專利名稱：人miR-515-5p反義核酸及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥領域。具體地，本發明涉及一種microRNAOiiiRNA)的用途，尤其是涉及一種用于抑制人micr0RNA-515-5p(miR-515-5p)表達的反義寡聚核苷酸及其應用。該反義寡聚核苷酸可與人miR-515-5p互補，從而抑制人miR-515_5p的表達而起到抗腫瘤的作用。本發明還涉及含有該miRNA反義寡聚核苷酸的藥物組合物。
背景技術：
miRNAs是小的非編碼RNA，長度為20-25bp，通常是由RNA聚合酶II(Pol II) 轉錄的，一般最初產物為大的具有帽子結構(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的 pri-miRNA。這些pri_miRNA在RNase III Drosha和其輔助因子Pasha的作用下被處理成 70個核苷酸組成的pre-miRNA前體產物。RAN-GTP和exportin 5將這種前體分子輸送到細胞質中。隨后，另一個RNaseIII Dicer將其剪切產生約為22個核苷酸長度的雙鏈。這種雙鏈很快被引導進入(miRISC)復合體中，其中含有Argonaute蛋白，并且成熟的單鏈miRNA 保留在這一復合物中。成熟的miRNA結合到與其互補的mRNA的位點通過兩種依賴于序列互補性的機制負調控基因表達，與靶mRNA不完全互補的miRNA在蛋白質翻譯水平上抑制其表達。然而，最近也有證據表明，這些miRNA也有可能影響mRNA的穩定性。使用這種機制的miRNA結合位點通常在mRNA的3’端非翻譯區。如果miRNA與靶位點完全互補(或者幾乎完全互補)，那么這些miRNA的結合往往引起靶分子mRNA的降解。miRNAs在物種進化中相當保守，在動物、植物和真菌等中發現的miRNAs表達均有嚴格的組織特異性和時序性。目前，只有很小一部分miRNAs的生物學功能得到闡明。這些miRNAs調節細胞生長和組織分化，與生物生長發育有關。一系列的研究表明miRNAs在細胞生長和凋亡、血細胞分化、同源異形盒基因調節、神經元的極性、胰島素分泌、大腦形態形成、心臟發生、胚胎后期發育等過程中發揮重要作用。例如，miR-273參與線蟲的神經系統發育過程；miR-430 參與斑馬魚的大腦發育；miR-181控制哺乳動物造血細胞分化為B細胞；miR-375調節哺乳動物胰島細胞發育和胰島素分泌；miR-143在脂肪細胞分化起作用；miR-196參與了哺乳動物四肢形成；miR-1與心臟發育有關。另有研究人員發現許多神經系統的miRNAs在大腦皮層培養中受到時序調節，表明其可能控制著區域化的mRNA翻譯。miRNA表達與多種癌癥相關，并且這些基因可能起到腫瘤抑制基因或是癌基因作用。最先在B細胞慢性淋巴性白血病(CLL)中發現有miRNA表達水平的改變，隨后陸續在各種人類腫瘤中均檢測到miRNA表達水平的變化。研究發現，miRNAs與腫瘤形成相關，既能發揮腫瘤抑制基因的作用(如miR-15a和miR-16-l)，又能起到癌基因的作用(如miR-155 和miR-17-92簇)。目前認為，在腫瘤細胞中，有些miRNA成熟體或前體表達水平異常，而表達異常的miRNA通過影響靶mRNA翻譯發揮作用，參與腫瘤形成過程，并起重要作用。如 Ras原癌基因受let-7家族的調控，BCL2抗凋亡基因受miR-15a-miR-16-l簇調控，E2F1轉錄因子受miR-17-92簇調控，BCL6抗凋亡基因受miR-127的調控等。miRNAs的表達下調也和腫瘤發生有密切關系，這預示著miRNA具有癌基因的功能。例如，miR-143和miR-515-5p在結腸癌中明顯下調。有趣的是，其發夾結構的前體分子在腫瘤和正常組織中含量相似，這表明，miRNAs的表達下調可能是由于其加工過程受到破壞。但是，miR-143和miR-515-5p 的腫瘤抑制基因功能可能不僅僅局限于結腸癌，在乳腺癌、前列腺癌、子宮癌、淋巴癌等細胞系中其表達量也明顯下調。另一個報道表明，miR-21在膠質母細胞瘤中表達增加。這個基因在腫瘤組織中的表達量比在正常組織中高5-100倍。miRNAs是天然的反義作用因子，能夠調控與真核生物生存和增殖相關的多種基因。在腫瘤治療方面，miRNA的應用前景光明。在利用miRNA作為治療靶點方面，已有實驗數據支持如在吉西他濱(gemcitabine)治療的過程中，出現miRNA表達譜的變化；調控部分miRNA的表達水平(如使miR-21過表達)，能增進膽管癌細胞對化療藥物的敏感性。通過引入與具有癌基因特性的miRNA互補的合成的反義寡聚核苷酸——抗miRNA寡聚核苷酸 (AMOs)——可能有效的滅活腫瘤中的miRNAs，延緩其生長。臨床上，可以通過經常的或者持續的2’ -0-甲基化或者鎖核酸(LNA)等修飾的反義寡聚核苷酸給藥使miRNA失活。這些修飾使得寡核苷酸更穩定，比其他治療手段毒性更低。使用antagomirs (與膽固醇偶聯的 AMOs)，注射小鼠后可以在不同器官有效抑制miRNA活性，因而可能成為一種有希望的治療藥物。相反的，過表達那些具有腫瘤抑制基因作用的miRNAs，如let-7家族，也可以用于治療某些特定的腫瘤。反義寡聚核苷酸(Flanagan WM. Antisense comes of age. Cancer&Metastasis Reviews 1998 ;17(2) :169-76)是指一段可以與其靶基因的堿基互補的核苷酸。反義寡聚核苷酸可以抑制相應基因的表達。人microRNA-515 (hsa-miR-515)位于 19 號染色體，前體序列為 UCUCAUGCAG UCAUUCUCCAAAAGAAAGCACUUUCUGUUGUCUGAAAGCAGAGUGCCUUCUUUUGGAGCGUUACUGUUUGAG A，含有兩個成熟 microRNA :hsa-miR-515_5p (序列為 UUCUCCAAAAGAAAGCACUUUCUG)和 hsa-miR-515-3p (序列為 GAGUGCCUUCUUUUGGAGCGUU)。2008 年，Palmieri 等發現在成骨細胞株(osteoblast-like cells line(MG_63))與Medpor(—種線形高密度聚乙烯材料制成的生物材料)以及PerioGlas共培養后，HumanmiRNA microarrays檢測后發現mir-515_3p 受到上調，表明mir-515-3p可能與骨骼重形成有關(Palmieri，Α.，F. Pezzetti, et al. 2008)。Borgdorff等發現miR-515-3p的種子序列與miR_106b家族很類似，在人乳腺上皮細胞(humanmammary epithelial cells, HMECs)中過表達 miR-515_3p 后，能夠恢復 RAS 導致的細胞衰老(Borgdorff, V.，M. E. Lleonart, et al. 2009)。近三十年，盡管臨床上腫瘤的綜合治療已很普遍，但以手術為主，放化療為輔的綜合治療對腫瘤患者的生存率提高并不明顯，5年總體生存率仍然較低，徘徊在30% 55% 左右，并沒有顯著提高，中晚期患者的5年生存率更低，約為20%。而且這些方法都存在各自的局限性，特別是對中晚期和復發患者療效不佳，對伴有遠處轉移者療效更差。因此，尋找更安全有效的治療途徑是提高腫瘤患者生存率和生存質量所亟待解決的難題。

發明內容
本發明要解決的主要問題就是提供一種新的miR-515_5p的反義寡聚核苷酸(抑制劑)，用于高效、低毒或無毒地抑制miR-515-5p的表達，進而治療與miR-515-5p過度表達有關的疾病，包括各種實體腫瘤、各種白血病等。
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本發明要解決的另一問題就是提供上述反義寡聚核苷酸在制備治療miR-515-5p 過度表達的相關疾病的藥物中的用途。本發明要解決的再一問題是提供包含上述反義寡聚核苷酸的藥物組合物。本發明人通過廣泛而深入的研究，設計并合成了一種專一性針對miR-515_5p的反義寡聚核酸，并在培養細胞中驗證具有抑制miR-515-5p表達和抑制細胞生長的效果。研究顯示，這些反義核酸能夠抑制腫瘤細胞的生長和惡性增殖能力。本發明設計了一種可以特異性結合于miR-515_5p的反義核酸分子，在培養細胞 U87/MG中，驗證對miR-515-5p表達特異性抑制的反義核酸對細胞生長能力、增殖能力的影響。反義核酸分子長度可以包含13 24個核苷酸殘基，均有不同程度的抑制人腫瘤細胞生長能力、增殖能力的特性，其中最短的反義核酸長度為13個堿基，不同長度的反義核酸均具有良好的腫瘤細胞生長及增殖抑制活性。因此，上述反義核酸均可用來制備抑制腫瘤細胞生長能力、增殖能力的制劑，其中優選miR-515-5p高表達的腫瘤細胞。在此基礎上完成了本發明。本發明的第一方面，提供了一種miR-515_5p的反義寡聚核苷酸，所述反義寡聚核苷酸抑制人細胞內miR-515-5p的表達。通常，所述反義寡聚核苷酸與 5’ -UUCUCCAAAAGAAAGCA⑶UU⑶G-3’中連續13 24個核苷酸序列互補。在本發明的一個優選實施例中，所述反義寡聚核苷酸的長度在18 24個核苷酸范圍內。更佳地，所述反義寡聚核苷酸的序列為 5，-CAGAAAGUGCUUUCUUUUGGAGAA-3，。從目前來看，核酸雜交中RNA與miRNA的雜交親和力比DNA與miRNA雜交的親和力要高，具有很高的藥用價值。但是人工合成DNA的成本遠遠比合成RNA的成本低，也具有很好的市場潛力。而且也可以采用核糖RNA單體與脫氧核糖DNA單體嵌合相連而成的反義核酸作為藥物進行開發。本發明設計的一系列反義寡聚核苷酸分子，既可以是DNA，也可以是RNA，還可以是DNA與RNA的嵌合體。上述分子均具有抑制miR-515_5p表達的活性。本發明設計的反義核酸，其序列具有特異性生物學活性，其對于某一基因互補的位點的反義核酸所互補的長度有很大關系，如互補的長些，則生物學活性會更高些，抑制效果也會更好一些，在增加或減少一個至數個堿基而互補于同一基因位點的反義核酸，同樣也具有不同程度的生物學活性，也可達到不同程度的抑制腫瘤細胞生長與增殖的作用。本發明的研究表明，最短可達13個堿基仍然具有抑制miR-515-5p表達的作用。反義核酸研究中，各種化學修飾方法很多。本發明采用選自核糖修飾、堿基修飾和磷酸骨架修飾中的一種或幾種組合修飾的反義核酸，硫代、甲氧修飾方式的反義核酸的藥理學、藥代動力學、毒理學等臨床前研究是各種化學修飾反義核酸中研究最為全面的，修飾的反義核酸在體內可以有效地防止人體內大量核酸外切酶對反義核酸的酶切而降解，從而避免反義核酸失去應有的生物學活性。此外硫代反義核酸還可激發RNA酶的活性，降解與其雜交的RNA鏈，因此優選這兩種修飾方式的反義核酸在實驗中應用。應當明確的是，任何能夠增加反義核酸穩定性和生物利用度的修飾方法都可以應用，如膽固醇修飾、PEG修飾等。優選本發明反義核酸修飾選自硫代修飾、2’ -甲氧基修飾和膽固醇修飾中的一種或幾種。最優選采用如下修飾方式所有核苷酸進行2’ -甲氧基修飾，并且5’端兩個核苷酸進行硫代修飾，3’端四個核苷酸進行硫代修飾并且在5’或者3’端連接膽固醇。本發明的上述反義核酸具有抑制miR-515_5p表達的效果。當將上述反義核酸轉染到表達miR-515-5p的細胞株U87/MG中后，能夠有效抑制U87/MG細胞的生長和惡性增殖能力。本發明還提供了一種藥物組合物，它含有安全治療有效量的本發明寡聚核苷酸以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類給藥載體包括但不限于各種可用于核酸給藥的載體，如脂質體、可降解的高分子化合物、鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。所述“有效量”是指可對人和/或動物產生功能或活性且可被人和/或動物所接
受的量。所述“藥學上可接受的”成分是適用于人和/或動物而無過度不良副反應(如毒性、刺激和變態反應)的，即有合理的效益/風險比的物質。在本發明的第三方面，提供了本發明的反義寡聚核苷酸的用途，用于制備治療以下疾病的藥物治療人體與miR-515-5p過表達有關的疾病，包括各種實體腫瘤(特別是腦膠質瘤)、各種白血病等。如本文所用，“反義寡聚核苷酸”指反義的核苷酸寡聚物。反義寡聚核苷酸通過堿基互補(A-T，A-U, G-C)配對與雙鏈DNA形成三鏈(反基因)，或與單鏈RNA形成雜交雙鏈 (反義)，從而阻斷基因的復制、轉錄或轉錄后mRNA的加工和翻譯。同時，雙鏈RNA能被細胞內的核糖核酸酶H(RNaseH)所降解，從而更有效地阻斷靶基因的表達。由于反義核苷酸只能與反向互補的靶序列結合，具有專一性高，副作用小的特點。本發明的反義寡核苷酸的長度沒有特別限制，一般來說，為了達到雜交的專一性， 反義寡聚核苷酸需要至少13個單體組成的核苷酸。通常反義寡聚核苷酸的長度為13 35bp，對于miRNA來說，較佳的為18 24bp。


圖1顯示了 miR-515-5p反義寡聚核苷酸抑制腫瘤細胞U87/MG細胞中miR-515-5p 的表達，圖IA D中三線條是重復試驗的結果。A為轉染miR-515-5p反義寡聚核苷酸 (5‘-CAGAAAGUGCUUUCUUUUGGAGAA-3‘)后miR-515_5p的表達情況，B為轉染陰性對照反義寡聚核苷酸(5，-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3，)后 miR-515_5p 的表達情況；C 為轉 miR-515_5p 反義寡聚核苷酸后內參基因U6的表達情況；D為轉染陰性對照反義寡聚核苷酸后內參基因 U6的表達情況；E為miR-515-5p在轉染反義寡聚核苷酸后抑制效果柱狀圖，橫坐標為所檢測的樣品，其中“1”表示轉染miR-515-5p反義寡聚核苷酸后的miR-515_5p表達情況，“NC” 表示轉染陰性對照后miR-515-5p表達情況。圖2顯示了 miR-515-5p反義寡聚核苷酸抑制腫瘤細胞U87/MG細胞的生長和增殖，A、B為轉染了 FAM標記的陰性對照后的U87/MG細胞；C為轉染陰性對照后U87/MG細胞狀態；D 為轉染 miR-515-5p 反義寡聚核苷酸(5，-CAGAAAGUGCUUUCUUUUGGAGAA-3，)后 U87/ MG細胞狀態。
具體實施例方式本發明的反義寡聚核苷酸，其序列與5’ -UUCUCCAAAAGAAAGCA⑶UU⑶G-3’中連續 13 24個核苷酸序列互補，并且亦不與其他基因的RNA序列互補。在本發明的一個優選實施例中，所述反義寡聚核苷酸的序列為5’-CAGAAAGUGCUUUCUUUUGGAGAA-3’。本發明提供的反義寡聚核苷酸可以為修飾產物，它含有至少兩個，通常至少4個，較佳的至少6個，更佳的至少8個核苷酸沒有毒性副作用的修飾的核苷酸，所述修飾方式包括2’ -位甲氧基取代、硫代修飾等。為了增加反義寡聚核苷酸的細胞攝取率，還可以在上述修飾的基礎上對反義寡聚核苷酸進行膽固醇修飾或者PEG化修飾。上述修飾后的寡聚核苷酸能繼續與靶序列有效配對，而且比普通的未經修飾的核糖核酸或者脫氧核糖核酸在體內具有更長的半衰期。本發明具有如下優點1、反義寡聚核苷酸作用于特異性的靶位點，非特異性結合的位點很少，專一性尚；2、本發明提供的反義寡聚核苷酸經過適當的化學修飾，具有毒性低、副作用小和半衰期長等特點；3、本發明提供的反義寡聚核苷酸具有很好的抑制效果，對miR-515_5p的表達的抑制率達到95%以上，對腫瘤細胞生長的抑制率接近45%。下面將結合實施例及附圖進一步詳細地描述本發明。然而應當理解，列舉這些實施例只是為了起說明作用，而并不是用來限制本發明的范圍。實施例首先，由上海吉瑪制藥技術有限公司合成反義寡聚核苷酸，序列為 5’-CAGAAAGUGCUUUCUUUUGGAGAA-3’。在實施例中涉及的所有序列均由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。實施例1、miR-515_5p反義核酸抑制miR-515_5p的表達進行實時定量熒光檢測，其中涉及的寡聚核苷酸序列由上海吉瑪制藥技術有限公司合成，具體實驗步驟包括細胞培養U87/MG細胞(購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫)，10% FBS-DMEM 培養基(FBS 購自 Hyclone, DMEM 購自 Gibco)培養，37°C ,5% CO2 培養。細胞轉染1)轉染前一天，在24孔板中用適量不含抗生素的培養基接種培養細胞，使轉染時細胞的匯合度達到30 50% ；2)轉染樣品按照如下方法準備寡聚物-Lipofecta mine 2000復合物a.用50 μ 1不含血清的Opti-MEM I培養基(Gibco)分別稀釋 miR-515-5p 反義寡聚核苷酸(5，-CAGAAAGUGCUUUCUUUUGGAGAA-3，)、陰性對照 (5，-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’)、FAM標記的陰性對照，終濃度為50nM，輕輕混勻，每個轉染設3個復孔；b.使用前輕輕混勻 Lipofecta mine 2000 (Invitrogen)，然后取 2 μ 1 稀釋到 50 μ 1的Opti-MEM I培養基中，輕輕混勻后在室溫下孵育5min ；c.孵育5min后，稀釋的Lipofecta mine 2000分別與稀釋的反義核苷酸及對照混合，輕輕混勻后在室溫下孵育20min，以允許復合物的形成；3)將復合物加入到每一個包含細胞和培養基的孔中，輕輕地前后搖動培養板混合；4)37°C,5% CO2培養箱孵育過夜，更換含10%胎牛血清的培養基繼續培養24h。
總RNA 提取1)離心收集細胞，往離心管中加入500 μ 1 Ezol (Invitrogen)，將離心管上下顛倒混勻，室溫放置IOmin。2)加入200 μ 1 RNA專用的三氯甲烷(上海生工)，劇烈上下顛倒混勻，直至離心管中的液體徹底混勻，成乳白色狀。3)室溫放置 5min，12000rpm 離心 15min。4)小心將上清轉移至另一干凈的1. 5ml離心管中，避免吸動中層蛋白相和下層有機相。5)往上清中加入500 μ 1預冷的RNA專用的異丙醇(上海生工)，室溫放置5min。 IOOOOrpm 離心 IOmin06)小心棄盡上清，加入Iml RNA專用的75%的乙醇(上海生工)洗滌沉淀， IOOOOrpm 離心 IOmin07)小心棄盡上清，置于室溫晾干乙醇，每管加入20 μ 1 DEPC水溶解，混勻。RNA 逆轉錄將上述抽提得到的RNA分別用U6和hsa-miR-515-5p兩種RNA特異逆轉錄引物進行逆轉錄，制備cDNA模板。逆轉錄中所用的緩沖液和酶均為Promega公司產品；引物序列由上海吉瑪制藥技術有限公司合成，miR-515-5pRT引物5，-ACTCGGGTCCAGAGCAGGGTCCGAG GTACACGTTCGCTCTGGACCCGAGTCAGAAAGTGC-3’。(i).逆轉錄體系
權利要求
1.一種反義寡聚核苷酸，其特征在于，所述反義寡聚核苷酸包含與 5’ -UUCUCCAAAAGAAAGCA⑶UU⑶G-3’中連續13 24個核苷酸序列互補的序列。
2.如權利要求1所述的反義寡聚核苷酸，其特征在于，所述反義寡聚核苷酸包含序列 5， -CAGAAAGUGCUUUCUUUUGGAGAA-3，。
3.如權利要求1所述的反義寡聚核苷酸，其特征在于，所述反義寡聚核苷酸為核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸與脫氧核糖核苷酸的嵌合體。
4.如權利要求1 3中任一項所述的反義寡聚核苷酸，其特征在于，所述反義寡聚核苷酸進一步被修飾。
5.如權利要求4所述的反義寡聚核苷酸，其特征在于，所述修飾選自核糖修飾、堿基修飾和磷酸骨架修飾中的一種或幾種的組合。
6.如權利要求5所述的反義寡聚核苷酸，其特征在于，所述修飾選自硫代修飾、2’-甲氧基修飾和膽固醇修飾中的一種或幾種。
7.如權利要求6所述的反義寡聚核苷酸，其特征在于，所有核苷酸進行2’-甲氧基修飾，并且5’端兩個核苷酸進行硫代修飾，3’端四個核苷酸進行硫代修飾并且在5’或者3’ 端連接膽固醇。
8.如權利要求1 7中任一項所述的反義寡聚核苷酸用于制備治療miR-515-5p過度表達的相關疾病的藥物的用途。
9.如權利要求8所述的用途，其特征在于，所述miR-515-5p過度表達的相關疾病為腦膠質瘤。
10.一種藥物組合物，其特征在于，含有治療有效量的權利要求1 7中任一項所述的反義寡聚核苷酸以及藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發明公開一種抑制microRNA-515-5p表達的反義寡聚核苷酸及其應用。該反義寡聚核苷酸特異性結合于人miR-515-5p，包含與5’-UUCUCCAAAAGAAAGCACUUUCUG-3’核苷酸序列中至少13個連續核苷酸互補的序列，特別是序列5’-CAGAAAGUGCUUUCUUUUGGAGAA-3’。本發明的反義寡聚核苷酸可為核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸與脫氧核糖核苷酸的嵌合體，并可對鏈中任一核苷酸進行修飾。本發明的反義寡核苷酸能夠有效抑制人腦膠質瘤細胞中miR-515-5p表達，抑制其生長和增殖，從而有效治療腦膠質瘤及其他miR-515-5p高表達的腫瘤。
文檔編號A61P35/02GK102382823SQ20101027108
公開日2012年3月21日 申請日期2010年9月1日 優先權日2010年9月1日
發明者丁侃, 東楠, 張佩琢, 李捷, 沈孝坤 申請人:中國科學院上海藥物研究所, 蘇州吉瑪基因藥物科技有限公司