放入直徑6cm的小培養皿內，加入少量無菌水，在25°C恒溫箱中孵化3d，收集2齡幼蟲(簡稱J2)，并加入一定量的無菌水將其配制成一定濃度(500條/mL)的根結線蟲二齡幼蟲懸浮液備用。2、植物提取物的制備方法一1)粉碎將干燥的八角茴香放入高速粉碎機粉碎后過40目篩，放入密封袋中備用。2)提取
采用超聲波提取法，準確稱取粉碎好的植物干粉10g，加入無水乙醇50mL于碘量瓶中，放入超聲波發生器中，超聲功率為400W，工作頻率為45KHz，超聲的溫度為25°C，超聲處理30min后，得到八角茴香的無水乙醇提取液，經過抽濾(使用抽濾瓶和布氏漏斗，墊2 層濾紙)，然后將濾液在旋轉蒸發器內減壓濃縮至稠膏狀(八角茴香無水乙醇提取物)。進行殺蟲活性測定前，將膏狀物加水配制成濃度為20mg/mL的水溶液，然后裝入磨口棕色廣口瓶密封，置于4°C冰箱中保存備用，即為植物提取液(八角茴香無水乙醇提取物)。方法二1)粉碎與方法一基本相同，不同的是粉碎后過35目篩，放入密封袋中備用。2)提取與方法一基本相同，不同的是植物干粉10g，加入無水乙醇45mL，超聲功率為300W，工作頻率為^KHz,超聲的溫度為23°C，超聲處理25min ；得到植物提取液(八角茴香無水乙醇提取物)。方法三1)粉碎與方法一基本相同，不同的是粉碎后過45目篩，放入密封袋中備用。2)提取與方法一基本相同，不同的是植物干粉10g，加入無水乙醇55mL，超聲功率為500W，工作頻率為ΙΟΟΚΗζ，超聲的溫度為^°C，超聲處理35min ；得到植物提取液(八角茴香無水乙醇提取物)。實施例2、毒殺活性測定方法采用觸殺法測定，具體步驟為取96孔細胞培養板，每孔分別加入配好的濃度為 20mg/mL的由實施例1步驟2的方法一獲得的植物提取液150 μ L，再加入等體積的由步驟1 得到的根結線蟲二齡幼蟲懸浮液，混勻，25°C靜置，分別于12h、24h和4 后在體視顯微鏡下觀察，檢查線蟲死活(針觸法)，僵直或卷曲不動的蟲體視為死亡，按下式計算線蟲校正死亡率。以無菌水為對照，每處理重復3次，結果取平均值士標準誤。
死亡亨(。/ )_死亡線蟲數”· 夕匕亡車(/0卜供試線蟲數
^^^Φ οΛ處理組線蟲死亡率-對照組線蟲死亡率1ΛΛ
校正死IT率(％) =-, Utroijai^n 、女-X100
1 -對照組線蟲死IT率數據處理與分析實驗數據通過DPS2000分析整理，結果通過鄧肯氏新復極差多重比較法(Duncan's multiple range test,DMRT)進行差異顯著性分析。殺線蟲強弱分級標準按 Chandravadana 等(Chandravadana M V, Eugene S, Nidiry J, et al. Nematicidal activity of some plant extracts [J]. Indian J Nematol，1996，26 (2) :148-151.)的方法進行，具體分級標準為“_”表示無活性，校正死亡率< 10% ；“ + ”表示弱活性，校正死亡率為10% 30% ；“++”表示中等活性，校正死亡率為30% 50% ；“+++”表示較強活性， 校正死亡率為50% 80%;“++++”表示強活性，校正死亡率> 80%。同列數據后標有不同小寫字母表示差異顯著(ρ < 0. 05，DMRT法)，大寫字母表示差異極顯著(ρ < 0. 01，DMRT 法)。以提取物濃度為lOmg/mL處理線蟲時，八角茴香無水乙醇提取物對根結線蟲的毒殺活性結果如下處理后1 后，八角茴香無水乙醇提取物對根結線蟲的毒殺活性強度為++++，校
5正死亡率為97. 7 士 2. 30aA,處理后24h后，八角茴香無水乙醇提取物對根結線蟲的毒殺活性強度為++++，校正死亡率為98. 85士 1. Ihak,處理后4 后，八角茴香無水乙醇提取物對根結線蟲的毒殺活性強度為++++，校正死亡率為100 士 0. OOaA。從以上結果可見，八角茴香的無水乙醇提取物對根結線蟲表現出強毒殺活性，處理24h后，線蟲校正死亡率分別為98. 85% ；處理4 后，線蟲校正死亡率分別為100%。根據DPS多重比較結果也表明，八角茴香的無水乙醇提取物在0. 05及0. 01的水平上差異不顯著，均表現出強毒殺活性。采用同樣方法檢測由實施例1步驟2的方法二和方法三獲得的植物提取液，結果
與方法一無顯著差異。
權利要求
1.一種制備八角茴香無水乙醇提取物的方法，包括如下步驟1)將八角茴香與無水乙醇混勻，得到混合物；2)將步驟1)得到的混合物進行超聲處理，即得到八角茴香無水乙醇提取物。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟1)中，所述八角茴香與所述無水乙醇的配比為IOg (45-55)ml ；步驟2)中，所述超聲的功率為300W-500W，所述超聲的工作頻率為28KHz-100KHz，所述超聲的時間為25min-35min ；所述超聲的溫度為23°C _28°C。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟1)中，所述八角茴香與無水乙醇的配比為IOg (45、50或55)ml ；步驟2)中，所述超聲的功率為300W、400W或500W，所述超聲的工作頻率為28KHz、 45KHz或IOOKHz，所述超聲的時間為25min、30min或35min ；所述超聲的溫度為23°C、25°C 或 28°C。
4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于在步驟1)前，還包括將所述八角茴香粉碎至35目-45目大小的步驟；所述八角茴香粉碎至具體為35目、40目或45目大??；在步驟2)后，還包括如下步驟將所述超聲處理得到的超聲產物依次經抽濾、濾液濃縮至膏狀，得到八角茴香無水乙醇提取物。
5.由權利要求1-4中任一所述的方法制備的八角茴香無水乙醇提取物。
6.權利要求5所述的八角茴香無水乙醇提取物在殺線蟲和/或防線蟲中的應用。
7.權利要求5所述的八角茴香無水乙醇提取物在制備線蟲的生防制劑中的應用。
8.根據權利要求6或7所述的應用，其特征在于所述線蟲為根結線蟲(Meloidogyne spp. ) O
9.一種線蟲的生防制劑，其活性成分為權利要求5所述的八角茴香無水乙醇提取物。
10.根據權利要求9所述的生防制劑，其特征在于所述線蟲為根結線蟲(Meloidogyne spp. ) O
全文摘要
本發明公開了一種八角茴香殺線蟲提取物及其制備方法。本發明提供了一種制備八角茴香無水乙醇提取物的方法，包括如下步驟1)將八角茴香與無水乙醇混勻，得到混合物；2)將步驟1)得到的混合物進行超聲處理，并經過抽濾和濃縮，即得到八角茴香無水乙醇提取物。本發明的實驗證明，采用無水乙醇對八角茴香進行提取，并將提取液對根結線蟲的毒殺效果測試，結果為該提取物對根結線蟲有強的毒殺活性；說明本發明的提取物為今后根結線蟲生防制劑的開發和應用奠定基礎。本發明利用天然無害的植物材料提取殺線蟲活性物質，可減少化學農藥帶來的無污染，且提取方法簡單，在植物根結線蟲病防治上易于推廣應用。
文檔編號A61P5/00GK102283256SQ20111021403
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月28日 優先權日2011年7月28日
發明者劉正坪, 宋慶豐, 張夏蘭, 耿文龍, 蔡建波, 趙曉燕, 馬喆, 魏艷敏 申請人:北京農學院