專(zhuān)利名稱(chēng)：白細(xì)胞介素－18突變體、其制品及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物活性比野生型蛋白質(zhì)高的IL-18突變體。
背景技術(shù)：
1989年有人(Nakamura等人，1993)敘述了一種內(nèi)毒素誘導(dǎo)的血清活性，該活性誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞的干擾素-γ(IFN-γ)。這種血清活性所起的作用不是IFN-γ的直接誘導(dǎo)劑，而是與IL-2、IFN-/、TNF或有絲分裂原一起起著共同刺激劑的作用。有人嘗試由內(nèi)毒素后小鼠血清提純這種活性，結(jié)果揭示了一種分子量為50-55kDa表觀均一的蛋白質(zhì)(Nakamura等人，1993)。由于其他細(xì)胞因子可以作為IFN-γ的產(chǎn)生的共同刺激劑，所以無(wú)法通過(guò)中和抗IL-1、IL-4、IL-5、IL-6或TNF的抗體來(lái)中和血清活性表明它是一種截然不同的因子。同一批科學(xué)家在1995年證實(shí)了以瘡皰棒狀桿菌(P.acnes)預(yù)處理的小鼠肝臟提取物中含有由內(nèi)毒素誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ的共同刺激劑(Okamura等人，1995)。此模型的肝臟巨噬細(xì)胞群(Kupffer細(xì)胞)擴(kuò)展，低劑量細(xì)菌脂多糖(LPS)在未經(jīng)預(yù)處理的小鼠中是不致命的，但在這些小鼠是可致命的。該因子被命名為IFN-γ誘導(dǎo)因子(IGIF)，后來(lái)又被稱(chēng)為白細(xì)胞介素-18(IL-18)，由1,200克經(jīng)瘡皰棒狀桿菌處理過(guò)的小鼠肝臟提純至均質(zhì)。采用由純化IL-18的氨基酸序列所產(chǎn)生的簡(jiǎn)并寡核苷酸來(lái)克隆小鼠IL-18 cDNA(Okamura等人，1995)。在活化的巨噬細(xì)胞中不難檢測(cè)到IL-18和白細(xì)胞介素-12(IL-12)的信使RNAs。IL-18本身不會(huì)誘導(dǎo)IFN-γ，但其主要功能是與有絲分裂原或IL-12一起作為共同刺激劑。IL-18的人cDNA序列在1996年已有報(bào)導(dǎo)(圖1A所示的SEQ ID NO1)。
白細(xì)胞介素IL-18具有IL-1蛋白質(zhì)家族的結(jié)構(gòu)特征(Nakamura等人，1993；Okamura等人，1995；Ushio等人，1996；Bazan等人，1996)。與其他大多數(shù)具有四螺旋束結(jié)構(gòu)的細(xì)胞因子不同，IL-18和IL-1β全部為β-折疊結(jié)構(gòu)(Tsutsui等人，1996)。IL-18與IL-1β相似，被合成為一種沒(méi)有生物活性的前體(proIL-18)，缺少信號(hào)肽(Ushio等人，1996)。IL-1β和IL-18前體由caspase 1(IL-1β轉(zhuǎn)化酶或ICE)在P1位置上天冬氨酸殘基之后割開(kāi)。所得到的成熟細(xì)胞因子較易從細(xì)胞釋放出來(lái)(Ghayur等人，1997和Gu等人，1997)。
IL-18是一種通過(guò)T輔助I型(Th1)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-2和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子)的共同刺激劑(Kohnoet等人，1997)，也是小鼠天然殺傷細(xì)胞克隆由FAS配體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的共同刺激劑(Tsutsui等人，1996)。
Th1淋巴細(xì)胞參與抗腫瘤的免疫反應(yīng)(Seki等人，2000)。Th1反應(yīng)包括分泌細(xì)胞因子IL-2、IL-12、IL-18和IFN-γ，以及產(chǎn)生識(shí)別特異性腫瘤抗原的具有細(xì)胞毒性的特異性T淋巴細(xì)胞。Th1反應(yīng)也是宿主防御許多微生物的一條生命臂(vitalarm)。然而，Th1反應(yīng)也與不希望的副作用相關(guān)，如產(chǎn)生一些自身免疫疾病、炎癥和器官移植排斥。
試圖用編碼成熟蛋白的載體來(lái)表達(dá)大腸桿菌的成熟型IL-18也無(wú)法提供具有完全活性的細(xì)胞因子。有人研制了一個(gè)產(chǎn)生具有完全生物活性的人IL-18的有效表達(dá)系統(tǒng)供治療使用，例如，需要誘導(dǎo)IFN-γ的惡性腫瘤或任何一種病情(WO00/61768)。在此系統(tǒng)中，將IL-18前體caspase 1切割位點(diǎn)改為Xa因子位點(diǎn)(ICE/Xa)，并采用編碼IL-18 ICE/Xa前體的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌。在大腸桿菌表達(dá)該IL-18前體后，在體外通過(guò)Xa因子切割產(chǎn)生成熟IL-18。這種由Xa因子切割產(chǎn)生的成熟IL-18具有完全活性。
細(xì)胞因子結(jié)合蛋白(可溶性細(xì)胞因子受體)通常是其各自細(xì)胞表面細(xì)胞因子受體的胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。它們或通過(guò)可變換的剪接或通過(guò)細(xì)胞表面受體蛋白裂解而產(chǎn)生。過(guò)去已對(duì)這些可溶性受體進(jìn)行了敘述，例如，IL-6和IFN-γ的可溶性受體(Novick等人，1989)、TNF(Engelmann等人，1989；Engelmann等人，1990)、IL-1和IL-4(Maliszewski等人，1990)、IFN-α/β(Novick等人，1994；Novick等人，1992)。一種稱(chēng)為骨保護(hù)素(OPG，也稱(chēng)破骨抑制因子-OCIF)的細(xì)胞因子結(jié)合蛋白是TNFR/Fas家族的成員，它似乎是僅作為分泌蛋白而存在的第一種可溶性受體(Anderson等人，1997；Simonet等人，1997；Yasuda等人，1998)。
通過(guò)在IL-18柱上進(jìn)行親和純化從尿中得到了結(jié)合IL-18的蛋白質(zhì)(IL-18BP)(Novick等人，1999)。IL-18BP在體外消除了IL-18對(duì)IFN-γ和IL-8的誘導(dǎo)以及對(duì)NF-κB的活化，在體內(nèi)消除了IL-18對(duì)IFN-的誘導(dǎo)。IL-18BP是一種可溶性循環(huán)蛋白，在脾中固有地表達(dá)，屬于免疫球蛋白超家族。最富含的IL-18BP同種型(剪接變體同種型a)對(duì)IL-18具有高親和力，結(jié)合速率快，解離速率慢，解離常數(shù)(Kd)約為400pM(Kim等人，1999)。
有人利用計(jì)算機(jī)模型(Kim等人，1999)和基于IL-1與IL-1R I型的相互作用(Vigers等人，1997)對(duì)參與IL-18和IL-18BP相互作用的殘基進(jìn)行了敘述。在IL-18與IL-18BP結(jié)合的模型中，提出將IL-18的42位上Glu殘基和89位上Lys殘基分別與IL-18BP的Lys-130和Glu-114結(jié)合(Kim等人，1999)。
IL-18固有地存在于許多細(xì)胞中(Puren等人，1999)，并在健康人體內(nèi)循環(huán)(Urushihara等人，2000)。IL-18BP對(duì)IL-18具有高親和力以及在循環(huán)中IL-18BP的濃度高(相對(duì)IL-18過(guò)量20倍摩爾)，表示細(xì)胞因子生物學(xué)的獨(dú)有狀況。所以，在循環(huán)中即使不是全部但大部分IL-18分子與IL-18BP結(jié)合。與IL-18的細(xì)胞表面受體競(jìng)爭(zhēng)的循環(huán)IL-18BP可用作天然消炎和免疫抑制分子。
一些病毒因子編碼的IL-18BP相似蛋白質(zhì)，例如傳染性軟疣病毒性蛋白MC53和MC54，與哺乳動(dòng)物IL-18BP高度同源(Novick等人，1999)。傳染性軟疣病毒性蛋白MC53和MC54具有結(jié)合與中和人IL-18的能力，方式與IL-18BP相似(Xiang和Moss，1999)。缺肢痘病毒p13蛋白質(zhì)與IL-18BP同源，在體外與IL-18結(jié)合，并抑制其活性。感染p13缺失突變病毒的小鼠顯示感染水平下降(Born等人，2000)。故感染程度似乎與是否有IL-18BP相關(guān)。
循環(huán)IL-18BP的水平高可能表示一種自然防御，這種防御針對(duì)自身免疫疾病的感染和發(fā)病的失控Th1反應(yīng)。然而，IL-18有利于在抗腫瘤宿主防御中起重要作用的Th1反應(yīng)。因此，IL-18BP可能會(huì)使宿主無(wú)法產(chǎn)生抗腫瘤細(xì)胞且具有細(xì)胞毒性的T細(xì)胞。事實(shí)上，有證據(jù)顯示，IL-18在小鼠體內(nèi)啟動(dòng)抗腫瘤的宿主防御。例如，同系小鼠中表達(dá)小鼠IL-12或小鼠IL-18的小鼠乳腺癌細(xì)胞與不表達(dá)細(xì)胞的對(duì)照組相比，致癌性更低，腫瘤形成的速度更慢(Coughlin等人，1998)。抗體中和作用研究顯示抗癌作用需要IFN-γ。在另一項(xiàng)研究中，全身給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物IL-18和表達(dá)B7-1(CD80)的B16黑素瘤，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黑素瘤的形成、腫瘤的生長(zhǎng)受到顯著抑制，而生存能力有很大的改善(Cho等人，2000)。
采用細(xì)胞因子作為輔助劑，提高癌癥的免疫治療效果。例如，給予IL-12治療腎臟細(xì)胞癌或黑素瘤(Gollob等人，2000)。通常，用細(xì)胞因子進(jìn)行治療的一個(gè)主要后果是嚴(yán)重的全身中毒。采用由患者自身腫瘤或樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子在邏輯上是解決問(wèn)題的一個(gè)方案。但如果IL-18在腫瘤免疫治療中作為輔助劑局部使用，則固有水平的IL-18BP在局部環(huán)境內(nèi)中和IL-18的能力仍得到發(fā)揮，其結(jié)果是效果被大大削弱。
采用非清髓同種異體移植即所謂微型移植物治療白血病和固態(tài)瘤，在誘導(dǎo)移植物抗白血病和移植物抗腫瘤的反應(yīng)方面不斷取得成功(Slavin S.，2000；Slavin等人，2000)。有兩項(xiàng)研究采用了同種異體外周血干細(xì)胞(Childs等人，2000)或樹(shù)突狀細(xì)胞(Kugler等人，2000)來(lái)治療轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌病人，結(jié)果取得了令人矚目的成功。雖然這些研究還有待深入研究和證實(shí)，但移植物抗腫瘤的反應(yīng)可用于癌癥的免疫治療這一概念正得到越來(lái)越多人接受(Slavin等人，2000)。因?yàn)镮L-18似乎與這些獲得成功的治療方法有關(guān)，所以如果可消除IL-18BP的中和作用，就可以獲得更好的結(jié)果。
EP 0845530敘述了IL-18突變體(IFN-γ、誘導(dǎo)因子)。所述的IL-18突變體是這些一些分子，其IL-18的1、2、3或全部4個(gè)半胱氨酸殘基(圖1B)被絲氨酸或丙氨酸殘基取代。這些突變體含有一個(gè)完整的共有序列(圖1B)。所有分離的突變體具有比野生型IL-18更好的穩(wěn)定性。突變體的穩(wěn)定程度與分子中被取代的半胱氨酸殘基數(shù)直接成正比。EP 0845530沒(méi)有對(duì)IL-18BP中和這些突變體的能力予以敘述。
所以，高度優(yōu)選的是產(chǎn)生以及在治療上使用不能與IL-18BP結(jié)合或以低親和力結(jié)合且具有完全活性的IL-18。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種IL-18突變體多肽，其包括一個(gè)或多個(gè)與IL-18結(jié)合蛋白相互作用的氨基酸殘基上的突變。更加具體地說(shuō)，這些突變是取代，優(yōu)選為非保守性取代，插入或缺失。所述肽中發(fā)生突變的這些殘基可選自Glu-42、Ile-85、Met-87、Lys-89、Met-96、Asp-130、Lys-132、Pro-143、Met-149和Leu-189，優(yōu)選為Glu-42和Lys-89。
在一實(shí)施例中，Glu-42或Lys-89或者Glu-42和Lys-89兩者都被非極性氨基酸，優(yōu)選被丙氨酸所取代。
另外，本發(fā)明提供了編碼所述多肽的DNA，優(yōu)選為編碼SEQ ID NO3、SEQ IDNO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7或SEQ ID NO8的多肽的DNA。
在一實(shí)施例中，編碼SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8的DNA與信號(hào)肽，優(yōu)選與人生長(zhǎng)激素信號(hào)肽融合。此外，本發(fā)明還提供了一種含有所述DNA的載體，該載體能夠在合適的宿主細(xì)胞，例如原核生物或真核生物宿主細(xì)胞中表達(dá)由所述DNA編碼的多肽。
另外，本發(fā)明還提供了含有所述多肽的藥物組合物，其用來(lái)治療通過(guò)Th1反應(yīng)可被預(yù)防或減緩的疾病，優(yōu)選用于治療病毒性疾病或癌癥。


圖1A所示為編碼野生型IL-18前體的核苷酸序列和用來(lái)構(gòu)建突變IL-18蛋白的引物位置。
圖1B所示為成熟IL-18的氨基酸序列。白框中所包含的為不同種IL-18之間的共有序列。下劃線(xiàn)者為半胱氨酸。深色框所示為本發(fā)明IL-18中發(fā)生突變的殘基。
圖2所示為本發(fā)明IL-18突變體的示意圖。His-6表示融合在IL-18前體前段(propiece)N末端上的6個(gè)組氨酸位置。箭頭表示被Xa因子切割位點(diǎn)(x)所取代的ICE切割位點(diǎn)。WT表示野生型成熟IL-18。E42A表示G1u-42向Ala的突變，K89A表示Lys-89向Ala的突變，E42A/K89A表示雙重突變。在前體/x/WT的基礎(chǔ)上，通過(guò)兩步PCR產(chǎn)生了三種IL-18突變體(E42A、K89A和E42A+K89A)。
圖3A所示為在圖3B X軸下面所示濃度以及在IL-12(0.5納克/毫升)存在下由IL-18野生型和突變蛋白在NKO細(xì)胞中誘導(dǎo)IFN-γ。
圖3B所示為在X軸下面所示濃度以及在IL-12(1.0納克/毫升)存在下由IL-18野生型和突變蛋白在PBMCs細(xì)胞中誘導(dǎo)IFN-γ。
圖4A所示為IL-18BP對(duì)人IL-18野生型和突變蛋白在NKO細(xì)胞中誘導(dǎo)IFN-γ的影響。室溫下將突變體和野生型IL-18(30納克/毫升)與X軸(圖3B)下面所示濃度的IL-18BP預(yù)培育1小時(shí)，再加入到NKO細(xì)胞，用IL-12(0.5毫克/毫升)刺激。
圖4B所示為IL-18BP對(duì)人IL-18野生型和突變蛋白在PBMCs細(xì)胞中誘導(dǎo)IFN-γ的影響。室溫下將突變體和野生型IL-18(30納克/毫升)與X軸下面所示濃度的IL-18BP預(yù)培育1小時(shí)，再加入到PBMCs細(xì)胞，用IL-12(1.0毫克/毫升)刺激。
圖5所示為由IL-18野生型和突變蛋白誘導(dǎo)IL-8。將PBMCs與IL-18野生型和突變蛋白(30納克/毫升)一起培育。多黏菌素B(1克/毫升)在加入PBMCs之前將它與IL-18混合30分鐘。24小時(shí)后，移去上清液，以ECL(實(shí)施例9)分析IL-18的濃度。圖中示出三個(gè)實(shí)驗(yàn)其中之一。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及IL-18突變體或其活性片段、或突變蛋白質(zhì)或其任何一種其他蛋白質(zhì)或肽衍生物(IL-18M)，它們與野生型(IL-18WT)相比更不易被IL-18BP中和。具體地說(shuō)，IL-18野生型的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，宜不超過(guò)30個(gè)，優(yōu)選最高為10個(gè)氨基酸，可被其他氨基酸取代，或被除去，或者可加入一個(gè)或多個(gè)氨基酸，宜不超過(guò)30個(gè)，優(yōu)選最高為10個(gè)氨基酸，以產(chǎn)生一種更不易被IL-18BP中和的活性IL-18突變體。氨基酸可被不同的氨基酸所取代，這種取代最好是非保守性取代。更具體地說(shuō)，所述的突變可針對(duì)預(yù)料參與結(jié)合IL-18BP的殘基，例如，Glu-42、Ile-85、Met-87、Lys-89、Met-96、Asp-130、Lys-132、Pro-143、Met-149和Leu-189，更優(yōu)選為Glu-42和/或Lys-89(Kim等人，1999)。
IL-18M可在真核生物系統(tǒng)或真核生物表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)或周質(zhì)產(chǎn)生，或者可分泌到介質(zhì)中。所產(chǎn)生的IL-18M可恢復(fù)為可溶性或非可溶性形式(內(nèi)含體)。
一種含有前體IL-18M cDNA的載體可用來(lái)表達(dá)在原核生物系統(tǒng)中正確裝配的前體IL-18M。然后，在體外通過(guò)ICE切割后可產(chǎn)生具有完全活性的成熟蛋白質(zhì)。編碼一種蛋白酶，優(yōu)選Xa因子的特異性切割位點(diǎn)的序列可置換IL-18M前體的ICE序列。
一種編碼與成熟IL-18M cDNA融合的有效信號(hào)肽，優(yōu)選人生長(zhǎng)激素信號(hào)肽的表達(dá)載體可用于真核生物的表達(dá)和分泌。
用于構(gòu)建突變體的親代IL-18cDNA可選自小鼠或人。
IL-18M可用表位標(biāo)記，最好用組氨酸標(biāo)記，方便提純。重組IL-18M可用常規(guī)方法或親和力方法純化。利用特異性酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)可監(jiān)測(cè)所產(chǎn)生的IL-18M的量。
IL-18M可用于藥物制劑，以治療通過(guò)Th1反應(yīng)特別是通過(guò)IL-18治療可被預(yù)防或減緩的疾病，例如微生物感染或癌癥。采用突變體而不用野生型蛋白質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)在于它可抗IL-18BP中和。
更具體地說(shuō)，IL-18M可全身或局部給予，在腫瘤治療中作為腫瘤抗原輔助劑。
可以分離病人的腫瘤細(xì)胞，并作基因改造以分泌IL-18M，再重新移植到同一個(gè)病人體內(nèi)，作局部接種疫苗(Coughlin等人，1998)。將表達(dá)IL-18M的改造細(xì)胞與同種異體樹(shù)突狀細(xì)胞(抗原遞呈細(xì)胞)融合可進(jìn)一步提高腫瘤的抗原性，因此增強(qiáng)抗腫瘤反應(yīng)。
IL-18M在DNA接種疫苗中可作為輔助劑而給予(Tuting等人，1998)。與先前報(bào)導(dǎo)的使用細(xì)胞因子IL-12和IFN-γ的方式相似。在此情況下，利用基因槍可接種透皮腫瘤抗原疫苗。這導(dǎo)致皮膚中具有編碼腫瘤抗原和IL-18M的DNA的駐留樹(shù)突狀細(xì)胞轉(zhuǎn)染。另外，樹(shù)突狀細(xì)胞也可在過(guò)繼轉(zhuǎn)移后進(jìn)行體外改造。
IL-18M可用作移植物抗腫瘤治療的輔助劑。采用同種異體干細(xì)胞來(lái)移植癌癥病人。為了增加由同種異體細(xì)胞的移植所誘導(dǎo)的移植物抗腫瘤排斥，可全身或局部給予IL-18M，優(yōu)選通過(guò)在經(jīng)過(guò)基因改造的同系樹(shù)突狀細(xì)胞或病人抽取腫瘤細(xì)胞中的IL-18M表達(dá)給予。
應(yīng)明白，本文結(jié)合優(yōu)選具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了敘述，上述說(shuō)明以及下列實(shí)施例是用來(lái)作舉例說(shuō)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。本發(fā)明范圍內(nèi)的其他方面、優(yōu)點(diǎn)和改進(jìn)對(duì)本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。
實(shí)施例實(shí)施例1用于通過(guò)Xa因子切割來(lái)表達(dá)野生型proIL-18組氨酸標(biāo)記融合蛋白的載體的構(gòu)建為了在大腸桿菌中產(chǎn)生正確裝配的IL-18，用Xa切割位點(diǎn)代替IL-18前體的ICE切割位點(diǎn)。然后，在體外通過(guò)Xa切割I(lǐng)L-18前體而產(chǎn)生活性蛋白(WO 00/61768)。
如所述那樣(Ghayur等人，1997)，分離編碼用來(lái)產(chǎn)生表達(dá)質(zhì)粒的人IL-18前體(proiL-18，基因庫(kù)查詢(xún)號(hào)為D49950，圖1)的cDNA序列(Ghayur等人，1997)。
采用2次PCR反應(yīng)(參見(jiàn)圖1所用的引物)就可以實(shí)現(xiàn)用Xa切割位點(diǎn)代替ICE切割位點(diǎn)。第1次PCR反應(yīng)用含有位于ORF上游EcoR1位點(diǎn)的有義引物(Pr1)5’-ATATGAATTCATGGCTGCTGAACCAGTAG(SEQ ID NO11)和為ICE位點(diǎn)(33-LESD-36)而設(shè)計(jì)且其中6個(gè)核苷酸已被改成編碼Xa因子位點(diǎn)(33-IEGR-36)的反向引物(Pr2)5’-AAAGTAACGTCCTTCGATGTTTTC(SEQ ID NO12)，產(chǎn)生了IL-18cDNA的前段。采用與Pr2互補(bǔ)的有義引物(Pr3)5’-GAAAACATCGAAGGACGTTACTTT(SEQ IDNO13)和含有IL-18編碼序列下游BamHI位點(diǎn)的反向引物(Pr4)5’-ATATGGATCCTAGTCTTCGTTTTGAACAGTG(SEQ ID NO14)，產(chǎn)生了編碼成熟IL-18的擴(kuò)增DNA片段。通過(guò)在1％瓊脂糖電泳溶解前段108bp和成熟的474bp IL-18 DNAs，并用凝膠提取系統(tǒng)(GIBCO/BRL)洗脫。
第2次PCR反應(yīng)取2段在第1次PCR反應(yīng)中獲得的DNA片段，以1∶1混合，與引物Pr1和Pr4一起產(chǎn)生了完全人IL-18 cDNA，其ICE位點(diǎn)被Xa因子位點(diǎn)所取代(ICE/Xa)。
以EcoRI和BamHI(GIBCO/BRL)限制位點(diǎn)將proIL-18(ICE/Xa)與BlueScipt質(zhì)粒(Stratagene)連接。這種質(zhì)粒用來(lái)作序列確認(rèn)。預(yù)測(cè)被編碼的氨基酸序列參見(jiàn)SEQ ID NO2。對(duì)于大腸桿菌表達(dá)，借助EcoRI和XbaI位點(diǎn)(源自BlueScipt)將IL-18 DNA插入片段與pROEX HTa載體(GIBCO/BRL)重新連接。在這種載體中，所得的蛋白質(zhì)在N末端上與組氨酸標(biāo)記融合。
實(shí)施例2E42A、K89A和E42A/K89A突變體的構(gòu)建在預(yù)料對(duì)結(jié)合抑制劑IL-18BP至關(guān)重要的殘基上建立IL-18突變(Kim等人，2000)。產(chǎn)生了三種突變體E42A、K89A和E42A/K89A。如實(shí)施例1所述，采用下面的引物和模板(引物見(jiàn)圖2)通過(guò)2次PCR反應(yīng)就可實(shí)現(xiàn)突變。
E42A突變體第1次PCR反應(yīng)制備突變體E42A所用的引物對(duì)是A對(duì)——Pr1(實(shí)施例1)和編碼丙氨酸而非谷氨酸(E42)的反向引物(Pr5)5’-TAA TTT AGA TGC AAG CTT GCC(SEQ ID NO15)與B對(duì)——編碼丙氨酸而非谷氨酸(GAA到GCA)的有義引物(Pr6)5’-GGC AAG CTT GCA TCT AAA TTA(SEQ ID NO16)和反向引物Pr4(實(shí)施例1)，以proIL-18(ICE/Xa)作為PCR反應(yīng)的模板。
第2次PCR反應(yīng)取2段在第1次PCR反應(yīng)中獲得的DNA片段，作為第2次PCR反應(yīng)的模板，引物為Pr1和Pr4。
K89A突變體第1次PCR反應(yīng)制備突變體K89A所用的引物對(duì)是A對(duì)——Pr1(實(shí)施例1)和編碼丙氨酸而非賴(lài)氨酸(K89)的反向引物(Pr7)5’-CTG GCT ATC TGC ATA CAT ACT(SEQ ID NO17)與B對(duì)——編碼丙氨酸而非賴(lài)氨酸(AAA到GCA)的有義引物(Pr8)5’-AGT ATG TAT GCA GAT AGC CAG(SEQ ID NO18)和反向引物Pr4(實(shí)施例1)，以proIL-18(ICE/Xa)作為第1次PCR反應(yīng)的模板。
第2次PCR反應(yīng)取2段在第1次PCR反應(yīng)中獲得的DNA片段，作為第2次PCR反應(yīng)的模板，引物為Pr1和Pr4。
E42A/K89A突變體雙重突變E42A/K89A所用的引物與制備E42A突變所用的引物相同，用突變體K89A cDNA作為反應(yīng)模板。
三種IL-18突變基因之每一種均與BlueScipt載體連接，以便作序列確認(rèn)。前體IL-18 E42A、K89A和E42A/K89A突變體的預(yù)測(cè)氨基酸序列分別參見(jiàn)SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5。對(duì)于大腸桿菌表達(dá)，借助EcoRI和XbaI位點(diǎn)可將三種IL-18DNA插入片段之每一種與pROEX HTa載體(GIBCO/BRL)重新連接。所得的蛋白質(zhì)在N末端上與組氨酸融合(圖1)。
實(shí)施例3蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化IL-18突變體前體在大腸桿菌中表達(dá)，通過(guò)組氨酸標(biāo)記親和純化，利用Xa因子進(jìn)行蛋白酶切割產(chǎn)生了各個(gè)成熟分子。
按照文獻(xiàn)(11)所述那樣，將四種pROEX HTu/IL-18質(zhì)粒(野生型和三種突變體)中每一種導(dǎo)入DHO菌株(GIBCO/BRL)的感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中，并得到表達(dá)。取25毫升過(guò)夜培養(yǎng)，用作450毫升含有100微克/毫升氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基的接種物，讓其生長(zhǎng)至細(xì)胞密度為0.6-0.1 OD600。用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG，0.3mM)處理誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)，在37℃連續(xù)搖動(dòng)培養(yǎng)3小時(shí)。離心(4℃下5,000xg離心15分鐘)收獲培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞，將沉淀懸于30毫升Talon緩沖液(50mM磷酸二氫鈉/20mMTris-HCl/100mM氯化鈉，pH8)中。在冰上超聲波(2x30秒脈沖)溶解細(xì)胞。離心(4℃下4,000xg離心30分鐘)得到可溶性蛋白質(zhì)，將這些蛋白質(zhì)裝在3毫升微型Talon柱(CLONTECH)內(nèi)。用30床容積的Talon緩沖液洗滌Talon柱，用含6毫升100mM咪唑的Talon緩沖液洗脫。在4℃下將洗脫液對(duì)Xa因子緩沖液(20mM Tris-HCl/150mM氯化鈉/2mM氯化銫)透析20小時(shí)。取0.2毫升經(jīng)Talon親和純化的N末端His x 6融合proIL-18，室溫下在2mM苯甲基磺酰氟(GIBCO/BRL)存在下與4微克Xa因子酶(New England Biolabs)培養(yǎng)4小時(shí)。用特異性ELISA(R&D Systems)監(jiān)測(cè)所產(chǎn)生的IL-18的量。成熟IL-18野生型、E42A、K89A和E42A/K89A突變體的預(yù)測(cè)氨基酸序列分別參見(jiàn)SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8。
實(shí)施例4通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法對(duì)E42A、K89A和E42A/K89A IL-18突變蛋白作特性分析用對(duì)成熟IL-18具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體對(duì)純化的IL-18突變體作蛋白質(zhì)印跡分析。
使等量經(jīng)過(guò)Talon親和純化的前體和成熟蛋白(被Xa因子切割后)的野生型和突變體IL-18在還原條件下通過(guò)SDS/PAGE(10％丙烯酰胺)解離。將這些蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜，再與一級(jí)抗體(兔抗人IL-18多克隆抗體或單克隆抗體克隆8-31-4(IgG2a)，它們抗重組成熟形式的人IL-18(Puren等人，1999)，也可識(shí)別前體IL-18)一起培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時(shí)后，加入相應(yīng)的第二抗體山羊抗小鼠或驢抗兔IgG過(guò)氧化物酶(Jackson Immuno Research)，并通過(guò)ECL法(New England Nuclear LifeScience Products)進(jìn)行分析。
對(duì)于野生型和各種突變體，用多克隆兔抗人IL-18得到的proIL-18的染色程度相等。類(lèi)似地，成熟野生型和IL-18以及各種突變體用多克隆抗血清所得到的信號(hào)強(qiáng)度相等。表觀分子量表示不同形式的IL-18具有正確的分子大小。與之相反，當(dāng)采用單克隆抗體時(shí)，兩種突變體K89A和E42A/K89A的染色似乎比野生型和E42A突變體深，提示單克隆抗體對(duì)于這些突變體的親和力較大。這些結(jié)果表明突變體K89A和E42A/K89A可能具有不同的構(gòu)象，因而親和力較高。
實(shí)施例5對(duì)E42A、K89A和E42A/K89A IL-18突變蛋白的生物活性的特性分析本實(shí)施例分析了純化的成熟IL-18/ICE/Xa在人天然殺傷細(xì)胞(實(shí)施例8所述的NKO)、在PMBCs(實(shí)施例7)中對(duì)IFN-γ的共同誘導(dǎo)以及在PMBCs中對(duì)IL-8的誘導(dǎo)。
IL-18不會(huì)在這些細(xì)胞中誘導(dǎo)IFN-γ，除非用IL-12(或IL-15)作為共同刺激劑。低濃度的IL-12(1-2納克/毫升(PreproTech Rocky Hill，NJ))誘導(dǎo)小量IFN-γ，然而，用IL-12與IL-18一起處理則大幅提高IFN-γ的產(chǎn)量。按實(shí)施例9所述那樣，監(jiān)測(cè)細(xì)胞中產(chǎn)生的IFN-γ。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野生型IL-18/ICE/Xa和IL-12在NKO中誘導(dǎo)的IFN-γ與由ICE加工proIL-18所得的重組成熟人IL-18(Gu等人，1997)及IL-12所誘導(dǎo)的IFN-γ相當(dāng)。這些結(jié)果表示IL-18在大腸桿菌中正確裝配并通過(guò)Xa因子被正確加工。
為了測(cè)試發(fā)生突變的IL-18的活性，在NKO細(xì)胞中用突變體或野生型IL-18與IL-12一起刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ，并加以評(píng)估(統(tǒng)計(jì)學(xué)分析參見(jiàn)實(shí)施例10所述)。如圖3A所示，野生型IL-18作為IFN-γ的誘導(dǎo)劑具有活性，開(kāi)始濃度為7.5納克/毫米，逐漸增大到60納克/毫米(最高測(cè)試濃度)。每一種IL-18突變形式在這些細(xì)胞中都顯示生物活性比野生型高。例如，每個(gè)測(cè)試濃度單突變E42A的活性都是野生型的2倍。在濃度為7.5納克/毫米時(shí)單突變K89A的活性比野生型高4倍。雙突變E42A/K89的IL-18活性最高。如圖3A所示，發(fā)生E42A突變的IL-18在30納克/毫升時(shí)誘導(dǎo)600皮克/毫升IFN-γ，這是用60納克/毫升野生型預(yù)處理所觀察到的最大活性，而所需K89A突變體的濃度為15納克/毫升，雙突變體的濃度為7.5納克/毫升。由此可見(jiàn)，突變體E42A、K89A和雙突變體的活性比野生型分別高2、4和8倍。
在新鮮分離的人PBMCs中測(cè)試了IFN-γ的產(chǎn)生，也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的結(jié)果(實(shí)施例7)。在這些細(xì)胞中，IL-12和IL-18共同刺激的結(jié)果會(huì)產(chǎn)生IFN-γ，而這兩種細(xì)胞因子單獨(dú)一種均無(wú)法誘導(dǎo)IFN-γ。雙突變體E42A/K89A的活性最高(圖3B)。
結(jié)果顯示，由Ala殘基置換兩種帶電氨基酸Glu 42和/或Lys 89總會(huì)增加IL-18的生物活性。
IL-18在PBMC制劑的CD14+細(xì)胞中誘導(dǎo)IL-8已為人所知(見(jiàn)實(shí)施例7所述)。雖然IL-18在這些細(xì)胞內(nèi)無(wú)需IL-12的共同刺激就可誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-8，但I(xiàn)L-8的誘導(dǎo)與IFN-γ的誘導(dǎo)相比需要更高濃度的IL-18。所以，測(cè)試了由IL-18野生型和突變體刺激PBMCs而誘導(dǎo)的IL-8。采用實(shí)施例9所述的特異性分析方法監(jiān)測(cè)在細(xì)胞介質(zhì)內(nèi)所產(chǎn)生的IL-8。圖4顯示，雖然兩種單突變?cè)贗L-8的誘導(dǎo)方面與野生型相當(dāng)，但發(fā)生雙突變的IL-18誘導(dǎo)的IL-8比野生型多得多(3.5倍)。
結(jié)果顯示，雙突變體E42A/K89A的生物活性最高。
實(shí)施例6用IL-18BP中和IL-18突變體利用抑制劑IL-18BP在預(yù)料對(duì)IL-18結(jié)合起重要作用的殘基上設(shè)計(jì)了突變。所以，特別評(píng)估了IL-18BP中和IL-18生物活性的能力，例如IFN-γ的產(chǎn)生(實(shí)施例8)。
將不同濃度的IL-18BP(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的“a”同種型產(chǎn)生了重組his-6標(biāo)記的人IL-18BP(由以色列Interpharm Laboratories，Ness Ziona的Kim等人提供，2000年))與野生型IL-18或其突變形式(終濃度為30納克/毫升)一起培養(yǎng)，再加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中。
如圖4A所示，IL-18BP用于由野生型IL-18共同誘導(dǎo)NKO細(xì)胞中IFN-γ的50％抑制濃度約15納克/毫升(假設(shè)IL-18BP的濃度為3.7納克/毫升時(shí)沒(méi)有發(fā)生抑制，這一數(shù)值表示為100％活性)。用IL-18BP抑制E42A單突體也得到了相似的劑量-抑制濃度。
然而，當(dāng)突變體K89A與IL-18BP培養(yǎng)時(shí)，其作為NKO細(xì)胞中IFN-γ共同誘導(dǎo)劑的能力或多或少被中和了(圖5A)。僅在濃度為120納克/毫升時(shí)才發(fā)現(xiàn)活性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的下降。與此相反，IL-18BP不能中和雙突變體E42A/K89A。
如圖4B所示，當(dāng)在PBMCs而非NKO細(xì)胞內(nèi)測(cè)試時(shí)，IL-18更易被IL-18BP中和。IL-18BP中和野生型IL-18所需的量是3.7納克/毫升，這是最低測(cè)試濃度。由IL-18BP在PBMCs中和其生物活性的濃度低這一觀察結(jié)果可以確定，單突變E42A的行為與野生型相似。與之相比，單突變K89A的中和濃度是120納克/毫升。與IL-18BP在NKO細(xì)胞內(nèi)中和IL-18突變體的結(jié)果相似，雙突變體E42A/K89A在PBMCs內(nèi)僅受IL-18BP輕微影響。
結(jié)果顯示，突變體E89A和雙突變體E42A/K89A受天然抑制劑IL-18BP的影響很少。
實(shí)施例7外周血單核細(xì)胞(PBMCs)的分離和培養(yǎng)以及IFN-γ的誘導(dǎo)從血管清洗健康人體血小板分離術(shù)的剩余白細(xì)胞，并用Histopaque離心。從界面抽取PBMCs，在不含熱原的鹽水(Baxter Health Care，Mundelein，IL)中洗三次，按每毫升5×106細(xì)胞重懸于加入10％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基(GIBCO/BRLGrand Island，NY)中。在1納克/毫升IL-12存在下，改變重組人IL-18和野生型IL-18(ICF/Xa)或三種突變體的濃度，使這些細(xì)胞僅與RPMI 1640培養(yǎng)基(對(duì)照)在平底96孔板(Becton Dickinson)內(nèi)培養(yǎng)。在一些實(shí)驗(yàn)中，將IL-18制劑加入到這些細(xì)胞之前先與多黏菌素B(1微克/毫升，購(gòu)自Sigma)混合。細(xì)胞在37℃、含有5％二氧化碳的潮濕空氣條件下培養(yǎng)16-20小時(shí)，然后收集培養(yǎng)基上清液以測(cè)定IFN-γ。
實(shí)施例8NKO細(xì)系中IFN-γ的誘導(dǎo)從Hans Klingerman(Gong等人，1994)取得原親代NK92細(xì)胞系。本研究采用的人NKO細(xì)胞系是該細(xì)胞系的亞克隆。將NKO細(xì)胞保持在含10％FBS、50皮克/毫升IL-12(R&D Systems)和200皮克/毫升IL-15(PeproTech)的補(bǔ)加RPMI 1640培養(yǎng)基中。為了進(jìn)行分析，將NKO細(xì)胞按每毫升0.5×106細(xì)胞懸于RPMI 1640培養(yǎng)基中，取0.2毫升在96孔板內(nèi)用0.5納克/毫升IL-12(PreproTech Rocky Hill，NJ)和不同濃度的重組人IL-18野生型、IL-18(ICE/Xa)或E42A、K89A和E42A/K89A突變體刺激。在37℃、含有5％二氧化碳的潮濕空氣條件下培養(yǎng)16-20小時(shí)后，收集培養(yǎng)基上清液以測(cè)定IFN-γ。
實(shí)施例9細(xì)胞因子的分析采用液相電化學(xué)發(fā)光法(ELC)來(lái)測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)基的IFN-γ(13)和IL-8(12)。借助Origen分析儀(Igen，Gaithersburg，MD)測(cè)定電化學(xué)發(fā)光量。IFN-γ和IL-8的檢測(cè)極限分別是62皮克/毫升和40皮克/毫升。
實(shí)施例10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。通過(guò)方差分析(ANOVA)比較組均值(group means)。在95％置信區(qū)間內(nèi)為可接受的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用統(tǒng)計(jì)軟件包STATVIEW 512+(BrainPower，Calabasas，CA)進(jìn)行ANOVA和相關(guān)性分析。
實(shí)施例11中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中成熟IL-18突變體的產(chǎn)生為了在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中表達(dá)和分泌成熟IL-18突變體，通過(guò)類(lèi)似實(shí)施例1所述反應(yīng)的兩次PCR反應(yīng)將編碼野生型和突變體IL-18BP的成熟蛋白的DNA序列與人生長(zhǎng)激素信號(hào)肽的DNA序列連接。第一次PCR反應(yīng)擴(kuò)增各種IL-18突變體，所用模板是實(shí)施例2的相應(yīng)構(gòu)造體，有義引物(Pr9)含有IL-18和人生長(zhǎng)激素信號(hào)肽的重疊序列，反向引物(Pr10)編碼IL-18的最后12個(gè)核苷酸、一個(gè)終止密碼子和一個(gè)限制酶位點(diǎn)。擴(kuò)增生長(zhǎng)激素信號(hào)肽的模板采用質(zhì)粒pXGH，有義引物(Pr11)含有一個(gè)限制酶位點(diǎn)和人生長(zhǎng)激素信號(hào)肽最先12個(gè)核苷酸，反向引物(Pr12)含有人生長(zhǎng)激素信號(hào)肽和IL-18成熟蛋白的重疊序列。進(jìn)行第二次PCR是為了擴(kuò)增編碼與IL-18成熟序列融合的人生長(zhǎng)激素信號(hào)肽的片段，所用模板為第一次PCR反應(yīng)的純化擴(kuò)增片段，引物為含有限制位點(diǎn)的Pr10和Pr11。提純?nèi)诤掀危煤线m的限制酶消化，并克隆到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。
用質(zhì)粒轉(zhuǎn)移中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(DHFR-)細(xì)胞，用含有小鼠DHFR基因的質(zhì)粒作為基因標(biāo)記。在選擇性培養(yǎng)基中分離抗性細(xì)胞，并用ELISA試驗(yàn)分析IL-18的產(chǎn)生。
逐漸增大MTX的濃度，使穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行多循環(huán)基因擴(kuò)增。在基因擴(kuò)增過(guò)程結(jié)束時(shí)用限制稀釋法(limiting dilution)分離克隆。經(jīng)過(guò)亞克隆后，選擇具有高特異性產(chǎn)率和生產(chǎn)更為穩(wěn)定的克隆來(lái)進(jìn)行生產(chǎn)。
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以上及說(shuō)明書(shū)全文所引用的文獻(xiàn)均納入其整體內(nèi)容作為參考。
序列表<110>阿雷斯貿(mào)易股份有限公司(Ares Trading S.A)C.迪納洛(Dinarello，Charles)S.H.金(Kim，Soo Hyun)<120>白細(xì)胞介素-18突變體、其制品及應(yīng)用<130>475<150>60/274,327<151>2001-03-08<160>18<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>582<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1atggctgctg aaccagtaga agacaattgc atcaactttg tggcaatgaa atttattgac 60aatacgcttt actttatagc tgaagatgat gaaaacctgg aatcagatta ctttggcaag 120cttgaatcta aattatcagt cataagaaat ttgaatgacc aagttctctt cattgaccaa 180ggaaatcggc ctctatttga agatatgact gattctgact gtagagataa tgcaccccgg 240accatattta ttataagtat gtataaagat agccagccta gaggtatggc tgtaactatc 300tctgtgaagt gtgagaaaat ttcaactctc tcctgtgaga acaaaattat ttcctttaag 360gaaatgaatc ctcctgataa catcaaggat acaaaaagtg acatcatatt ctttcagaga 420agtgtcccag gacatgataa taagatgcaa tttgaatctt catcatacga aggatacttt 480ctagcttgtg aaaaagagag agaccttttt aaactcattt tgaaaaaaga ggatgaattg 540ggggatagat ctataatgtt cactgttcaa aacgaagact ag 582<210>2
<211>157<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn1 5 10 15Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp20 25 30Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile35 40 45Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile50 55 60Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile65 70 75 80Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys85 90 95Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys100 105 110Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu115 120 125Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu130 135 140Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp145 150 155<210>3<211>193<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成PRT序列<400>3
Met Ala Ala Glu Pro Val Glu Asp Asn Cys Ile Asn Phe Val Ala Met1 5 10 15Lys Phe Ile Asp Asn Thr Leu Tyr Phe Ile Ala Glu Asp Asp Glu Asn20 25 30Ile Glu Gly Arg Tyr Phe Gly Lys Leu Ala Ser Lys Leu Ser Val Ile35 40 45Arg Asn Leu Asn Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro50 55 60Leu Phe Glu Asp Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg65 70 75 80Thr Ile Phe Ile Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met85 90 95Ala Val Thr Ile Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys100 105 110Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile115 120 125Lys Asp Thr Lys Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly130 135 140His Asp Asn Lys Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe145 150 155 160Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys165 170 175Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu180 185 190Asp<210>4<211>193<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成PRT序列<400>4Met Ala Ala Glu Pro Val Glu Asp Asn Cys Ile Asn Phe Val Ala Met1 5 10 15Lys Phe Ile Asp Asn Thr Leu Tyr Phe Ile Ala Glu Asp Asp Glu Asn20 25 30Ile Glu Gly Arg Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile35 40 45Arg Asn Leu Asn Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro50 55 60Leu Phe Glu Asp Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg65 70 75 80Thr Ile Phe Ile Ile Ser Met Tyr Ala Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met85 90 95Ala Val Thr Ile Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys100 105 110Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile115 120 125Lys Asp Thr Lys Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly130 135 140His Asp Asn Lys Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe145 150 155 160Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys165 170 175Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu180 185 190Asp<210>5<211>193<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>合成PRT序列<400>5Met Ala Ala Glu Pro Val Glu Asp Asn Cys Ile Asn Phe Val Ala Met1 5 10 15Lys Phe Ile Asp Asn Thr Leu Tyr Phe Ile Ala Glu Asp Asp Glu Asn20 25 30Ile Glu Gly Arg Tyr Phe Gly Lys Leu Ala Ser Lys Leu Ser Val Ile35 40 45Arg Asn Leu Asn Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro50 55 60Leu Phe Glu Asp Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg65 70 75 80Thr Ile Phe Ile Ile Ser Met Tyr Ala Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met85 90 95Ala Val Thr Ile Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys100 105 110Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile115 120 125Lys Asp Thr Lys Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly130 135 140His Asp Asn Lys Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe145 150 155 160Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys165 170 175Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu180 185 190Asp
<210>6<211>157<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成PRT序列<400>6Tyr Phe Gly Lys Leu Ala Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn1 5 10 15Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp20 25 30Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile35 40 45Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile50 55 60Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile65 70 75 80Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys85 90 95Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys100 105 110Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu115 120 125Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu130 135 140Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp145 150 155<210>7<211>157<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成PRT序列<400>7Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn1 5 10 15Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp20 25 30Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile35 40 45Ile Ser Met Tyr Ala Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile50 55 60Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile65 70 75 80Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys85 90 95Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys100 105 110Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu115 120 125Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu130 135 140Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp145 150 155<210>8<211>157<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成PRT序列<400>8Tyr Phe Gly Lys Leu Ala Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp20 25 30Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile35 40 45Ile Ser Met Tyr Ala Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile50 55 60Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile65 70 75 80Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys85 90 95Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys100 105 110Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu115 120 125Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu130 135 140Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp145 150 155<210>9<211>193<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成PRT序列<400>9Met Ala Ala Glu Pro Val Glu Asp Asn Cys Ile Asn Phe Val Ala Met1 5 10 15Lys Phe Ile Asp Asn Thr Leu Tyr Phe Ile Ala Glu Asp Asp Glu Asn20 25 30Ile Glu Gly Arg Tyr Phe Gly Lys Leu Lys Ser Lys Leu Ser Val Ile
35 40 45Arg Asn Leu Asn Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro50 55 60Leu Phe Glu Asp Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg65 70 75 80Thr Ile Phe Ile Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met85 90 95Ala Val Thr Ile Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys100 105 110Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile115 120 125Lys Asp Thr Lys Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly130 135 140His Asp Asn Lys Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe145 150 155 160Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys165 170 175Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu180 185 190Asp<210>10<211>157<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成PRT序列<400>10Tyr Phe Gly Lys Leu Lys Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn1 5 10 15Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile35 40 45Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile50 55 60Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile65 70 75 80Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys85 90 95Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys100 105 110Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu115 120 125Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu130 135 140Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp145 150 155<210>11<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA序列<400>11atatgaattc atggctgctg aaccagtag 29<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA序列
<400>12aaagtaacgt ccttcgatgt tttc24<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA序列<400>13gaaaacatcg aaggacgtta cttt 24<210>14<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA序列<400>14atatggatcc tagtcttcgt tttgaacagt g 31<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA序列<400>15taatttagat gcaagcttgc c 21<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA序列
<400>16ggcaagcttg catctaaatt a 21<210>17<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA序列<400>17ctggctatct gcatacatac t 21<210>18<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA序列<400>18agtatgtatg cagatagcca g 2權(quán)利要求
1.一種IL-18突變體多肽，其特征在于，所述多肽包括一個(gè)或多個(gè)與IL-18結(jié)合蛋白相互作用的氨基酸殘基上的突變。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述突變是取代、插入或缺失。
3.如權(quán)利要求2所述的多肽，其特征在于，所述取代是非保守性取代。
4.如權(quán)利要求1、2或3中任一項(xiàng)所述的多肽，其特征在于，所述突變?cè)谝贿x自由Glu-42、Ile-85、Met-87、Lys-89、Met-96、Asp-130、Lys-132、Pro-143、Met-149和Leu-189組成的組的殘基上。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，所述突變?cè)谝贿x自由Glu-42和Lys-89組成的組的殘基上。
6.如權(quán)利要求5所述的多肽，其特征在于，所述突變?cè)贕lu-42殘基上。
7.如權(quán)利要求5所述的多肽，其特征在于，所述突變?cè)贚ys-89殘基上。
8.如權(quán)利要求5所述的多肽，其特征在于，所述突變?cè)贕lu-42殘基和Lys-89殘基上。
9.如權(quán)利要求6所述的多肽，其特征在于，Glu-42殘基由非極性氨基酸所取代。
10.如權(quán)利要求9所述的多肽，其特征在于，Glu-42殘基由Ala殘基所取代。
11.如權(quán)利要求7所述的多肽，其特征在于，Lys-89殘基由非極性氨基酸所取代。
12.如權(quán)利要求11所述的多肽，其特征在于，Lys-89殘基由Ala殘基所取代。
13.如權(quán)利要求8所述的多肽，其特征在于，Glu-42殘基和Lys-89殘基兩者都由非極性氨基酸所取代。
14.如權(quán)利要求13所述的多肽，其特征在于，Glu-42殘基和Lys-89殘基兩者都由Ala殘基所取代。
15.一種編碼如權(quán)利要求1-14中任何一項(xiàng)所述多肽的分離DNA。
16.如權(quán)利要求15所述的DNA，其特征在于，所述多肽具有SEQ ID NO3的氨基酸序列。
17.如權(quán)利要求15所述的DNA，其特征在于，所述多肽具有編碼SEQ ID NO4的多肽的氨基酸序列。
18.如權(quán)利要求15所述的DNA，其特征在于，所述多肽具有編碼SEQ ID NO5的多肽的氨基酸序列。
19.如權(quán)利要求15所述的DNA，其特征在于，所述多肽具有編碼SEQ ID NO6的多肽的氨基酸序列。
20.如權(quán)利要求15所述的DNA，其特征在于，所述多肽具有編碼SEQ ID NO7的多肽的氨基酸序列。
21.如權(quán)利要求15所述的DNA，其特征在于，所述多肽具有編碼SEQ ID NO8的多肽的氨基酸序列。
22.一種如權(quán)利要求15、19、20和21中任何一項(xiàng)所述的DNA，其特征在于，所述DNA還包括編碼信號(hào)肽的核酸序列。
23.如權(quán)利要求22所述的DNA，其特征在于，所述信號(hào)肽是人生長(zhǎng)激素信號(hào)肽。
24.一種包括如權(quán)利要求15至23中任何一項(xiàng)所述的DNA的載體，其特征在于，所述載體能夠在適當(dāng)宿主細(xì)胞中表達(dá)由所述DNA編碼的多肽。
25.如權(quán)利要求24所述的載體，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是原核生物細(xì)胞。
26.如權(quán)利要求25所述的載體，其特征在于，所述DNA編碼一選自由SEQ ID NO3、SEQ ID NO4和SEQ ID NO5組成的組的多肽。
27.如權(quán)利要求24所述的載體，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是真核生物細(xì)胞。
28.如權(quán)利要求27所述的載體，其特征在于，所述DNA編碼一選自由SEQ ID NO6、SEQ ID NO7和SEQ ID NO8組成的組的多肽。
29.如權(quán)利要求27所述的載體，其特征在于，所述載體包括如權(quán)利要求22或23所述的DNA。
30.如權(quán)利要求28所述的載體，其特征在于，所述DNA與編碼人生長(zhǎng)激素信號(hào)肽的序列連接。
31.一種用于治療通過(guò)Th1反應(yīng)可被預(yù)防或減緩的疾病的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包括如權(quán)利要求1至14中任何一項(xiàng)所述的多肽和一藥學(xué)上可接受的載體。
32.如權(quán)利要求31所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物用于治療癌癥。
33.如權(quán)利要求31所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物用于治療病毒性疾病。
全文摘要
本發(fā)明提供了一些IL－18突變體，其對(duì)IL－18BP的親和力比野生型IL－18分子低。
文檔編號(hào)A61P31/12GK1764723SQ02809803
公開(kāi)日2006年4月26日 申請(qǐng)日期2002年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月8日
發(fā)明者C·迪納洛, S·H·金 申請(qǐng)人:阿雷斯貿(mào)易股份有限公司