專利名稱：腸道病毒71型感染7日齡c57/bl6小鼠模型的建立方法
技術領域：
本發明涉及一種腸道病毒71型感染7日齡C57/BL6小鼠模型的建立方法。
背景技術：
腸道病毒71型(EV71)屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，是手足口病(HFMD)的主要病原(Hand Foot and Mouth Disease, HFMD)。自2008年以來我國多次發生EV71的暴發感染，時有病死發生，已經成為備受關注的公共衛生問題。目前其感染和致病機制、病毒結構特征及毒力相關基因等還不明確，并且臨床缺乏有效的藥物和疫苗。因此深刻理解病毒生物學特性與宿主感染的相互關系，疫苗設計研發及藥物篩選研究意義重大。由于EV71病毒具有嚴格的宿主特異性，目前國內尚未建立穩定的動物感染模型。 這一現狀從根本上制約了 EV71臨床基礎研究和臨床防治策略的制定，導致臨床高效特異的治療藥物和預防性疫苗的缺乏。因此，建立穩定的動物感染模型成為EV71研究和防治的關鍵問題。

發明內容
針對上述現有技術，本發明提供了一種腸道病毒71型感染7日齡C57/BL6小鼠模型的建立方法，動物模型的建立可促進對腸道病毒71型致病機制和宿主免疫機制的研究， 并可用于高效抗病毒藥物的篩選和疫苗評價，為EV71病原學研究、臨床治療研究以及疫苗學研究解決了關鍵性難題。本發明是通過以下技術方案實現的一種腸道病毒71型感染7日齡C57/BL6小鼠模型的建立方法，包括以下步驟取 7日齡C57/BL6小鼠，后肢肌肉注射病毒液，即得腸道病毒71型感染的小鼠模型。所述病毒液注射量為20 μ L，是通過以下方法制得的將EV71毒種，以 200 μ L/100mL細胞培養瓶的接種量接種MA104細胞，37°C,5% CO2培養，每天觀察細胞病變情況，至MA104細胞70%出現凝集、皺縮時，將整瓶細胞凍融，離心取上清，即得到EV71的病毒液。所述EV71毒種，為現有技術中已有的，常規取得即可，本發明對此無限制，不再贅述。所述建立方法，還包括以下小鼠模型的鑒定步驟飼養上述接種腸道病毒71型的小鼠，5天后，后肢出現反應遲緩、后肢癱瘓，7天后死亡的，即為感染成功的小鼠模型。本發明成功地建立了穩定的腸道病毒71型感染的小鼠模型，其后肢癱瘓率一般為70% 100%，死亡率為30 100%。本發明為科研人員研究腸道病毒71型病原學、腸道病毒71型致病機制以及高效抗病毒藥物的篩選和疫苗的研制提供了基礎，具有廣闊的應用前景。


圖1為臨床分離毒株的RT-PCR鑒定的電泳圖，其中，M = Maker (D2000)，N=陰性細胞對照，B =空白試劑對照，1 =分離毒株。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的說明。實施例1建立感染腸道病毒71型的7日齡C57/BL6小鼠模型步驟如下1、EV71的分離鑒定本發明所采用的EV71毒株是從臨床的重癥手足口病人的糞便標本中分離的，同時采用人橫紋肌肉瘤細胞株(RD)、恒河猴腎細胞株(MA104)和非洲綠猴腎細胞株(Vero)三種細胞對標本中的病毒進行分離，結果三種細胞上菌出現了細胞病變，傳代后凍存毒種。然后提取分離到的EV71的基因組RNA，逆轉錄成cDNA，采用EV71國家標準引物對分離毒株進行鑒定，結果表明分離毒株在226bp處出現了很亮的條帶(如圖1所示)，可證實從臨床手足口重癥病人糞便標本中分離的毒株為EV71。2、EV71感染動物模型的建立2.1小鼠的準備購買SPF級別的C57/BL6乳鼠2組(帶母鼠)，每組6只，25°C、濕度50%，分格飼養在ABSL-2實驗室的凈化動物飼養柜內，每天觀察動物生長情況，C57/BL6乳鼠生長狀態良好。2. 2毒種的準備將分離的EV71毒種，以200yL/100mL細胞培養瓶的接種量接種MA104細胞， 37°C、5% CO2培養，每天觀察細胞病變情況。接種EV71后第2天，MA104細胞約70%出現了凝集、皺縮，將整瓶細胞凍融后，離心取上清，即得到EV71的病毒液。2. 3EV71感染動物模型的建立2. 3. 1動物分組將兩組動物分別設為病毒組和正常對照組，病毒組肌注接種EV71病毒，正常對照組左后肢肌注接種含2%胎牛血清的1640培養液。2. 3. 2 接種 EV71采用無菌的微量進樣器，病毒組每只C57/BL6小鼠左后肢肌肉注射病毒液20 μ L， 正常對照組每只C57/BL6小鼠左后肢肌肉注射含2%胎牛血清的1640培養液20 μ L。然后將動物按相同的條件飼養在凈化動物飼養柜內，每天觀察動物。2. 3. 3接毒后的觀察接種0天至4天病毒組和正常對照組均無異常；接種5天后病毒組動物后肢全部出現明顯后肢癱瘓，正常對照組無異常，取兩組動物各3只分別進行解剖固定；至接種7天病毒組剩余乳鼠均死亡，正常對照組無異常，動物模型建立成功。
權利要求
1.一種腸道病毒71型感染7日齡C57/BL6小鼠模型的建立方法，其特征在于，包括以下步驟取7日齡C57/BL6小鼠，后肢肌肉注射病毒液，即得腸道病毒71型感染的小鼠模型。
2.根據權利要求1所述的腸道病毒71型感染7日齡C57/BL6小鼠模型的建立方法，其特征在于所述病毒液注射量為20 μ L，是通過以下方法制得的將EV71毒種，以 200 μ L/100mL細胞培養瓶的接種量接種MA104細胞，37°C,5% CO2培養，每天觀察細胞病變情況，至MA104細胞70%出現凝集、皺縮時，將整瓶細胞凍融，離心取上清，即得到EV71的病毒液。
3.根據權利要求1所述的腸道病毒71型感染7日齡C57/BL6小鼠模型的建立方法，其特征在于還包括以下小鼠模型的鑒定步驟飼養上述接種腸道病毒71型的乳鼠，5天后， 后肢出現反應遲緩、后肢癱瘓，7天后死亡的，即為感染成功的乳鼠模型。
全文摘要
本發明公開了一種腸道病毒71型感染7日齡C57/BL6小鼠模型的建立方法取7日齡C57/BL6小鼠，后肢肌肉注射病毒液，即得腸道病毒71型感染的小鼠模型。所述病毒液注射量為20μL，是通過以下方法制得的將EV71毒種，以200μL/100mL細胞培養瓶的接種量接種MA104細胞，37℃、5％CO2培養，每天觀察細胞病變情況，至MA104細胞有70％出現凝集、皺縮時，將整瓶細胞凍融，離心取上清，即得到EV71的病毒液。本發明成功地建立了穩定的腸道病毒71型感染7日齡C57/BL6小鼠模型，為腸道病毒71型生物學特性研究、致病機制及宿主免疫應答機制研究以及高效抗病毒藥物的篩選和疫苗的研制提供了基礎，具有廣闊的應用前景。
文檔編號A61K35/76GK102441011SQ20111032799
公開日2012年5月9日 申請日期2011年10月25日 優先權日2011年10月25日
發明者姜國勝, 孟紅, 宋楠楠, 岳盈盈, 李志會, 李鵬 申請人:山東省醫學科學院基礎醫學研究所