專利名稱：一種具有防治卵巢功能早衰作用的組合物及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種組合物，具體涉及一種具有防治卵巢功能早衰作用的組合物及其制備方法和應用。
背景技術：
卵巢早衰是指是指女性40歲前由于卵巢內卵泡耗竭或醫源性損傷導致卵巢功能衰竭，以低雌激素及高促性腺激素為特征，病因學研究發現此病與自身免疫、染色體異常、促性腺激素及受體異常、放射線等密切相關。現有技術中治療卵巢早衰常用的激素類藥物，不良反應較大，中醫在治療卵巢早衰方面具有獨特的優勢，認為該病以腎虛為主，肝郁、脾 虛、氣血失調也是此病的重要病機。目前，尚沒有資料顯示二至丸和雞腰子的中藥組合臨床上用于治療卵巢功能早衰；因此，很有必要在現有技術的基礎上研發出一種具有更好防治卵巢早衰功效，且不良反應低的中藥組合物。

發明內容
發明目的本發明的目的是為了解決現有技術的不足，提供一種具有防治卵巢功能早衰作用的組合物，本發明另一個目的是提供具有防治卵巢功能早衰作用制劑的制備方法。技術方案為了實現以上目的，本發明采取的技術方案為一種具有防治卵巢功能早衰作用的組合物，它是由以下重量份數的原料制成女貞子2(Γ50份、墨旱蓮3(Γ50份、雞腰子10 60份。作為優選方案，以上所述的具有防治卵巢功能早衰作用的組合物，它是由以下重量份數的原料制成女貞子3(Γ40份、墨旱蓮3(Γ40份、雞腰子20 40份。本發明提供的具有防治卵巢功能早衰作用制劑的制備方法，其包括以下步驟(I)按重量份數比例取墨旱蓮，加6至12倍重量的水，煎煮I至3次，每次I至2小時，合并煎液，過濾，濃縮，濃縮液中加乙醇使乙醇的濃度達60%飛5%，靜置24小時，過濾，取上清液，減壓濃縮至稠膏，真空干燥，得墨旱蓮提取物；(2)取步驟(I)制備得到的墨旱蓮提取物，于女貞子、雞腰子混合均勻，粉碎成細粉；(3)取步驟(2)制備得到的細粉與藥學上可接受的載體制備成丸劑、顆粒劑、膠囊劑或片劑劑型的藥物。本發明在制成片劑時把有效成分細粉添加載體乳糖或玉米淀粉，需要時加入潤滑劑硬脂酸鎂，混合均勻，然后壓片制成片劑。在制成膠囊劑時，把有效成分細粉添加載體乳糖或玉米淀粉混合均勻，整粒，然后裝膠囊制成膠囊劑。本發明在制成顆粒劑時，把有效成分細粉和稀釋劑乳糖或玉米淀粉混合均勻，整粒，干燥，制成顆粒劑。
作為優選方案，以上所述的具有防治卵巢功能早衰作用的組合物在制備防治卵巢功能早衰藥物中的應用。有益效果本發明提供的具有防治卵巢功能早衰作用的組合物和現有技術相比具有以下優點(I)本發明提供的具有防治卵巢功能早衰作用的組合物，根據卵巢功能早衰的發病機制，在中醫藥理論的指導下，辨證論治通過大量實驗篩選中藥組方，實驗結果表明，本發明提供的組合物，可以明顯提高卵巢功能早衰小鼠的發育中卵泡數、成熟卵泡數和黃體數，提高血清E2水平，并且能抑制卵巢功能早衰小鼠的卵巢PI3K和akt的表達，顯示出了比二至丸(女貞子和墨旱蓮)更好的抗卵巢功能早衰的功效，并且實驗過程中未發現不良反應，臨床應用安全。
(2)本發明提供的具有防治卵巢功能早衰作用的組合物，可以方便和藥學載體制備成多種劑型，臨床上服用方便，且實驗結果表明本發明提供的組合物，療效可靠，使用安全，長期服用無毒副作用。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例II、一種具有防治卵巢功能早衰作用的組合物，它是由以下重量份數的原料制成女貞子50份、墨旱蓮50份、雞腰子40份。2、具有防治卵巢功能早衰作用制劑的制備方法，其包括以下步驟(I)取墨旱蓮50份，加12倍重量的水，煎煮3次，每次2小時，合并煎液，過濾，濃縮至相對密度I. 10左右，濃縮液中加乙醇使乙醇的濃度達60%，靜置24小時，過濾，取上清液，減壓濃縮至稠膏，真空干燥，得墨旱蓮提取物；(2)取步驟(I)制備得到的墨旱蓮提取物，加入女貞子50份、雞腰子40份混合均勻，粉碎成細粉；(3)取步驟(2)制備得到的細粉加煉蜜適量，加水稀釋，作為粘合劑，制丸，干燥，即得。實施例2I、一種具有防治卵巢功能早衰作用的組合物，它是由以下重量份數的原料制成女貞子50份、墨旱蓮50份、雞腰子50份。2、具有防治卵巢功能早衰作用制劑的制備方法，其包括以下步驟(I)取墨旱蓮50份，加10倍重量的水，煎煮2次，每次3小時，合并煎液，過濾，濃縮至相對密度I. 10左右，濃縮液中加乙醇使乙醇的濃度達60%，靜置24小時，過濾，取上清液，減壓濃縮至稠膏，真空干燥，得墨旱蓮提取物；(2)取步驟(I)制備得到的墨旱蓮提取物，加入女貞子50份、雞腰子50份混合均勻，粉碎成細粉；(3)取步驟(2)制備得到的細粉，加60%乙醇適量，作為粘合劑，制粒，干燥，整粒，壓片，即得片劑。實施例3I、一種具有防治卵巢功能早衰作用的組合物，它是由以下重量份數的原料制成女貞子20份、墨旱蓮30份、雞腰子10份。2、具有防治卵巢功能早衰作用制劑的制備方法，其包括以下步驟(I)取墨旱蓮30份，加10倍重量的水，煎煮2次，每次2小時，合并煎液，過濾，濃縮至相對密度I. 10左右，濃縮液中加乙醇使乙醇的濃度達60%，靜置24小時，過濾，取上清液，減壓濃縮至稠膏，真空干燥，得墨旱蓮提取物；(2)取步驟(I)制備得到的墨旱蓮提取物，加入女貞子20份、雞腰子10份混合均勻，粉碎成細粉； (3)取步驟(2)制備得到的細粉，加60%乙醇適量，作為粘合劑，制粒，干燥，整粒，即得顆粒劑。實施例4I、一種具有防治卵巢功能早衰作用的組合物，它是由以下重量份數的原料制成女貞子30份、墨旱蓮30份、雞腰子20份。2、具有防治卵巢功能早衰作用制劑的制備方法，其包括以下步驟(I)取墨旱蓮30份，加12倍重量的水，煎煮2次，每次I小時，合并煎液，過濾，濃縮至相對密度I. 10左右，濃縮液中加乙醇使乙醇的濃度達60%，靜置24小時，過濾，取上清液，減壓濃縮至稠膏，真空干燥，得墨旱蓮提取物；(2)取步驟(I)制備得到的墨旱蓮提取物，加入女貞子30份、雞腰子20份混合均勻，粉碎成細粉；(3)取步驟(2)制備得到的細粉，加60%乙醇適量，作為粘合劑，制粒，干燥，整粒，裝膠囊制成膠囊劑。實施例5藥理學實驗I實驗材料I. I藥物與試劑戊酸雌二醇片，拜耳醫藥保健廣州分公司；E2檢測試劑盒，美國R&D公司；PI3K，akt抗體購自Bioworld ;受試藥物本發明實施例I制備所得的丸劑，二至丸(蒸女貞子50份、墨旱蓮50份)由江蘇省中醫院制劑部提供。I. 2實驗動物Balb/c小鼠，雌性，由蘇州工業園區愛爾麥特科技有限公司提供，動物許可證號SCXK(蘇)2009-0001。I. 3儀器TP1020自動脫水機和RM2235型石蠟切片機均為德國LEICA公司產品；CS-VI型攤片烤片機湖北孝感宏業醫用儀器有限公司；TiSSUe-TekTEL組織包埋中心，日本SAKURA公司產品；LEICADM1000光學顯微鏡，德國Leica公司產品；隔水式電熱恒溫培養箱上海市躍進醫療器械一廠；微波爐，TCL有限公司；MiniSee圖像采集系統。2、實驗方法2. I各實驗組對放射致卵巢早衰小鼠的影響取Balb/c雌性小鼠60只，6-8周齡，適應性飼養I周后，隨機分為5組，即正常對照組、模型組、戊酸雌二醇組(O. 015mg/kg)、二至丸組(7. 8g/kg)和本發明實施例I制備得到的組合物(5.9g/kg)。除正常對照組外，其余各組小鼠均采用6tlCo Y射線照射造模，照射總量為O. 5Gy，總劑量為O. 5Gy，照射率60cGy/min，照射野20cmX 20cm，距離80cm，照射后在無特殊致病原(SPF)級條件下飼養。照射后第二天，各組小鼠分別灌胃給予相應藥物，每日I次，共28日。正常對照組和模型組給予等體積蒸餾水(10ml/kg)。末次給藥后lh，各組小鼠眼眶后靜脈叢取血，離心，取血清測雌二醇水平。同時取部分卵巢固定，常規取材，脫水，石蠟包埋，制片，染色，封片，在光學顯微鏡下閱片，計數卵巢中各種卵泡和黃體的數量；部分卵巢固定用于免疫組織化學檢測卵巢PI3K表達。2. 2血清E2水平測定血清E2水平測定采用ELISA法，測定方法嚴格按照試劑盒說明書。2. 3卵巢PI3K和akt表達檢測采用免疫組化方法測定模型小鼠卵巢PI3K和akt表達。小鼠取血后處死，取 出卵巢，盡量分離脂肪組織，用中性福爾馬林固定24h后，逐級酒精脫水，二甲苯透明、浸蠟，石蠟包埋，常規切片4μπι，45τ水浴中撈片，80°C烤箱烤片，40min。采用快速免疫組化方法檢測小鼠卵巢PI3K表達。石蠟切片脫蠟水化，微波中檔抗原修復10分鐘。自然冷卻，用PBS液(O. 01mol/LPH7. 4)沖洗3次X2min。正常山羊血清封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加抗體，37°C孵育I小時。PBS沖洗，2分鐘X 3次。滴加即用型快速免疫組化MaxVisionTM 二抗，37°C或室溫孵育10至15分鐘。PBS沖洗，2分鐘X 3次。滴加新鮮配制的顯色劑(DAB)3至5分鐘，顯微鏡下觀察。自來水充分沖洗，蘇木素復染，自來水沖洗返藍。梯度酒精脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。免疫組化標記結果各種蛋白陽性細胞以胞漿胞膜呈棕黃色為主，陰性不著色。2. 4統計學處理結果采用又±S表示，樣本統計分析采用獨立樣本t檢驗。3、實驗結果3. I本發明提供的組合物對放射致卵巢早衰小鼠一般情況的影響所有采用照射造模后動物均精神萎靡、活動明顯減少，脫毛，體重下降約2. (Γ4. Og，但各組小鼠均無死亡，灌胃本發明實施例I組合物I周后上述癥狀逐漸好轉，體重逐漸增加，恢復正常生長狀態。3. 2本發明提供的組合物和其它各實驗組對放射致卵巢早衰小鼠卵巢組織病理的影響，具體實驗如表I所示表I中藥組合物對放射致卵巢早衰小鼠卵巢組織病理的影響(文士S, n=10)
,—卵泡總數發育中卵泡成熟卵泡黃體數
組別劑量(g/kg)
_(個) 數(個) 數(個) (個)
.丨 K 常對照組一25.6 士 4.6 15.2 士4.91.8士0.51.5 士 0.7
模型組一19.5士7 86.4±1.9##0.6 士 0.2#0.4士 0.2#
戊酸雌二醇組 0.015*10-324.4±3.812.8±3.3*1.8±0.4*1.1 士 0.5*
7.822.5士4.910.1+4. Γ'1.1±0.2'0.9士0.2a'
實施例 I 組合物組 5.923.8士6.213.1±2.ΓΑ1.7士0.3*Α1.1±0.4*A
與正常對照組相比，#P〈0. 05，##P〈0. 01 ;與模型組相比，*P<0. 05，；與二至丸組比較ΔΡ<0. 05。由表I的實驗結果表明，模型組小鼠發育中卵泡數、成熟卵泡數和黃體數與正常組相比明顯下降有統計學差異(Ρ〈0. 01);各給藥組小鼠發育中卵泡數、成熟卵泡數和黃體數與模型組比較顯著升高(ρ〈0. 05 ；Ρ<0. 01)。且實驗結果表明本發明實施例I提供的組合物組與二至丸組比較具有更好的促進卵巢卵泡發育成熟的作用，表現顯著增加小鼠發育中卵泡數、成熟卵泡數和黃體數(Ρ〈0. 05)，表明女貞子、墨旱蓮和雞腰子配伍后具有很好的協同增效的功效。3. 3各組對放射致卵巢早衰小鼠血清Ε2水平的影響，具體實驗結果如表2所示表2中藥組合物對放射致卵巢早衰小鼠血清Ε2水平的影響(文土S，η=10) _MM_劑量 Cg/kg)_E2 (pg/ml)
正常對照組一112.2±10.6
廠^模型組一78.9±6.3她
戊酸雌二醇組0.015x10-3107.3±13.5*
二至丸組7.890.5±8.5*
實施例I組合物組__104.6±9.Q**A與正常對照組相比，##，P〈0. 01 ;與模型組相比，*P〈0. 05,**P<0. 01 ;與二至丸組比較ΔΡ<0. 05。由表2的實驗結果表明，與正常對照組相比，模型組小鼠血清Ε2水平顯著降低，有統計學差異(ρ〈0. 01)。戊酸雌二醇組、二至丸組和本發明實施例I提供的組合物組小鼠血清Ε2水平增高，和模型組相比，有統計學差異(Ρ〈0. 05 ;Ρ〈0.01)。且實驗結果表明，本發明提供的實施例I組合物組小鼠血清Ε2水平顯著高于二至丸組(Ρ〈0. 05)，顯示出更強的提高放射致卵巢早衰小鼠血清Ε2水平的作用，進一步顯示出了很好的協同增效的作用。3. 4各組對放射致卵巢早衰小鼠卵巢ΡΙ3Κ和akt表達的影響，具體實驗結果如表3所示表3中藥組合物對放射致卵巢早衰小鼠卵巢PI3K和akt表達的影響(又士S n=10) _MM_(g/kg)_PI3K (%)_akt (%)
Iii 常對照組一2.2±1.51.9±0.8
「 模型組一11.9±4.3Μ17.3士7.9##
戊酸雌二醇組0.015x10-37.3 士 3.5*9.1 士2.9*
二至丸組 7.8 8.5±3.0* 10.7±3.8* 實施例 I 組合物組_Χ9_4.6士2.1**Α_6.0±2.7**A與正常對照組相比，##，Ρ〈0. 01 ;與模型組相比，*P〈0. 05,**P<0. 01 ;與二至丸組比較ΔΡ<0. 05。PI3K/akt信號通路在早期卵泡發育中起重要作用。表3結果表明，正常對照組小鼠卵巢PI3K和akt表達均較低，約為2%左右，6tlCo照射后小鼠卵巢PI3K和akt表達顯著增高，分別達到11. 9%和17. 3%。二至丸及實施例I組合物組給藥后均顯著降低模型小鼠卵巢高表達的PI3K和akt，和模型組相比，有統計學意義(P〈0. 05，P〈0. 01),且實驗結果表明本發明實施例I提供的組合物組與二至丸組比較具有較強的抑制6tlCo照射引起的小鼠卵巢PI3K/akt信號通路的激活，從而抑制卵泡的大量活化。由上述實驗結果表明，本發明提供的具有防治卵巢功能早衰作用的組合物，能明顯提高卵巢功能早衰小鼠的發育中卵泡數、成熟卵泡數及黃體數，提高血清E2水平，并且能抑制卵巢功能早衰小鼠的卵巢PI3K和akt的表達，顯示出了比二至丸(女貞子和墨旱蓮)更好的抗卵巢功能早衰的功效，具有更好的臨床療效，且用藥安全。以上實施方式只為說明本發明的技術構思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術的人了解本發明內容并加以實施，并不能以此限制本發明的保護范圍，凡根據本發明精神實 質所做的等效變化或修飾，都應涵蓋在本發明的保護范圍內。
權利要求
1.一種具有防治卵巢功能早衰作用的組合物，其特征在于，它是由以下重量份數的原料制成 女貞子2(Γ50份、墨旱蓮3(Γ50份、雞腰子1(Γ60份。
2.根據權利要求I所述的具有防治卵巢功能早衰作用的組合物，其特征在于，它是由以下重量份數的原料制成 女貞子3(Γ40份、墨旱蓮3(Γ40份、雞腰子2(Γ40份。
3.一種具有防治卵巢功能早衰作用制劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)取權利要求I或2所述重量份數的墨旱蓮，加6至12倍重量的水，煎煮I至3次，每次I至2小時，合并煎液，過濾，濃縮，濃縮液中加乙醇使乙醇的濃度達60%飛5%，靜置24小時，過濾，取上清液，減壓濃縮至稠膏，真空干燥，得墨旱蓮提取物； (2)取步驟(I)制備得到的墨旱蓮提取物與權利要求I或2所述重量份數的女貞子、雞腰子混合均勻，粉碎成細粉； (3)取步驟(2)制備得到的細粉與藥學上可接受的載體制備成丸劑、顆粒劑、膠囊劑或片劑劑型的藥物。
4.權利要求I或2所述的具有防治卵巢功能早衰作用的組合物在制備防治卵巢功能早衰藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種具有防治卵巢功能早衰作用的組合物及其制備方法，它是由以下重量份數的原料制成女貞子20~50份、墨旱蓮30~50份、雞腰子10~60份。本發明根據卵巢功能早衰的發病機制，在中醫藥理論的指導下，辨證論治通過大量實驗篩選中藥組方，實驗結果表明，本發明提供的組合物，可以明顯提高卵巢功能早衰小鼠的發育中卵泡數、成熟卵泡數及黃體數，提高血清E2水平，并且能抑制卵巢功能早衰小鼠的卵巢PI3K和akt的表達，顯示出了比二至丸更好的抗卵巢功能早衰的功效，并且實驗過程中未發現不良反應，臨床應用安全。
文檔編號A61K36/638GK102961448SQ20121055145
公開日2013年3月13日 申請日期2012年12月18日 優先權日2012年12月18日
發明者劉志輝, 王瓊, 李爽, 袁雪晶, 李俊生, 范玲, 馬興苗 申請人:江蘇省中醫院