專利名稱：腸出血性大腸桿菌感染的預防和治療的制作方法
技術領域：
本發明涉及因感染了腸出血性大腸桿菌(下文稱作EHEC)而導致的傳染性疾病的預防和治療，特別是預防和治療因EHEC O157導致的出血性結腸炎及其并發癥，如溶血性尿毒癥綜合癥和中樞神經紊亂。
在美國1982年的傳染病大流行中首次分離出了EHEC O157。自那以后，由此細菌導致的傳染病的發生率主要增長于北美和歐洲。特別是在英國和美國，這種傳染病被認為是一種需要緊急監護的“急性傳染病”，并認為針對其的預防措施是非常重要的。
EHEC感染會引起出血性結腸炎并伴隨有腹瀉和便血，有時還會導致并發癥如溶血性尿毒癥綜合征(HUS)和中樞神經系統紊亂。由EHEC產生的維羅(Vero)細胞毒素與這些疾病密切相關，因此治療EHEC感染的關鍵在于開發出一種中和維羅(Vero)細胞毒素的方法。
迄今已提出的治療EHEC傳染病的方法如下所述，有(1)使用抗菌素治療(Japanese Journal of Bacteriology，52(1)，2016，2017和2018，1997)使用抗菌素存在抗菌素抗性菌株增加的問題。據說在1996年主要發生于日本堺(Sakai)市的EHEC感染大流行中有95．9％的患者用抗菌素進行了治療。據報道在那時最廣泛使用的抗菌素是磷霉素(FOM)(使用包含84％抗菌素的FOM)。根據后來的研究，FOM不能很好地抑制Vero細胞毒素的產生。相反，FOM殺死了EHEC細胞但卻導致結合在細菌細胞上的Vero細胞毒素釋放。因此給患者服用抗菌素FOM是成問題的。(2)使用商業上可獲得的人免疫球蛋白制劑免疫球蛋白制劑已用于治療EHEC感染的患者，但它們的效果還不確定。Komiya等人(Japanese Journal of Bacteriology，52(1)，3124，1997)從5個生產廠家隨機地抽取了用于靜脈注射的13組丙種球蛋白制劑作為樣品，并測定了抗Vero細胞的細胞毒作用的中和抗體效價水平和小鼠致死毒性以觀察這些制劑是否有中和EHEC VT1或VT2的抗體。
另外，Takeda檢驗了由進口血液制成的丙種球蛋白制劑樣品中和EHEC VT1或VT2的能力。他報告說，這些制劑可中和VT1，但不能中和VT2，這對癥狀有不利影響(Newsflash of Jiji Press，2月21日，1997)。
由此可見，使用人免疫球蛋白制劑很可能對EHEC感染的治療作用很小。(3)使用牛初乳免疫球蛋白Pirro，F．等人(Veterinary Microbiology 43，131-141，1995)在德國匯集了225份牛初乳隨機樣品和40份血清隨機樣品，檢驗每份初乳和血清中是否有針對EHEC VT1或VT2的抗體。結果發現有69．3％的初乳有針對VT1的抗毒素抗體，14．7％有針對VT1和VT2的抗體。在血清中可以觀察到相同的趨勢。毒素中和抗體的同型是IgG1。由這些數據可以斷定在德國按常規飼養的牛有EHEC，因此食用被污染牛的肉和奶的人比預期的危險更高。在加拿大報道了相似的流行病學數據。
Lissner，R．等人(Infection24，No．5，44-49，1996)在德國采集了至少100頭常規飼養的牛在分娩后10小時內的初乳。通過常規脫脂并去除酪蛋白得到乳清，將其噴霧干燥，從約100kg初乳制得2-5kg乳清粉末(LactobinTM)。利用Pirro等人的方法(1995)，在體外檢測所得的乳清粉末以確定其中所含的抗體(IgG1)是否特異性中和EHEC VT1和VT2。他們發現該乳清粉末含有中和VT1和VT2的高抗體效價。Lissner，R．等人指出這一結果提醒了通過給EHEC感染的患者口服匯集乳清來減輕腹瀉和HUS病情的可能性。但是，干燥乳清能否用于治療目的還未得到實驗確證。也就是說，當給EHEC感染模型動物口服這種干燥乳清時，并不清楚其是否能預防由EHEC感染引起的死亡，是否能阻止EHEC在腸中的增生，或者是否能抑制腸中的VT1和VT2。
另外，由于分娩后初乳中的抗體效價一般隨著產生時間迅速下降，所以上述方法對于制備抗體是無效的，因此采集的時間是有限的，僅能回收小量的預期抗體。而且僅僅是具有EHEC的牛才能產生含有針對VT1和VT2的抗體的初乳，但正如Pirro，F．(1995)指出的那樣，這增加了使用可能已被EHEC污染的初乳作為原料來回收抗體時感染的危險。因此，利用上述方法所得到的乳清粉末不適合用于人的治療目的。
如上所述，還未提出治療腸出血性大腸桿菌O157感染的有效方法，這是目前的主要問題。
抗菌素療法使得維羅(Vero)細胞毒素釋放和抗茵素抗性的菌株增加。人免疫球蛋白制劑對Vero細胞毒素VT2沒有中和活性。EHEC污染的牛的初乳具有抗EHEC抗體，但是感染EHEC的危險也將增加。
本發明的目的是提供治療和預防腸出血性大腸桿菌O157感染的有效和安全的藥物組合物。
此前本發明人研制了一種利用雞蛋來大量并廉價地制備針對特定抗原的特異性抗體的方法，并應用該方法來制備針對引起哺乳的豬和腓腸的大腸桿菌病的腸產毒性大腸桿菌(ETEC)的特異性抗體。他發現所得抗體可有效地治療和預防大腸桿菌病(日本專利申請公開No．7-53669)。具體地說，用菌毛抗原(987p，K88和K99抗原)對母雞進行免疫接種，該抗原是ETEC的粘附因子，將已轉移到蛋黃中的抗體回收。由ETEC感染導致腹瀉的機理是細菌定居于腸中并在此生長，由細菌產生的腸毒素(LT，ST)使電解平衡破壞。上述方法的目的是通過利用對抗粘附因子的特異性抗體來預防和治療大腸桿菌病，粘附因子對該細菌在腸中的定居來說是必需的。
另一方面，導致出血性結腸炎、HUS或中樞神經紊亂的因素是EHEC感染中的Vero細胞毒素。與ETEC不同，在EHEC中沒有發現粘附因子。因此，通過研制能使由EHEC感染而在腸中產生的Vero細胞毒素在與靶細胞結合前被抑制的口服被動免疫接種療法而預防和緊急治療EHEC感染是有可能的。
不過，為了評定所得抗體的作用必需要有EHEC感染模型。由于常規小鼠的腸中有正常菌叢，因此小鼠不能僅通過口頭接種EHEC培養物而感染EHEC。當小鼠預先用硫酸鏈霉素和絲裂霉素C進行處理，它們就可通過口服接種而感染EHEC并顯示出臨床癥狀如嗜睡，失重，四肢麻痹，和因感染死亡。不過，用這些物質進行預處理不適于檢測藥物的效能，因為其可能影響生物保護系統。
本發明人已發現，給無菌小鼠口服接種EHEC培養物可不需預處理就可感染上EHEC并產生致死狀況，并已開發出適于評定用于預防或治療EHEC感染的藥物的效能的EHEC感染模型。本發明人基于此發現，利用這樣的感染模型完成了本發明，所說的發現是接種了滅活EHEC的母雞產的蛋含有足夠能中和維羅(Vero)細胞毒素的抗體，在預防和治療EHEC感染中是有效的。
本發明提供了一種用于預防或治療由腸出血性大腸桿菌引起的傳染病的藥物組合物，其含有作為活性成分的特異性抗體，該抗體是由以腸出血性大腸桿菌細胞或由EHEC產生的Vero細胞毒素的類毒素作為抗原進行了免疫接種的母雞產的蛋制得的。本發明還提供了一種含有作為添加劑的上述抗體的食品。在優選的實施方案中，本發明提供了用于預防或治療腸出血性大腸桿菌O157的藥物組合物，其含有作為活性成分的特異性抗體，該抗體是由以腸出血性大腸桿菌O157的滅活細胞作為抗原進行了免疫接種的母雞產的蛋制得的。該特異性抗體能夠凝集特定的大腸桿菌O157細胞并具有中和由該細菌產生的維羅(Vero)毒素的活性。
從接種了EHEC細胞的母雞產的蛋得到的上述抗體可與至少一種選自乳酸細菌和雙歧細菌的細菌一起用于預防或治療由EHEC，特別是EHEC O157引起的傳染病。
為了生產針對EHEC的特異性抗體，給母雞接種抗原。用于給母雞接種的抗原包括通過培養EHEC如EHEC O157 T001，T002，T003，T004和T005并向該培養物中加入福爾馬林而得到的滅活細胞。另一方面，將多粘菌素B加入細胞懸液(1×1010-1×1011CFU／ml)(PBS，pH7．2)中使細胞溶解得到類毒素抗原，從該細胞中提取Vero細胞毒素并向Vero毒素中加入福爾馬林以制備可用的類毒素。
利用合適的途徑如皮下或肌內注射給母雞接種抗原可以使母雞對抗原產生免疫。優選合適的佐劑與抗原一起給藥以增強免疫作用。用于這一目的的佐劑是弗氏完全(不完全)佐劑(Difco)，霍亂毒素BB(Sigma)，Titer Max(CytRx Corp．)等。
抗原的劑量根據抗原和佐劑的類型以及給藥途徑而定，以這樣的給藥方式可以使母雞產生免疫，而母雞中的抗原不會產生過量毒性。
通常，在接種(初次免疫接種)后的幾周內，母雞變得對抗原敏感，即對抗原免疫了。針對抗原的特異性抗體在母雞體內生成，母雞產的蛋，特別是蛋黃中含有特異性抗體。
在對母雞初次接種了抗原后，為了維持母雞體內的高抗體效價可以給其服用一種或多種合適劑量濃度的加強劑量。
母雞和雞蛋中針對抗原的特異性抗體的存在和效價水平可以用免疫學分析領域中的技術人員熟知的任何方法進行確認，如ELISA或利用凝集反應的方法。
抗維羅毒性抗體的效價可以用Pirro等人(1995)的方法，利用Vero細胞的懸液進行測定。當確認了免疫后的母雞產的蛋中存在足夠效價的特異性抗體之后，收集這些雞蛋并分離出預期抗體。
本發明的特異性抗體可以用整個雞蛋或蛋黃制備。大多數抗體包含在蛋黃中，通常將蛋黃分離出來用于制備抗體，在某些情況下也可使用整個雞蛋。
整個雞蛋或蛋黃可以不經分離即使用。另一方面，也可將整個雞蛋或蛋黃進行分離或精制，例如，可以用合適的方法進行脫脂如利用鄰苯二甲酸羥丙甲基纖維素、聚乙二醇等將蛋黃中的脂質成分除去。如果需要，還可以任何已知的方法進行進一步純化，包括已知的蛋白質純化方法如用硫酸銨或硫酸鈉進行鹽析，或用冷乙醇沉淀等。
未經分離或經過分離或純化的整個雞蛋或蛋黃可直接使用或進行加工。在優選的實施方案中，將整個雞蛋或蛋黃攪拌或勻化成乳液并用常規技術如噴霧干燥或冷凍干燥法干燥成粉末。因此，根據不同目的可以使用不同形式的抗體。
即使將EHEC整個細胞用作抗原，所得對EHEC有特異性的抗體也具有足夠中和Vero細胞毒素的活性。而且，利用EHEC感染模型動物進行的實驗也證明了這一點，即給模型動物口服本發明的特異性抗體使得腸中的EHEC細胞的數量減少了，且抑制了Vero毒素的產生，因此降低了死亡率。
當將由雞蛋得到的針對EHEC的特異性抗體與至少一種選自乳酸細菌和雙歧細菌的細菌一起口服給藥時可以得到對EHEC感染的更好的保護作用。對于乳酸細菌的給藥來說，Ogawa等人(JapaneseJournal of Bacteriology 52(1)，ppl57，2006(1997))和Koga等人(Japanese Journal of Bacteriology52(1)，pp301，3126(1997))報道說，乳酸細菌在某種程度上抑制了EHEC的生長并具有中和Vero細胞毒素的活性，并提出這是由于乳酸細菌產生了有機酸如乙酸或乳酸所致。不過，當乳酸細菌與本發明的特異性抗體一起使用時是不可能出現顯著功效的。
因此，本發明的特異性抗體可用于預防和治療EHEC感染，并可用作預防EHEC感染的食品的添加劑，可單獨使用或與乳酸細菌和／或雙歧細菌結合使用。
用于本發明的乳酸細菌的實例包括嗜酸乳桿菌，乳乳桿菌，保加利亞乳桿菌，干酪乳桿菌，糞腸球菌，尿腸球菌等。用于本發明的雙歧細菌的實例包括短雙歧桿菌，雙歧雙歧桿菌，嗜熱雙歧桿菌，長雙歧桿菌，嬰兒雙歧桿菌，青春雙歧桿菌等。
當本發明的特異性抗體用于預防或治療傳染病時，該抗體可以含有抗體和藥學上可接受的載體或稀釋劑的藥物組合物的形式常規給藥。在藥物組合物的制備中，可以加入解酸藥(如碳酸氫鈉，碳酸鎂，沉淀碳酸鈣，或偏硅鋁酸鎂)。該藥物組合物可以用任何已知方法進行制備。
用于預防或治療傳染病的藥物組合物可通過口服途徑給藥。本發明抗體的劑量可根據用法、目的和癥狀輕重而定。當抗體用于預防EHEC感染時，優選每天服用0．25-20．0mg／kg純抗體。在治療由EHEC引起的傳染病時，優選服用1．25-125mg／kg純抗體。當選用乳酸細菌和雙歧細菌與抗體一起給藥時，它們優選以每天107-1010可存活細胞的量給藥。
當本發明的抗體用作預防EHEC感染的食品的添加劑時，該抗體以純抗體計，以0．01-0．1wt％，優選以0．05wt％(食品)的量加入食品中。乳酸細菌和雙歧細菌可以每1克食品106-109個的量加入食品中。實施例1該實施例說明了用免疫后的母雞的蛋制備含有特異性抗體的雞蛋粉末。滅活抗原的制備從EHEC患者的腹瀉糞便中分離出EHEC T001，并接種于201Tripticase大豆肉湯中。有氧培養18小時后，以3％(培養物)的量向該培養物中加入福爾馬林以滅活細胞。確認培養物中的細胞已滅活后，將該培養物以12，000×g的速度離心20分鐘，并用PBS(pH7．2)洗滌3次，得到用于免疫接種的抗原。免疫接種用PBS將滅活的細胞調整到含有1010-1011CFU／ml，并與油性佐劑混合制備免疫原。將該免疫原注射入16-18周大的白萊亨(White Leghorn)雞的胸肌，每次注射0．5ml(初始注射)。初始接種8周后，以相同的方式相同的劑量用相同的免疫原注射作為增強劑量給藥。
如下所述，利用96孔微量滴定板測定蛋黃的抗體效價。將每個雞蛋的蛋黃與蛋白分離，向蛋黃中加入重量相等的PBS。向該混合物中加入等體積的氯仿，然后進行振搖。該混合物離心后，分離上清液(水溶部分)作為測定抗體效價的樣品。向每0．25ml連續兩倍稀釋的樣品的PBS稀釋物中加入已調節到在560nm處具有O．D．值0．45的用于凝集反應的等體積抗原，該混合物進行振搖。將微量滴定板的表面密封后，在37℃進行敏化2小時。將該微量滴定板在4℃放置約18小時并評定凝集的出現。凝集抗體效價用相應的顯示出完全凝集的樣品的最高稀釋度來表示。增強劑量注射后兩周，從每只母雞獲取的樣品的抗體效價為1280-5120，此時開始收集雞蛋。用蛋黃制備抗體將免疫的雞蛋清洗并消毒后，將蛋黃與蛋白分離開，將多個雞蛋的蛋黃合并，分成每8kg一組，并儲存于-20℃以下直到使用。如下進行純化向作為起始物質的7．5kg蛋黃中加入10倍量(重量)的蒸餾水以引起脫脂。向上清液中加入硫酸銨以產生40％飽和度。將該混合物攪拌并離心得到小丸。將該小丸溶于鹽水，在溶解和振搖的同時，在-20℃下逐漸加入乙醇使產生50％終濃度。在4℃離心后，將小丸溶于鹽水并過濾去除細菌，并冷凍干燥。結果，用7．5kg蛋黃得到了約15g淺黃白色粉末。抗體的回收率為50％，IgG的純度為95％，含水量為2％。實驗1該實驗是為了研究蛋黃抗體粉末抑制Vero細胞毒素(VT1，VT2)的能力。利用Pirro等人(1995)的方法，如下進行某些改進后測定抑制Vero細胞毒素的能力。將1g抗體粉末溶于10ml無菌蒸餾水中，然后用PBS制成連續兩倍稀釋的溶液。向每孔中加入等體積的已調整到具有10 CD50毒素單位的維羅細胞毒素，在37℃下敏化60分鐘。然后向每孔中加入已調整到含有5×104細胞的維羅細胞懸液，在CO2恒溫箱中，在37℃下孵育96小時。用顯示出細胞毒素抑制作用的相應最高稀釋度來表示抗毒素抗體效價。
蛋黃抗體粉末對VT1的中和抗體效價為2560，對VT2的為640。凝集抗體效價為20480。因此，所制得的蛋黃抗體粉末可中和兩種類型的Vero細胞毒素并可凝集細胞。實驗2在本實驗中研究與細菌培養物混合的蛋黃抗體，以及其結合物用于無菌小鼠的EHEC感染模型時的功效，該無菌小鼠已口服接種了EHEC培養物使其感染。將這些小鼠分成4組，每組由10只4周大的無菌BALB／c雄性小鼠組成。在第I組中，每只小鼠口服溶于10ml無菌蒸餾水的1g從蛋黃制得的抗體粉末。第II組中的每只小鼠口服通過在37℃下在Briggs肝肉湯中培養18小時得到的人嗜酸乳桿菌(JCM1028)，短雙歧桿菌(JCM1192T)，和雙歧雙歧桿菌(JCM1209)的混合細菌培養物。第III組中的每只小鼠口服上述抗體溶液和混合培養物的1∶1混合物。第IV組中的每只小鼠口服無菌Briggs肝肉湯。每只小鼠每天的給藥量為0．5ml，一天一次，連續三天。
抗體或其他物質首次給藥3小時后，用1×107CFU的EHEC T001(O157；H7)激發每只小鼠。激發后7天內觀察臨床應答。將仍存活和快死的小鼠處死。檢測每只小鼠結腸中EHEC細胞的數目并利用測定維羅細胞毒素的試劑盒檢測維羅毒素的存在。
表1顯示了給藥組和對照組中小鼠結腸中細胞的數目，出現的維羅細胞毒素，四肢麻痹情況(％)，以及死亡率。將給藥組與對照組進行比較，III組(給予從雞蛋制得的抗體和細菌的混合培養物的結合物)的功效最高，I組(從雞蛋制得的抗體)有相當高的功效。II組的功效較低。
值得注意的是，在第III組中，盡管結腸中的EHEC未完全消除，但只檢測到少量Vero細胞毒素。相信這是因為本發明的蛋黃抗體可有效地防止臨床癥狀(四肢麻痹)并降低死亡率。
由于在該實驗中所用的從蛋黃制得的抗體粉末在體外中和了維羅細胞毒素，因此可以認為小鼠體內由EHEC的生長產生的Vero細胞毒素通過服用抗體得到了中和。另一方面，有報道說乳酸細菌在某種程度上具有在體外和體內抑制EHEC生長和抑制維羅細胞毒素的活性。但是，從表1中可以看出，混合細菌培養物本身的作用不足。而混合培養物和本發明的特異性抗體的結合物可遏止因感染EHECO157引起的疾病，并顯著降低小鼠的死亡率。
表1在感染EHEC的小鼠中蛋黃抗體和混合細菌培養物的作用
由此可清楚地看出，用EHEC的整個細胞或其維羅毒素的類毒素作為抗原對母雞進行免疫接種，用其產的蛋制得的特異性抗體在預防或治療EHEC感染，特別是EHEC O157感染中是有效的。該特異性抗體是利用雞蛋制備的，因此可通過簡單的方法來大量并廉價地生產特異性抗體，且所得的蛋黃抗體是安全和沒有副作用的。
權利要求
1．一種用于預防或治療由腸出血性大腸桿菌引起的傳染病的藥物組合物，包含作為活性成分的針對腸出血性大腸桿菌的特異性抗體，和藥學上可接受的載體或稀釋劑，該抗體是用以整個腸出血性大腸桿菌細胞或由該細菌產生的Vero毒素的類毒素作為抗原進行了免疫接種的母雞產的蛋制得的。
2．一種用于預防或治療由腸出血性大腸桿菌O157引起的傳染病的藥物組合物，其包含作為活性成分的針對腸出血性大腸桿菌O157的特異性抗體和藥學上可接受的載體或稀釋劑，該特異性抗體是用以腸出血性大腸桿菌O157的滅活細胞作為抗原進行了免疫接種的母雞產的蛋制得的，其能夠特異性凝集該細菌細胞并具有抑制該細菌產生的維羅細胞毒素的活性。
3．一種用于預防或治療由腸出血性大腸桿菌引起的傳染病的藥物組合物，其包含(a)針對腸出血性大腸桿菌的特異性抗體，(b)至少一種選自乳酸細菌和雙歧細菌的細菌，和(c)藥學上可接受的載體和稀釋劑，該抗體是用以整個腸出血性大腸桿菌細胞或由該細菌產生的Vero毒素的類毒素作為抗原進行了免疫接種的母雞產的蛋制得的。
4．按照權利要求3的藥物組合物，其中的腸出血性大腸桿菌是腸出血性大腸桿菌O157。
5．一種用于預防由腸出血性大腸桿菌引起的傳染病的食品，其含有針對腸出血性大腸桿菌的特異性抗體，該抗體是用以整個腸出血性大腸桿菌細胞或由該細菌產生的Vero毒素的類毒素作為抗原進行了免疫接種的母雞產的蛋制得的。
6．一種用于預防由腸出血性大腸桿菌引起的傳染病的食品，其含有針對腸出血性大腸桿菌的特異性抗體，和至少一種選自乳酸細菌和雙歧細菌的細菌，該抗體是用以整個腸出血性大腸桿菌細胞或由該細菌產生的Vero毒素的類毒素作為抗原進行了免疫接種的母雞產的蛋制得的。
7．按照權利要求5或6的食品，其中的腸出血性大腸桿菌是腸出血性大腸桿菌O157。
全文摘要
本發明提供了一種用于預防或治療由腸出血性大腸桿菌引起的傳染病的藥物組合物,和用于預防該疾病的食品。該組合物包含作為活性成分的針對腸出血性大腸桿菌的特異性抗體,該抗體是用以整個腸出血性大腸桿菌細胞或由該細菌產生的維羅(Vero)毒素的類毒素作為抗原進行了免疫接種的母雞產的蛋制得的。至少一種選自乳酸細菌和雙歧細菌的細菌可以與上述抗體一起給藥。
文檔編號A61K39/40GK1203819SQ9810888
公開日1999年1月6日 申請日期1998年4月23日 優先權日1998年4月23日
發明者兒玉義勝, 橫山英明, 古賀泰裕, 田中和生, 相場勇志 申請人:株式會社源