專利名稱：治療肝癌的基因藥物及其制備方法
技術領域：
本發明涉及治療肝癌的藥物，特別是基因藥物，以及該藥物的制備方法。
目前，在基因治療中，首先必須解決組織特異性治療問題，即靶向轉染和靶向表達。靶向轉染是利用特異性載體將目的基因特異性地帶到靶細胞。現有的方法有脂體包埋，局部導入，病毒衣殼蛋白的包裝，利用受體分子制備的配體。這些方法中，首推制備配體分子，因為該靶向載體符合臨床治療模式。
本發明的目的是提供具有特異性靶向載體的治療肝癌的基因藥物，同時提供該藥物的制備方法。
該基因藥物是由去唾液酸類粘蛋白(ASOR)與多聚左旋賴氨酸(PL)的復合物和治療基因以4-6∶1(重量)組成，其中的治療基因是白介素2cDNA為0.91kb，γ-干擾素cDNA為1.1kb，將兩者亞克隆于真核細胞表達載體PCDNA3.1(+)的質粒中。
上述基因藥物的制備方法是(1)將ASOR，PL和EDC混合溶解后，在PH7.4-7.2，37℃下攪拌反應，然后透析除鹽，并分離出ASOR-PL復合物；(2)將上述得到的ASOR-PL復合物與治療基因按4-6∶1(重量)充分混合后，過濾除菌。
ASOR作為配體分子對肝細胞中的乳糖蛋白分子存在特異性。該去唾液酸類粘蛋白可由類粘蛋白OR，經酸解法脫去唾液酸后制成。
本申請人還確定了ASOR-PL與DNA的配比關系為4-6∶1。當靶向載體過剩時，可競爭性地抑制目的基因進入肝臟；另一方面，當DNA過剩時，剩余的DNA失去靶向作用。將ASOR-PL和目的DNA分別接0∶1，1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，6∶1，7∶1，8∶1，9∶1，10∶1(重量)11個不同的組合制備藥物。然后在0.8％瓊脂糖凝膠中進行阻滯電泳，電泳的條件為電壓80V，時間1小時。電泳后在溴乙錠溶液中染色30分鐘，紫外透射儀檢測結果。結果如下
比例小于4∶1的能檢測出未阻滯的目的DNA；比例為4∶1的僅有痕量的未阻滯目的DNA，比例為5∶1時，全部目的DNA被阻滯。由此說明ASOR-PL與目的DNA的最佳比例為5∶1。
實驗表明，本發明提供的基因藥物能使治療基因定向富集在肝細胞上。
實施例1.ASOR-PL復合物的制備首先將OR用酸解法制備ASOR，然后將ASOR，PL和EDC按1.0∶0.22∶0.45重量比混合溶解后，用NaOH調PH為7.2，在37℃下攪拌反應3小時后，在蒸餾水中透析48小時除鹽，再用G50層析柱，在PH7.2-4的緩沖液，10mmolPBS進行層析分離，收集第1峰物質，進行超濾濃縮即得到ASOR-PL復合物。用Bradford法測定溶液中ASOR-PL含量。
2.治療基因的重組將含有IFN-r的PHIIF-SV-gamma和含有IL-2的PcDHT-5質粒轉入JM-199大腸桿菌中擴增，回抽提質粒，用BamHI酶切上述質粒和真核細胞表達的載體質粒PcDNA3.1(+)，低溶點膠分離所切片段，以T4DNAligase在膠中連接后，轉入感受態JM-199菌中，經用BamHI酶切篩出陽性克隆擴增，純化陽性質粒，經用DNA序列分析，選出確為含有目的基因序列，并且插入方向正確的克隆再擴增回收質粒。目的基因片段IL-2CDNA為0.94kb，IFN-rcDNA為1.1kb。
3.ASOSR-PL復合物與治療基因的連接將ASOR-PL，DNA按5∶1(重量)混合，在37℃下維持1小時，經0.22μm濾膜過濾去菌即可。
藥代動力學研究(1)以該比例制備的藥物經靜脈注入SD大鼠體內后，用同位素P32-dATP標記質粒DNA片段，用Southern印跡的方法，發現其它組織中不存在靶向藥物，說明該藥物的靶向性好。
(2)經尾靜脈注入SD大鼠體內10-30分鐘時為血藥高峰期，1小時后在血中幾乎測不到。10分鐘后開始在肝臟出現，45分鐘時出現高峰，并持續6小時在高峰水平；24，48，72小時均可檢測到較高濃度的基因載體在肝細胞內，8天后僅有微量，10天后測不到載體質粒DNA。
其它組織，除腎臟在30，45，60分鐘可檢測到載體質粒DNA外，其它組織均在注藥1小時后未能測出載體質粒。
權利要求
1.治療肝癌的基因藥物，由去唾液酸類粘蛋白(ASOR)與多聚左旋賴氨酸(PL)的復合物和治療基因以4-6∶1(重量)組成，其中的治療基因是白介素2cDNA為0.91kb，γ-干擾素cDNA為1.1kb，將兩者亞克隆于真核細胞表達載體PCDNA3.1(+)的質粒中。
2.權利要求1所述的治療肝癌基因藥物的制備方法(1)將ASOR，PL和EDC混合溶解后，在PH7.4-7.2，37℃下攪拌反應，然后透析除鹽，并分離出ASOR-PL復合物；(2)將上述得到的ASOR-PL復合物與治療基因按4-6∶1(重量)充分混合后，過濾除菌。
全文摘要
本發明涉及治療肝癌的基因藥物及其制備方法。它是在已知的目的基因上通過多聚左旋賴氨酸(PL)與肝細胞導向分子ASOR連接。由于ASOR對肝細胞中乳糖蛋白分子存在特異性,實現靶向轉染和靶向表達。為制備上述藥物,首先將ASOR與PL在EDC、pH7.2條件下反應,制成ASOR－PL復合物,然后再與目標基因充分混合,利用兩者之間的靜電引力結合在一起。本發明提供的基因藥物對肝細胞具有特異性。
文檔編號A61K48/00GK1256952SQ98112778
公開日2000年6月21日 申請日期1998年12月11日 優先權日1998年12月11日
發明者盧放根 申請人:湖南醫科大學附屬第二醫院