專利名稱：一種脫細胞基質異種骨的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種脫細胞骨，特別是涉及一種脫細胞基質異種骨的制作方法。
背景技術：
脫細胞組織基質是應用物理或化學方法將異體或異種組織進行脫細胞處理，從而去除組織移植過程中引起排斥反應的相關抗原，以用于修復損傷組織的一種新型生物材料。隨著社會的飛速發展，交通運輸、機械化程度的不斷提高，高速、高能量的創傷所導致嚴重的復雜的骨折，常引起骨缺損、骨折不愈合。自體骨移植是最理想的骨移植方法，但由于骨源及供骨部位有限，同時自體組織塑型困難等缺陷，限制了其在臨床的推廣應用；同種異體骨移植有傳播人類疾病的危險，有一定的免疫排斥反應，使人們應用時顧慮重重，同時，來源也有限。目前臨床應用的人工骨，成本高、價格昂貴，患者不易接受。脫細胞基質異種骨，它取自動物，如豬、牛等，具有來源豐富，易于大量獲取和加工存貯，這些骨組織保留了天然的密集的孔隙結構，具有良好的骨生長支架作用，為細胞的增殖、分化、成骨提供了天然的三維空間結構，具有良好的骨誘導活性及與新骨生長速度相配的降解率，但是，由于異種骨抗原主要存在于骨細胞內，必須進行脫細胞的處理，而現有的脫細胞處理方法造成了這些異種骨價格昂貴，從而影響了這些植骨材料的推廣應用。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術之不足，提供一種脫細胞基質異種骨的制作方法，達到消除異種骨內的細胞及其抗原性，保留骨里的必須成分的目的，具有成本低，效益明顯，排斥性幾率非常小的特點。
本發明解決其技術問題所采用的技術方案是一種脫細胞基質異種骨的制作方法，它包括如下步驟；a.去污采用普通洗滌劑將異種骨的骨頭表面的油污等雜質洗凈，然后再用蒸餾水沖洗干凈，涼干后獲得完全的骨頭基質；b.去蛋白在室溫或37℃烤箱的條件下，將上述去污步驟后獲得的骨頭基質放入濃度為15～20％的雙氧水H2O2中浸泡24～48小時，然后再用雙蒸水沖洗至干凈無泡沫為止；c.去酯在室溫條件下，將上述去蛋白步驟后獲得的骨頭基質放入1∶1～3∶1的氯仿∶甲醇的混合液中采用持續震蕩的方式浸泡24～48小時，然后再用雙蒸水循環沖洗至無氯仿和甲醇的味道為止；d.脫細胞在2～5℃條件下，將上述去酯步驟后獲得的骨頭基質放入濃度為0.5～1.0％的十二烷基硫酸鈉SDS和濃度為0.8～1.2％的蛋白酶抑制劑PMSF的混合液中采用攪拌震蕩的方式浸泡24～48小時，然后再用雙蒸水循環沖洗24～48小時；在2～5℃條件下，再將骨頭基質放入濃度為0.1～0.4％的胰蛋白酶中浸泡12～24小時，然后再用雙蒸水循環沖洗20～28小時，獲得脫細胞基質異種骨；e.殺菌消毒、包裝采用凍干機凍干的方式將脫細胞基質異種骨凍干，然后進行封裝，采用環氧乙烷或Co60進行殺菌消毒。
本發明的一種脫細胞基質異種骨的制作方法，所采用的雙氧水H2O2的濃度不宜過濃，若超過20％，容易破壞骨頭的強度。
本發明的一種脫細胞基質異種骨的制作方法，在去酯步驟中，采用了持續震蕩的方式，可以通過完全的混合，達到更好的去酯效果。
本發明的一種脫細胞基質異種骨的制作方法，在脫細胞步驟中，采用了十二烷基硫酸鈉SDS和蛋白酶抑制劑PMSF，十二烷基硫酸鈉是一種常用的陰離子表面活性劑，具有很強的去污力，它的泡沫很豐富，從感官上也給人以很強的去污力；蛋白酶抑制劑本身為固體，需利用丙酮酸進行溶解；在脫細胞的過程中，是采用了低滲的方法使細胞脹破，從而破壞了細胞膜結構，只保留細胞外基質。該方法可以防止細胞在低滲條件下脹破后，釋放細胞內蛋白酶類，分解細胞外基質蛋白，因而基本保留了細胞外基質的有機和無機成份，而去除了細胞的成份，在去除細胞膜結構的同時也去除了膜上的抗原成分，減少了抗原性。實現了在完全保留骨的有機成分和無機成分情況下，使細胞完全脫出。
本發明的一種脫細胞基質異種骨的制作方法，在脫細胞過程中要選擇低溫條件下進行，這樣，才能防止在骨頭的處理過程中出現骨頭腐壞的現象發生。
本發明的有益效果是，由于采用了普通洗滌劑去污蒸餾水沖洗、雙氧水H2O2去蛋白雙蒸水沖洗、氯仿、甲醇混合液去酯雙蒸水循環沖洗、十二烷基硫酸鈉SDS、蛋白酶抑制劑PMSF及胰蛋白酶脫細胞雙蒸水循環沖洗、環氧乙烷或Co60殺菌消毒等過程來處理異種骨，使異種骨在完全保留骨的有機成分和無機成分情況下，細胞完全脫出，從而獲得了脫細胞基質異種骨；該脫細胞基質異種骨排斥性幾率非常小，植入后對受體的全身及局部免疫無明顯影響，具有較好的相容性及骨傳導性；該方法具有原料來源豐富、制作成本低，效益明顯的優點，與市場同類產品相比更具有競爭力。
以下結合實施例對本發明作進一步詳細說明；但本發明的一種脫細胞基質異種骨的制作方法不局限于實施例。
具體實施例方式
實施例一，本發明的一種脫細胞基質異種骨的制作方法，它采用如下步驟制作而成第一步，去污采用普通洗滌劑將異種骨的骨頭表面的油污等雜質洗凈，然后再用蒸餾水沖洗干凈，涼干后獲得完全的骨頭基質。
第二步，去蛋白在室溫或37℃烤箱的條件下，將上述去污步驟后獲得的骨頭基質放入濃度為18％的雙氧水H2O2中浸泡35小時，然后再用雙蒸水沖洗至干凈無泡沫為止；所采用的雙氧水H2O2的濃度不宜過濃，若超過20％，容易破壞骨頭的強度。
第三步，去酯在室溫如25℃條件下，將上述去蛋白步驟后獲得的骨頭基質放入2∶1的氯仿∶甲醇的混合液中采用持續震蕩的方式浸泡35小時，然后再用雙蒸水循環沖洗至無氯仿和甲醇的味道為止；在該步驟中，采用了持續震蕩的方式，可以通過氯仿、甲醇的完全混合，達到更好的去酯效果。
第四步，脫細胞在4℃條件下，將上述去酯步驟后獲得的骨頭基質放入濃度為0.5％的十二烷基硫酸鈉SDS和濃度為1％的蛋白酶抑制劑PMSF的混合液中采用攪拌震蕩的方式浸泡35小時，然后再用雙蒸水循環沖洗24小時；在4℃條件下，再將骨頭基質放入濃度為0.25％的胰蛋白酶中浸泡18小時，然后再用雙蒸水循環沖洗24小時，獲得脫細胞基質異種骨。
第五步，殺菌消毒、包裝采用凍干機凍干的方式將脫細胞基質異種骨凍干，然后進行封裝，采用環氧乙烷或Co60進行殺菌消毒。
本發明的一種脫細胞基質異種骨的制作方法，在脫細胞步驟中，采用了十二烷基硫酸鈉SDS和蛋白酶抑制劑PMSF，十二烷基硫酸鈉是一種常用的陰離子表面活性劑，具有很強的去污力，它的泡沫很豐富，從感官上也給人以很強的去污力；蛋白酶抑制劑本身為固體，需利用丙酮酸進行溶解；在脫細胞的過程中，是采用了低滲的方法使細胞脹破，從而破壞了細胞膜結構，只保留細胞外基質。該方法可以防止細胞在低滲條件下脹破后，釋放細胞內蛋白酶類，分解細胞外基質蛋白，因而基本保留了細胞外基質的有機和無機成份，而去除了細胞的成份，在去除細胞膜結構的同時也去除了膜上的抗原成分，減少了抗原性。實現了在完全保留骨的有機成分和無機成分情況下，使細胞完全脫出。
本發明的一種脫細胞基質異種骨的制作方法，在脫細胞過程中要選擇低溫條件下進行，這樣，才能防止在骨頭的處理過程中出現骨頭腐壞的現象發生。
實施例二，本發明的一種脫細胞基質異種骨的制作方法，它采用如下步驟制作而成第一步，去污采用普通洗滌劑將異種骨的骨頭表面的油污等雜質洗凈，然后再用蒸餾水沖洗干凈，涼干后獲得完全的骨頭基質。
第二步，去蛋白在室溫或37℃烤箱的條件下，將上述去污步驟后獲得的骨頭基質放入濃度為15％的雙氧水H2O2中浸泡48小時，然后再用雙蒸水沖洗至干凈無泡沫為止。
第三步，去酯在室溫如25℃條件下，將上述去蛋白步驟后獲得的骨頭基質放入1∶1的氯仿∶甲醇的混合液中采用持續震蕩的方式浸泡48小時，然后再用雙蒸水循環沖洗至無氯仿和甲醇的味道為止。
第四步，脫細胞在2℃條件下，將上述去酯步驟后獲得的骨頭基質放入濃度為0.85％的十二烷基硫酸鈉SDS和濃度為0.8％的蛋白酶抑制劑PMSF的混合液中采用攪拌震蕩的方式浸泡24小時，然后再用雙蒸水循環沖洗35小時；在5℃條件下，再將骨頭基質放入濃度為0.1％的胰蛋白酶中浸泡12小時，然后再用雙蒸水循環沖洗20小時，獲得脫細胞基質異種骨。
第五步，殺菌消毒、包裝采用凍干機凍干的方式將脫細胞基質異種骨凍干，然后進行封裝，采用環氧乙烷或Co60進行殺菌消毒。
實施例三，本發明的一種脫細胞基質異種骨的制作方法，它采用如下步驟制作而成第一步，去污采用普通洗滌劑將異種骨的骨頭表面的油污等雜質洗凈，然后再用蒸餾水沖洗干凈，涼干后獲得完全的骨頭基質。
第二步，去蛋白在室溫或37℃烤箱的條件下，將上述去污步驟后獲得的骨頭基質放入濃度為20％的雙氧水H2O2中浸泡24小時，然后再用雙蒸水沖洗至干凈無泡沫為止。
第三步，去酯在室溫如25℃條件下，將上述去蛋白步驟后獲得的骨頭基質放入3∶1的氯仿∶甲醇的混合液中采用持續震蕩的方式浸泡24小時，然后再用雙蒸水循環沖洗至無氯仿和甲醇的味道為止。
第四步，脫細胞在5℃條件下，將上述去酯步驟后獲得的骨頭基質放入濃度為1.0％的十二烷基硫酸鈉SDS和濃度為1.2％的蛋白酶抑制劑PMSF的混合液中采用攪拌震蕩的方式浸泡48小時，然后再用雙蒸水循環沖洗48小時；在2℃條件下，再將骨頭基質放入濃度為0.4％的胰蛋白酶中浸泡24小時，然后再用雙蒸水循環沖洗28小時，獲得脫細胞基質異種骨。
第五步，殺菌消毒、包裝采用凍干機凍干的方式將脫細胞基質異種骨凍干，然后進行封裝，采用環氧乙烷或Co60進行殺菌消毒。
權利要求
1.一種脫細胞基質異種骨的制作方法，其特征在于它包括如下步驟；a.去污采用普通洗滌劑將異種骨的骨頭表面的油污等雜質洗凈，然后再用蒸餾水沖洗干凈，涼干后獲得完全的骨頭基質；b.去蛋白在室溫或37℃烤箱的條件下，將上述去污步驟后獲得的骨頭基質放入濃度為15～20％的雙氧水H2O2中浸泡24～48小時，然后再用雙蒸水沖洗至干凈無泡沫為止；c.去酯在室溫條件下，將上述去蛋白步驟后獲得的骨頭基質放入1∶1～3∶1的氯仿∶甲醇的混合液中采用持續震蕩的方式浸泡24～48小時，然后再用雙蒸水循環沖洗至無氯仿和甲醇的味道為止；d.脫細胞在2～5℃條件下，將上述去酯步驟后獲得的骨頭基質放入濃度為0.5～1.0％的十二烷基硫酸鈉SDS和濃度為0.8～1.2％的蛋白酶抑制劑PMSF的混合液中采用攪拌震蕩的方式浸泡24～48小時，然后再用雙蒸水循環沖洗24～48小時；在2～5℃條件下，再將骨頭基質放入濃度為0.1～0.4％的胰蛋白酶中浸泡12～24小時，然后再用雙蒸水循環沖洗20～28小時，獲得脫細胞基質異種骨；e.殺菌消毒、包裝采用凍干機凍干的方式將脫細胞基質異種骨凍干，然后進行封裝，采用環氧乙烷或Co60進行殺菌消毒。
全文摘要
本發明公開了一種脫細胞基質異種骨的制作方法，它包括普通洗滌劑去污蒸餾水沖洗、雙氧水H
文檔編號A61F2/28GK1903382SQ20051004433
公開日2007年1月31日 申請日期2005年7月29日 優先權日2005年7月29日
發明者芮鋼, 王者生, 高景恒 申請人:芮鋼