專利名稱：一種地錦草的黃酮和皂甙提取物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明 涉及一種地錦草的黃酮和皂甙提取物及其用途，屬于純中草藥制劑及應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
宮頸癌是常見(jiàn)的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，是全球婦女惡性腫瘤中僅次于乳腺癌的第二位最常見(jiàn)的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅婦女的健康和生命。估計(jì)每年宮頸癌新發(fā)病例數(shù)達(dá)50 萬(wàn)，其中79%在發(fā)展中國(guó)家，宮頸癌在發(fā)展中國(guó)家占婦女癌癥的24%。我國(guó)是宮頸癌的高發(fā)國(guó)家，每年新發(fā)宮頸癌病例平均為13. 15萬(wàn)(1984年WHO資料)，70年代我國(guó)每年死亡宮頸癌為9. 98/10萬(wàn)，90年代初為3. 25/10萬(wàn)。特別是近年來(lái)年輕宮頸癌患者有明顯上升趨勢(shì)， 發(fā)病以每年2 3%的速度增長(zhǎng)。宮頸癌與其他腫瘤的不同之處就在于它是一種感染性疾病，是可以預(yù)防和治愈的疾病；而且它的發(fā)生和發(fā)展具有相對(duì)鮮明的階段性，是一個(gè)連續(xù)發(fā)展的過(guò)程，即由宮頸非典型增生(輕一中一重)一原位癌一早期浸潤(rùn)癌一浸潤(rùn)癌的一系列病理變化。一般認(rèn)為，從宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變發(fā)展到浸潤(rùn)癌一般需要10年的時(shí)間，這10年的時(shí)間給我們提供了發(fā)現(xiàn)它，治療它，并逆轉(zhuǎn)它向惡性病變發(fā)展的機(jī)會(huì)。目前我國(guó)常用的西藥有4000多種，其中大多數(shù)是仿制國(guó)外的產(chǎn)品，由于知識(shí)產(chǎn)權(quán)問(wèn)題，仿制工作將受到限制，而自己研制新藥，每種西藥投資需13億美元，研制期6 8年， 人力、物力、財(cái)力及時(shí)間的消耗極大，在近期不可能發(fā)明創(chuàng)造足夠的西藥來(lái)滿足我國(guó)防治疾病的需要。再加上西藥固有的一些欠缺，如毒副反應(yīng)嚴(yán)重，藥源性疾患日益增多，療效不夠理想，藥價(jià)昂貴等，使人們更多地寄希望于天然植物藥，積極開展天然產(chǎn)物研究與新抗癌藥開發(fā)。天然植物因其毒副作用小，易于被患者所接受等特點(diǎn)，在抗腫瘤藥物中占有重要地位。從天然植物中尋找抗腫瘤藥物或放射增敏和防治放療反應(yīng)藥物，以提高治療效果，正日益成為人們注目的焦點(diǎn)。地錦草(Euphorbia humifusa Willd)的干燥全草，是中醫(yī)、維醫(yī)常用藥材，應(yīng)用廣泛。其化學(xué)成分主要有黃酮、三萜、香豆素、羽扇豆醇、留醇、鞣質(zhì)及酚酸類等化合物，是一種藥用價(jià)值很高的植物。地錦草具有清熱解毒、涼血等功效，主要用于治療各種皮膚病、瘙癢、痢疾、炎、咳血、吐血、便血、崩漏、外傷出血、濕熱黃疸、汁不通、癰腫疔瘡及跌打腫痛等疾病。但有關(guān)地錦草黃酮和皂甙口服治療宮頸癌和其他癌癥的研究國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可以作為一種非合成的藥物用于臨床宮頸癌及其他癌癥患者免疫力低下的治療的地錦草黃酮和皂甙提取物及其用途。本發(fā)明的地錦草黃酮和皂甙提取物是以地錦草為原料分別經(jīng)柱層析和純化制備而成的。上述提取物能夠分別制成膠囊劑、散劑、顆粒劑或片劑在臨床應(yīng)用。在制成的膠囊劑、散劑、顆粒劑或片劑可加入適量淀粉或其它輔料作為添加劑。
所述地錦草黃酮和皂甙提取物主要含有地錦草黃酮和皂甙成分，通過(guò)藥理及動(dòng)物試驗(yàn)證明上述提取物具有抗宮頸癌及其他癌癥、調(diào)節(jié)患者機(jī)體免疫力等新的醫(yī)藥作用，所以其用途是用于癌癥治療以及促進(jìn)免疫器官生長(zhǎng)，特別是用于宮頸癌的治療。地錦草中黃酮和皂甙提取物的制備
(1)脫脂將地錦草全干草按Ig :10ml比例加入石油醚浸泡12h，濾出石油醚，重復(fù)三次后，晾干地錦草。(2)提取地錦草藥材與75% (ν/ ν)酒精按料液比Ig :10ml比例于6(T70°C加熱回流2小時(shí)，提取三次，合并提取液，經(jīng)50°C減壓濃縮，得地錦草粗提物浸膏。(3)黃酮和皂甙粗提物的制備將步驟(2)所得產(chǎn)物黃酮以1 :1比例(體積比)加入乙酸乙酯；阜甙以1:1比例(體積比)加入正丁醇；分別萃取，得地錦草黃酮和皂甙粗提物。(4)黃酮和皂甙的精制將步驟(3)所得草黃酮和皂甙粗提物分別過(guò)DlOl大孔樹脂和硅膠(200-300)柱層析硅膠層析柱，合并流分，減壓濃縮，活性炭脫色，真空干燥。分別得到純化的黃酮和皂甙。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明通過(guò)多項(xiàng)試驗(yàn)證明地錦草黃酮和皂甙提取物分別具有抗宮頸癌及其他癌癥、改善患者免疫功能等功效。本發(fā)明為宮頸癌及其他癌癥的治療提供一種非合成藥物，其功能明確、作用持久、毒副作用小，拓寬了中藥地錦草治療疾病的范圍。


圖1為實(shí)施例中生理鹽水陰性對(duì)照組腫瘤組織病理切片2為實(shí)施例中地錦草黃酮高劑量處理組腫瘤組織病理切片3為實(shí)施例中地錦草皂甙高劑量處理組腫瘤組織病理切片4為實(shí)施例中地錦草黃酮高劑量處理組荷瘤小鼠肝臟組織病理切片5為實(shí)施例中地錦草黃酮高劑量處理組荷瘤小鼠腎臟組織病理切片6為實(shí)施例中地錦草皂甙高劑量處理組荷瘤小鼠肝臟組織病理切片7為實(shí)施例中地錦草皂甙高劑量處理組荷瘤小鼠腎臟組織病理切片圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例
藥效實(shí)驗(yàn)例以小鼠U14宮頸癌為例，對(duì)小鼠U14宮頸癌的抑制作用及對(duì)其免疫器官影響的試驗(yàn)進(jìn)行闡述。試驗(yàn)通過(guò)對(duì)本發(fā)明的藥物進(jìn)行藥理學(xué)研究，觀察其對(duì)荷U14宮頸癌小鼠的腫瘤抑制作用，對(duì)荷瘤小鼠胸腺、脾臟發(fā)育的影響及對(duì)肝臟、腎臟病理的影響。1試驗(yàn)材料 1. 1動(dòng)物和細(xì)胞株
昆明種小鼠(合格證號(hào)SCXK (軍)2007-004)，體重18 22 g，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究所。自由飲用自來(lái)水，清潔級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)房，溫濕度適宜，光照8 10 h/d。小鼠宮頸癌U14細(xì)胞株引自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，在小鼠腹腔中進(jìn)行傳代。1.2地錦草和試劑
地錦草，購(gòu)自秦皇島同仁堂藥店，并經(jīng)中醫(yī)專家和《中國(guó)常用中草藥》、《中國(guó)常用中草藥彩色圖譜》對(duì)照鑒定為地錦草；蘇木精、伊紅購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz生物試劑公司；環(huán)磷酰胺(CTX)由江蘇恒瑞醫(yī)藥公司生產(chǎn)。2試驗(yàn)方法
2. 1小鼠荷宮頸癌U14實(shí)體瘤模型的建立
建模前小鼠禁食不禁水12 h。在無(wú)菌條件下，吸取在昆明種小鼠體內(nèi)傳代7 10 d的 U14腫瘤細(xì)胞，生理鹽水調(diào)整細(xì)胞密度為5X IO6 cell/mL,于小鼠右左前肢腋窩皮下接種 0. 2 mL，接種成功率100%。2. 2地錦草黃酮和皂甙的制備
(1)脫脂將地錦草全干草按Ig :10ml比例加入石油醚浸泡12小時(shí)，濾出石油醚，重復(fù)三次后，晾干地錦草。(2)提取地錦草藥材與75% (ν/ ν)酒精按料液比Ig :10ml比例于6(T70°C加熱回流2小時(shí)，提取三次，合并提取液，經(jīng)50°C減壓濃縮，得地錦草粗提物浸膏。(3)黃酮和皂甙粗提物的制備將(2)所得產(chǎn)物以1 :1(體積比)比例分別加入乙酸乙酯和正丁醇萃取，得地錦草黃酮和皂甙粗提物。(4)黃酮和皂甙的精制將(3)所得乙酸乙酯和正丁醇洗脫液過(guò)DlOl大孔樹脂和硅膠(200-300)柱層析硅膠層析柱，合并流分，減壓濃縮，活性炭脫色，真空干燥。2. 3試驗(yàn)分組
建模后將小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為陰性對(duì)照組(生理鹽水)、陽(yáng)性對(duì)照組 (CTX，25mg/kg)和地錦草黃酮低劑量(50-150mg/kg)、高劑量(160_250mg/kg)處理組。陽(yáng)性對(duì)照組動(dòng)物給藥方式為腹腔注射，陰性對(duì)照組和地錦草黃酮低、高劑量處理組動(dòng)物給藥方式為灌胃。所有動(dòng)物模型每日給藥1次，連續(xù)給藥15d，試驗(yàn)期間所有小鼠均自由進(jìn)食進(jìn)水。2. 4腫瘤抑制率的測(cè)定
停藥次日乙醚麻醉狀態(tài)下脫頸處死各組小鼠，剖取瘤塊肉眼觀察并用電子天平進(jìn)行稱重，計(jì)算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率(%)=[(對(duì)照組平均瘤重一給藥組平均瘤重)/對(duì)照組平均瘤重]XlOO
2. 5對(duì)免疫器官重量的影響
將麻醉小鼠進(jìn)行斷頸處死，無(wú)菌條件下迅速解剖其胸腺和脾臟組織，稱重。依據(jù)下列公式計(jì)算小鼠胸腺、脾臟指數(shù)
胸(脾)腺指數(shù)(mg/10g)=胸(脾)腺重量/去瘤體重X 10 2. 6地錦草黃酮和皂甙對(duì)小鼠腫瘤組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響
無(wú)菌條件下，迅速剝離出腫瘤組織，肉眼觀察。迅速將腫瘤組織一部分(0. 5 cmX0.5 cmX0.5 cm)迅速置于中性緩沖福爾馬林溶液中進(jìn)行固定，石蠟包埋后，組織切片機(jī)切片， 蘇木精_伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行病理學(xué)觀察。2. 7藥物處理小鼠肝臟、腎臟病理切片觀察
荷實(shí)體瘤小鼠停藥次日脫頸處死小鼠，剖取地錦草高劑量組小鼠的肝、腎組織用中性緩沖福爾馬林固定，梯度酒精脫水，透明，浸蠟后石蠟包埋，制作病理切片。2. 8小鼠急性毒性試驗(yàn)根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)無(wú)法測(cè)定小鼠口服地錦草黃酮和皂甙的LD5tl，故改作最大耐受量試驗(yàn)。方法如下取小鼠20只，雌雄各半。試驗(yàn)前禁食(不禁水)12 h，10只進(jìn)行小鼠急性經(jīng)口毒理試驗(yàn)，每日采用最大濃度最大體積一次性灌胃給藥，連續(xù)觀察7天，記錄小鼠的行為、活動(dòng)、攝食量、體重和死亡情況。3本發(fā)明的試驗(yàn)結(jié)果
3. 1地錦草黃酮和皂甙對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響
結(jié)果如表1所示，分別用地錦草黃酮和低、高劑量處理及CTX處理均可以減輕腫瘤組織重量，分別為 2. 22士0.50 g、1.61 士0.45 g和 1.43士0.34 g，與陰性對(duì)照組3. 36士0. 76 g相比，地錦草黃酮高劑量處理組和CTX處理組均達(dá)到差異顯著0°<0.01)，地錦草黃酮低、高劑量和CTX處理組腫瘤抑制率分別為33. 91,52. 08和57. 45%。如表2所示，通過(guò)地錦草皂甙低、高劑量處理及CTX處理后均可以減輕腫瘤組織重量，分別為2. 09士0. 34 g、l. 51 士0. 38 g和1. 43士0. 34 g，與陰性對(duì)照組3. 36士0. 76 g相比，地錦草皂甙高劑量處理組和CTX 處理組均達(dá)到差異顯著O°<0. 01)，地錦草皂甙低、高劑量和CTX處理組腫瘤抑制率分別為 37. 79%、55. 06% 和 57. 45%。表1 地錦草黃酮處理對(duì)荷瘤小鼠體重和瘤體重量的影響( 5 士 S. D.，η = 10)
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注與陰性對(duì)照組相比，XO. 01
表2地錦草皂甙處理對(duì)荷瘤小鼠體重和瘤體重量的影響( 士S.D.，η = 10)
權(quán)利要求
1.一種地錦草的黃酮和皂甙提取物，其特征是該提取物是以地錦草為原料分別經(jīng)柱層析和純化制備而成的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的地錦草的黃酮和皂甙提取物，其特征是上述提取物能夠制成膠囊劑、散劑、顆粒劑或片劑中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的地錦草的黃酮和皂甙提取物的用途，其特征是用于癌癥治療以及促進(jìn)免疫器官生長(zhǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的地錦草的黃酮和皂甙提取物的用途，其特征是用于宮頸癌的治療。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種地錦草的黃酮和皂甙提取物及其用途，其特征是提取物是以地錦草為原料分別經(jīng)柱層析和純化制備而成的。經(jīng)藥理試驗(yàn)證明，可用于小鼠宮頸癌(U14)和其他癌癥的治療，它具有明顯抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、改善胸腺器官和促進(jìn)免疫器官生長(zhǎng)的作用，作用持久且毒性低。本發(fā)明為宮頸癌及其他癌癥的治療提供了一種非合成藥物，其功能明確、作用持久、毒副作用小，拓寬了中藥地錦草治療疾病的范圍。
文檔編號(hào)A61K36/47GK102429951SQ20111039198
公開日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月1日
發(fā)明者李青旺, 栗坤, 王培軍, 瑋罕, 韓增勝 申請(qǐng)人:燕山大學(xué)