專利名稱：用于控制沙門氏菌的利生菌的制作方法
相關申請的參考本專利申請為1992年7月29日提交的申請序號07/921,173的部分繼續，前申請內容在此引入作為參考。
背景技術：
發明領域本發明涉及使用限定性利生菌(probiotics)控制沙門氏菌(Salmonella)在家養動物、包括家禽特別是雞中的移生。
盡管經過研究人員和公共衛生機構的努力，在過去20年中人類沙門氏菌病的發病率仍然升高了。每年報道感染該病的實際病例數超過四萬。然而，據傳染病中心估計，在美國每年人類沙門氏菌感染的真實發病率可能高達二至四百萬。包括家禽在內的動物性食品仍是人類沙門氏菌感染的主要來源?，F有技術說明考慮到沙門氏菌在環境中的廣泛存在，不可能完全保護家禽不與沙門氏菌接觸。因此，研究人員繼續研究新的方法，用于增加接觸沙門氏菌的家禽對其移生的抗性。這些研究集中于對疫苗的評價、構建保護性的正常腸內菌群和鑒定可抑制沙門氏菌生長和移生的食品添加物。宿主的免疫力在抗沙門氏菌中的作用尚不清楚，而且同樣不能肯定是否刺激免疫反應可有效地增加對沙門氏菌移生的抗性。實驗性的疫苗并未被證實總是有效的。
許多文獻報道，正常腸內微生物群系可增加對沙門氏菌移生的抗性。給雛雞口服接種微生物菌群的厭氧菌培養物被證明可有效地降低沙門氏菌的移生，而以上厭氧微生物來自成雞盲腸內容物和糞便，并被稱為利生菌(probiotic，定義為服用后有利于動物的細菌培養物)[Snoeyenboset al.，Avian Dis.，23904-913，(1979)，Schneitz et al.，ActaPathol.Microbiol.Scand.Sect.B.，89；109-116，(1981)，andStavric et al.，J.Food Prot.，48778-782，(1985)]。與此相反，阻止上述盲腸厭氧菌在雛雞體內被移生的家禽飼養實踐，會使雛雞對沙門氏菌的移生更加敏感[Pivnick et al.，J.Food Prot.，44909-916，(1981)]。上述利生菌可能通過在雛雞腸道內的迅速移生而減少沙門氏菌的移生(Pivnick et al.，ibid)，通過競爭腸壁的附著位點(Snoeyenbos et al.，ibid)，或通過產生具有抑菌或殺菌作用的短鏈揮發性的脂肪酸[Barnes et al.，J.Hyg.Camb.，82263-283，(1979)and Am.J.Clin.Nutr.，332426-2433，(1980)，Corrier et al.，Avian Dis.，34668-676，(1990) and Avian Dis.，34617-625，(1990)，and Hinton et al.，Avian Dis.，34626-633，(1990)]，以抑制腸病原體的生長。
然而，包含幾百種不同微生物混合種群的正常微生物菌群培養物被證實可有效地抑制沙門氏菌的生長。在歐洲的一些國家，已廣泛使用微生物混合培養物構建日齡雛雞體內正常腸內菌群，用以控制沙門氏菌的繁殖。然而，由于上述培養混合物中存在的微生物數目和種類還未確定，這一系統在美國尚未得到廣泛的認可。導致這一方法廣泛使用受阻的一個原因是培養產物的組成不能標準化，因此培養產物不能在貯存和在大規模生產時在組成和效力上不變。同樣，由于開始的材料通常是成禽的腸容物，這些物質可能含有病原性病毒、細菌或寄生蟲，它們可能危害雛雞的健康。還有，美國食物和藥品局最近要求所有非限定性培養物必須通過審批。
最近已有報道，在雛雞的飼料或飲水中加入乳糖和其它乳糖制品可以增強對沙門氏菌移生的抗性[Oyofo et al.，Avian Dis.，33531-534，(1989)and Poultry Sci.，681357-1360，(1989)，Corrier et al.，ibid，and Hinton et al.，ibid.]。飲食中的乳糖可增加盲腸內容物的酸性和影響腸內正常菌群的生長和發酵產物。補充乳糖的飲食，通過增加某些正常腸內細菌產生的如乙酸、丙酸、丁酸等短鏈易揮發性脂肪酸的抑菌作用，而可能同樣增強對沙門氏菌移生的抗性[Corrier et al.，ibid，Hinton et al.，ibid]。
當給雛雞同時提供飲食中的乳糖和在含乳糖培養液中生長的盲腸厭氧菌培養物時，雛雞對沙門氏菌繁殖的抗性進一步增加[Corrier et al.and Hinton et al.，ibid]。
發明概述我們現已發現一種對控制或抑制沙門氏菌在家禽中的移生有效的限定性利生菌或細菌組合物，該利生菌包括生物學基本純的細菌的限定性種群或培養物。它們包括下列菌株糞腸球菌(Enterococcus faecalis)，faecium腸球菌(Enterococcus faecium)，avium腸球菌(Enterococcus avium)，lacfis乳酸球菌(Lactococcus lactis)，乳酸桿菌屬(Lactobacillus)，大腸桿菌(Escherichia coli)，弗氏檸檬酸菌(Citrobacter freundii)，假單胞菌屬(Pseudomonas)，液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)，丙酸桿菌屬(Propionibacterium)，雙歧桿菌屬(或乳酸桿菌屬)(Bifidobacterium(orLactobacillus)，真細菌屬(Eubacterium)，韋永球菌屬(Veillonella)，和梭形桿菌屬(Fusobacterium)以及屬于腸桿菌科的其它細菌和一類未知的稱為OAGPB-5的菌株。
在使用中，給受試家禽服用有效量的利生菌，用于抑制沙門氏菌的移生。在一種優選的實施方案中，通過在利生菌中摻入乳糖可能獲得增強的抑制沙門氏菌作用。上述利生菌也可能與常用的飼料結合，以提供一種可供家禽攝食的新的飼料產品。
本發明亦涉及以成年動物糞便、盲腸或大腸內容物中分離利生菌的一種新方法，以用于有效地控制或抑制沙門氏菌在包括家禽在內的家畜中的移生。將糞便、盲腸或大腸容物與營養物或培養基混合，并在無氧條件下不稀釋地溫育(即批培養)。經過這一初步的溫育，所得的培養物須在連續流動條件下直至獲得穩態，之后的穩態培養物可收獲作為利生菌使用。
按照這一發現，本發明的一個目的在于提供一種用于控制沙門氏菌在家禽中的移生的改進的方法和組成物。
本發明的進一步目的在于提供可能易于標準化的厭氧菌限定性培養物，用于控制沙門氏菌在家禽的移生。
本發明的另一個目的在于提供一種改進的方法，用于分離細菌組合物作為利生菌使用，以供控制沙門氏菌在家畜特別是家禽中的移生。
本發明的其它目的和優點在后面的說明中將是顯而易見的。
發明詳述服用本發明中的利生菌可有效地控制沙門氏菌在家禽中的移生，包括減少家禽群體中平均沙門氏菌濃度和(或)降低被沙門菌病原體移生的家禽百分率。本發明可能用于任何一種家禽，包括但不限于諸如雞、火雞、鴨、鵪鶉和鵝的家禽。給家禽服用后，利生菌可為家禽提供持久的保護用于抗多種沙門氏菌特別是鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌。
利生菌來自無沙門氏菌雞的盲腸。如在實施例1中詳細描述的，將雞的盲腸回收，接種到合適的培養基中，在分批培養中在無氧條件下溫育。接著該培養物以特定的培養基交換速率在連續流動的培養條件下溫育直至獲得穩態或平衡。當回收并給家禽服用后，此生成的穩態培養物作為利生菌在控制處理后禽類的沙門氏菌移生上顯示了顯著的有效性。
通過分析，從穩態培養物中回收到29種基本上純化的細菌分離物，包括15種兼性和14種專性厭氧菌。培養物中細菌的組成確定如下I.兼性厭氧菌，革蘭氏陰性球菌(1)第一糞腸球菌株，(2)第二糞腸球菌株，(3)第一faecium腸球菌株，(4)第二faecium腸球菌株，(5)第三faecium腸球菌株，(6)avium腸球菌株，(7)第三糞腸球菌株，II.兼性厭氧菌，革蘭氏陽性球桿菌(8)lactis乳酸球菌，(9)第一乳酸桿菌株，III.兼性厭氧菌，革蘭氏陰性桿菌(10)第一大腸桿菌株，(11)弗氏檸檬酸菌，(12)一種屬于腸桿菌科的細菌，(13)一種假單胞菌屬的菌種，(14)液化沙雷氏菌，
(15)第二大腸桿菌株，IV.專性厭氧菌，革蘭氏陽性桿菌(16)第一丙酸桿菌種，(17)第二丙酸桿菌種，(18)第二乳酸桿菌株，(19)第一雙歧桿菌株或第三乳酸桿菌株，(20)第三丙酸桿菌株，(21)第一真細菌株，(22)第二真細菌株，(23)一種未知的稱為OAGPB-5的細菌株，(24)第三真細菌株，(25)第二雙歧桿菌株或第四乳酸桿菌株，(26)第三雙歧桿菌株或第五乳酸桿菌株，(27)第四丙酸桿菌株，V.專性厭氧菌，革蘭氏陰性桿菌(28)一種韋永球菌屬菌種，VI.專性厭氧菌，革蘭氏陰性桿菌(29)一種梭形桿菌屬菌種。
包括上述所有29種細菌的利生菌組合物，已在布達佩斯條約下存入美國典型培養物保藏中心(ATCC，American Type CltureColleetion)(12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852，USA)，作為排除競爭培養物，CF3，指定的保存編號為ATCC 55515。單獨菌株的特性將在實施例1和例2中進行特征描述。
所得的穩態培養物可直接作為利生菌使用，或貯存待用。對于后者，可按需要以混合物貯存，或者可能分離出單獨菌株、貯存，然后再重新組合。
按照優選實施方案，利生菌由實施例1和例2中的穩態培養物產出的細菌組成。而在可選性的實施方案中，許多細菌可能從已知的或標準的菌株中獲得，或者從家禽回收的分離物中獲得。例如，但不僅限于，一種或更多的菌株，包括腸球菌、乳酸球菌、大腸桿菌、檸檬酸菌屬、假單胞菌屬、沙雷氏菌屬、丙酸桿菌屬、雙歧桿菌屬、真細菌屬、韋永球菌屬、梭形桿菌屬或特別是乳酸桿菌屬，可能替代實施例中貯存利生菌中相同屬或種的菌株。在使用已知菌株的貯存培養物時，為加強功效，這些細菌可通過家禽體內(培養)以適應家禽，更優選的是將其與來自穩態培養物的其它細菌一起使用，然后將其從家禽的糞便或盲腸內容物中回收和分離。當使用家禽分離物時，使用本領域中常規技術或按DeLoach所述[U.S.專利申請序號07/822,505]，可能從成年家禽的糞便或盲腸內容物中分別分離和回收細菌，其內容在此引入作為參考。
同樣可以預測，在利生菌少于上述所有的29種菌株的情況下，本發明仍可能實施，從利生菌中去除一、二或三種細菌可能只引起效力的輕微下降。例如，并不僅限于此，假單胞菌屬或多余的菌株，即那些屬于存在多菌株或菌種的屬的菌株，可以去除而不顯著降低效力。然而，按照優選實施方案，利生菌對沙門氏菌移生的最佳控制作用是在所有29種菌株均包括的情況下獲得的。
按照Nurmi等人的技術(美國專利4,689,226，其內容在此引入作為參照)，同樣可能任選本發明中的一些細菌株，用做有能力吸附至受試家禽消化道上皮細胞的細菌。
本發明同樣涉及一種新方法，用于獲得利生菌以有效地控制或抑制沙門氏菌在多種家畜中的移生，其中包括但不僅限于家禽以及馬、豬和牛。與其說使用已知的貯存培養物或純化的細菌分離物產生利生菌，不如說我們無意中發現一種可能直接從成年靶動物的糞便、盲腸和(或)大腸內容物中生產穩定的限定性利生菌的方法。按照這一方法，首先使用糞便、盲腸或大腸內容物作為成批培養的接種物，然后在特定的培養基交換和pH條件連續流動培養，直至達到穩態或平衡。所得的穩態培養物可回收作為利生菌使用。其中盲腸內容物被定義為包括盲腸內緣中的物質以及整個盲腸本身，包括其所屬的如粘膜層的各部分。
成批培養階段可在任何常規的發酵容器中進行。然而，優選使用無稀釋作用的恒化器(即不加入新鮮培養基和不取走失效的培養基)，以避免培養物轉入后面的進程以及減少對培養物潛在的污染。動物盲腸或大腸內容物及其糞便收集后可作為接種物。與合適的培養基混合并在無氧條件下溫育。這一成批培養物應連續溫育(1)約6～18小時，優選12～18小時左右，或(2)直到光密度(在600nm測量)至少達到約1.0左右，和(或)(3)pH達到4.2左右后約2小時以內；達到上述時間時，成批培養應終止，并開始連續培養。如果使用上述條件(1)或者特別是條件(2)確定溫育期，優選使用本領域常規的pH調節劑控制培養物的pH值在5.5左右。另外，如果不采取這一pH控制，以避免某些細菌的死亡，優選成批培養物保持pH值不低于4.2左右。
在結束上述成批培養階段后，接著馬上開始在恒化器中的持續培養，并持續補充新鮮的培養基和取走失效的肉湯培養基。合適的恒化器可能易于確定，例如包括Wang所述的反應器[Fermentation and EnzymeTechnology，John Wiley & Sons，New York，1979，pages 98-137，該內容在此引入作為參考]。令人驚奇的是，在特定的稀釋或培養基的周轉率和特定的pH值下，連續培養中的混合物生長，可以使培養物達到一個平衡或穩態。根據接種源所使用的動物、特定的培養基和培養條件，開始存在的細菌數目可能減少至一個含有相對少數生物學基本純化的細菌的穩定培養物，并可能易于確定。例如，當使用家禽時，開始約有500種細菌存在于接種物中，在穩定培養物中可能減少至約10到40種細菌。這一階段合適的條件包括周轉率在0.029到0.10小時-1左右，優選0.0416小時-1左右，pH值在4.7至6.5左右，優選5.5左右。
溫度和所用培養基對于大批和連續培養并非關鍵因素，并可能易于確定。合適的溫度可能在約26℃至47℃之間變化。含有不同能量來源的多種合適的培養基同樣可以使用。雖然對此沒有限制，但優選的能量來源包括葡萄糖、半乳糖，以及特別是乳糖。
當培養物pH、OD600和易揮發性脂肪酸濃度保持近似不變時，培養物可認為已呈現穩態。一但達到穩態，培養物可在任何時候回收，并按所述使用。理想的是，同樣也應該對穩態培養物加以鑒定或限定，通過使用本領域常規的方法，對其中的細菌種群進行分離和檢驗。一經分離，細菌使用常規的技術可能無限期地貯存，并按所述的方法用于以后的使用，例如，可按本發明以前相關的、序號為07/921,173的專利申請(1992年7月29日提交)中所述的方法進行。本領域熟練的技術人員將會意識到，使用分離的或生物學純化的細菌作為初始接種物同樣可能使用上述的成批/連續培養的方法。
按本方法產出的穩態培養物可以任意地加以篩選以選擇顯示最高效價的組合物，用于抑制沙門氏菌在適用動物上的移生。在一項優選的實施方案中，使用本領域常規技術，上述篩選可在體內用沙門氏菌攻擊而進行，其內容在實施例3和例4中加以敘述。簡單地講，可按在此所述的方法給未感染沙門氏菌的動物喂服穩態培養物。當經過一段時間，通常是喂服后2或3天，足夠培養物在消化道內確立之后，用活的沙門氏菌培養物攻擊動物，潛伏一段時間后，接著處死動物，動物的盲腸內容物用于分析沙門氏菌的移生。有效抑制沙門氏菌移生可用平均沙門氏菌濃度(CFU)的減少或動物被移生百分率的降低表示，并將處理的動物組與未處理的對照組比較。
我們同樣發現，按照本發明或經其它任何方法產生的利生菌，通過分析盲腸中易揮發性脂肪酸的成份譜，同樣可能實現在體內的準確篩選。這一技術并不需要通常的沙門氏菌攻擊。為了評估任一培養物的效價，可給適用的動物喂服培養物，并如前所述使培養物在消化道內確立。處理后約2-3天，優選3天，處死動物，測定盲腸內容物中丙酸和所有揮發性脂肪酸(乙酸加丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸)的濃度。測定上述酸可能使用的技術為本領域常規的方法，包括Corrier等人所述的氣-液色譜法(Avian Dis.，34617-625，1990)，其內容在此引入作為參考。當(1)盲腸內容物中丙酸濃度超過或等于10mmol/g時，和(或)(2)總的揮發性脂肪酸的濃度超過未處理對照組接近100％或更多時，顯示可作為利生菌以抑制沙門氏菌移生的效價。盡管允許在第二天以后測定丙酸的濃度，但如果以總揮發性脂肪酸濃度的測定為基準，則第3天以后的測定會使抑菌效價的預測值偏低。
就上述的含29種菌株的利生菌，按本法生產的穩態培養物可能直接作為利生菌使用或貯存待以后使用。類似地，培養物中所包括的細菌也可能被分離和鑒定；而且，已知或標準化的菌株，或從相同適用動物中分離的細菌，它們都可能替代上述穩態培養物中同屬或同種的細菌。
在合適的培養基中，使用本領域常規的無氧培養技術，通過對細菌成批或連續培養，可能生產大量的本發明的利生菌。其中，連續培養具有特別的優點，因為穩態培養物非常穩定并可能無限地保持穩態培養的狀態。大規模培養的接種物可能是穩態培養物的樣品或菌種、貯存的培養物或生物學基本純化的細菌分離物。細菌可能聯合培養，或者為了易于標準化而在不同的培養基上培養，再聯合培養。對于后一種技術，在聯合培養前每種細菌的終濃度應在108至109個細菌/毫升。然而，本領域熟練的技術人員會發現細菌的濃度并非關鍵而且可能改變。
通常，當在成批培養中進行大規模生產時，培養物在收獲前應溫育約16-72小時，優選24-48小時。然而，我們發現無論如何，成批培養應持續直至達到以下的發酵參數(1)乙酸濃度高于或等于約20mM，(2)丙酸濃度高于或等于10mM，(3)丁酸加異丁酸濃度高于或等于15mM。
本發明中利生菌的使用不受特定的生產方法的影響；上述任何一種方法產生的利生菌可以用同一方法使用。細菌培養物產生后，可以單獨或聯合直接給受試動物服用?？晒┻x擇的是，利生菌可能進一步地與合適的載體配制，包括但不僅限用乳糖、脫脂乳，或者與少量的食物結合作為預先混合物使用。培養物可能凍干以用于穩定貯存和易于管理。該凍干培養物可能直接給動物服用，或可選地，在使用前重建。應特別注意，可使用本領域常規技術將一種或所有細菌包入膠囊，包括、但不限于使用藻酸鹽凝膠使其膠囊化。不希望被理論所限定，相信使用這種方法包裹，可以防止一些細菌將上部腸道內乳酸的濃度降至不希望的水平。膠囊化同樣可保護細菌并使其到達盲腸，而該處乳酸的利用是合乎需要的。
本發明的利生菌可能與其它生物學基本純化的細菌聯用，這些純化的細菌，特別是那些產生乳酸或揮發性脂肪酸的細菌，作為利生菌已用于有效控制家畜或家禽中沙門氏菌。并不僅限于此，其它合適的細菌可包括胨鏈球菌屬或DeLoach所述的細菌[U.S.Patent application serialno.07 1822，505](其內容在此引入作為參考)。本領域常規或已知的、用于處理家畜或家禽的其它佐劑，特別是用于抑制腸道病原菌的佐劑，可加到利生菌中。合適的佐劑包括，例如，對抗革蘭氏陽性菌無效的抑球蟲劑。特別優選添加乳糖。
本領域常規的非治療水平的抗生素同樣可以給動物或家禽使用。這些抗生素可以與利生菌聯合或分別服用。亦或，這些抗生素可以治療水平給家禽的蛋使用，但在孵化后約3天內其水平降至非治療水平。
雖然本發明的利生菌主要通過與動物飼料或飲水聯用后被攝取而施用于導入消化道，可展望也可以通過本領域常規的方法經口腔或鼻腔噴霧制劑的形式直接給動物服用利生菌。還有其它可選的方法，包括直接灌注到胃腸道中或經泄殖腔施用。對于后者，利生菌可能直接噴在家禽的肛門上或給到禽欄底部的鋪草上，在家禽的正常活動過程中與肛門區接觸。一但接觸到肛門區，利生菌可通過逆向蠕動而導入泄殖腔。
可在動物一生的任何時期施用利生菌。然而，在優選的實施方案中，給約1至14天齡的新孵出家禽服用利生菌。
與不經處理的動物比較，服用有效量的利生菌可以基本抑制沙門氏菌在處理后動物中的移生。本領域熟練的技術人員可以容易地確定合適的使用量，并隨動物的年齡和大小稍有改變。
以下的實施例僅試圖進一步說明本發明，而非限制權利要求書中各權項的范圍。
實施例1利生菌的制備初始接種初始接種物可從3只10周齡用于焙烤的無沙門氏菌小雞中獲得，這些雞孵化后用不含藥物的飼料或飲水飼養。將雞處死后，無菌條件下取出盲腸并迅速移至無氧容器中(Coy Laboratory Proclucts，Ann Arbor，MI)。將每個盲腸剪成若干碎塊，并浸漬于實驗室用攪拌器中(Tekmar，Cincinnati，OH)。浸漬的盲腸組織和內容物混合在一起并被充分勻漿，之后加入甘油至終濃度為20％，最終的盲腸勻漿混合物于-70℃冷凍直至使用。解凍10ml的冷凍盲腸勻漿物，并在100ml Viande Levure(VL)肉湯培養基中于39℃無氧溫育，并作為種菌用于下面的連續流動(CF)培養。
連續流動裝置。成批和連續流動培養階段均在BioFlo III發酵器(NewBrunswick Scientific Co.，Edison，NJ)中的1150ml的恒化器中進行。當培養物在連續流動條件下生長時，可使用下列的參數--稀釋速率0.0416-1(相應的流動速率為0.80ml/分鐘和整個容器周轉時間為24小時)，--溫度為39℃，和--攪動速度為200rpm。用穩定的無O2的CO2氣流充滿容器以保持無氧條件。
連續流動條件下盲腸微生物的生長。恒化器內充滿1050ml無菌的Viande Levure(VL)肉湯培養基和接種100ml的種菌，在成批培養中于39℃、200rpm攪拌速率下無氧溫育。成批培養6小時后，開動營養物泵，培養物在連續流動條件下溫育。在連續流動培養后約5天可獲得穩態條件。當培養物pH、OD600和揮發性脂肪酸濃度保持近似不變時，認為達到穩態條件。
無菌收集經過5天和61天培養后的連續流動培養物樣品，并鋪種于補充5％牛血的胰化蛋白 瓊脂、McConkey瓊脂和疾病控制中心血瓊脂(CDCBA)。胰化蛋白 瓊脂和McConkey瓊脂平皿在空氣中于37℃溫育7天。CDCBA平皿在含80％氮氣、10％氫氣和10％二氧化碳氣體的無氧室中(Coy Laboratory Products，Ann Arbor，MI)于37℃溫育7天。由15種兼性和14種專性厭氧菌組成的29種細菌分離物，代表10個不同種屬的細菌，在連續流動培養的第5天以及第61天時進行鑒定。29種細菌分離物可使用本領域常規的生化、酶促過程和抗微生物敏感性檢測方法加以鑒定(Holdeman et al.，1977，Anaerobe Laboratory Manual，4th ed.，Virginia Polytechnic Institute and State University，Blacksburg，VA；Farmer et al.，1985，J.Clin.Microbiol.，2146-76；Lennette et al.，1985，Clinical Microbiology，4 th ed.，American Society for Microbiology，Washington，D.C.；and Devriseet al.，1987，Int.J.Syst.Bacteriol.，37257-259，每項內容在此引入作為參考)。其結果在實施例2中描述。
上述細菌鑒定為I.兼性厭氧菌，革蘭氏陽性球菌(1)糞腸球菌標為菌株M，(2)糞腸球菌標為菌株N，(3)faecium腸球菌 標為菌株Y，(4)faecium腸球菌 標為菌株Z，(5)facium腸球菌標為菌株X，(6)avium腸球菌(7)糞腸球菌標為菌株O，II.兼性厭氧菌，革蘭氏陽性球桿菌(8)laetis乳酸球菌亞種雙裂桿菌(diacetylactis)，(9)一種乳酸桿菌屬的菌種(菌株編號1)，
III.兼性厭氧菌，革蘭氏陰性桿菌(10)大腸桿菌，標為菌株CC-3A，(11)弗氏檸檬酸菌株，標為菌株CC-3，(12)一種屬于腸桿菌科的細菌(暫定為腸桿菌種、大腸肝菌或cryocrescens柯洛伊克爾菌)，(13)一種假單胞菌屬的菌種，(14)液化沙雷氏菌，(15)大腸桿菌，標為菌株CC-3B，IV.專性厭氧菌，革蘭氏陽性桿菌(16)一種丙酸桿菌屬的菌種(菌株編號1，暫定為詹氏丙酸桿菌或特氏丙酸桿菌)，(17)一種丙酸桿菌屬的菌種(菌株編號2，暫定為顆粒丙酸桿菌)，(18)一種乳酸桿菌屬的菌種(菌株編號2)，(19)一種雙歧桿菌屬的菌種(菌株編號1)，或一種乳酸桿菌屬的菌種(菌株編號3)，(20)一種丙酸桿菌屬的菌種(菌株編號3)，(21)一種真細菌屬的菌種(菌株編號1)，(22)一種真細菌屬的菌種(菌株編號2)，(23)一種未知的細菌標為菌株OAGPB-5，(24)一種真細菌屬的菌種(菌株編號3)，(25)一種雙歧桿菌屬的菌種(菌株編號2)或一種乳酸桿菌的菌種(菌株編號4)，(26)一種雙歧桿菌屬的菌種(菌株編號3)或一種乳酸桿菌的菌種(菌株編號4)，(27)一種丙酸桿菌屬的菌種(菌株編號4)，V.專性厭氧菌，革蘭氏陰性球菌(28)一種韋永球菌屬的菌種，和VI.專性厭氧菌，革蘭氏陰性桿菌(29)一種梭形桿菌屬的菌種。
連續流動培養物，具有由29種細菌分離物組成的特征，表現出在混合培養中共存生長、在酸性條件下具有生存性(pH5.0至6.5)，以及產生揮發性脂肪酸(VFA)作為發酵終產物。
利生菌的組合物，包括上述所有的29種細菌株，已在布達佩斯條約下，存入美國典型培養物保藏中心(12301，Parklawn Drive，羅克維爾，MD 20852，美國)，作為排除競爭培養物，CF3，指定的保存編號為ATCC55515。
實施例2細菌的特征描繪氣液色譜.從CDCBA所得的29種細菌中的每種菌株，被接種至蛋白胨酵母(PY)和PY+1％葡萄糖(PYG)肉湯培養基中，接著于37℃無氧溫育2天。使用標準步驟提取揮發性脂肪酸(VFAs)和非揮發性脂肪酸(NVFAs)，接著使用GowMac氣液色譜(GLC)檢測。GLC通過VFAs和NVFAs的商業標準品加以標定。其結果由表1A-C顯示。
細胞、菌群、培養的特征描繪。兼性厭氧菌1-15的革蘭氏反應和細胞的形態使用革蘭氏染色法加以測定，細菌在涂片前已在血瓊脂中于空氣中37℃溫育24小時。細菌的活動性使用含四唑鹽的軟瓊脂(0.4％)流動培養基測定。從血瓊脂中取菌接種于流動培養基中，并在空氣中37℃溫育24小時。每個測定進行兩次。
為確定培養特性，細菌1-9接種于2份血瓊脂、2份MacConkey瓊脂、2份疊氮化鈉血瓊脂和2份膽汁七葉苷瓊脂平皿。將1份血瓊脂、1份MacConkey瓊脂、1份疊氮化鈉血瓊脂和1份膽汁七葉苷瓊脂平皿在空氣中37℃溫育。1份血瓊脂和1份MacConkey瓊脂平皿在含80％氮氣、10％氫氣和10％二氧化碳的氣體中37℃溫育。1份疊氮鈉血瓊脂和1份膽汁七葉苷瓊脂平皿在空氣中于45℃溫育2天。在溫育后的第1和第2天記錄細菌的生長能力、菌群特性和血瓊脂上溶血類型、MacConkey瓊脂上乳糖反應和膽汁七葉苷瓊脂上七葉苷水解反應。每個測定進行兩次。
為確定革蘭氏陰性兼性厭氧菌的培養特征，可重復上述相同的過程，但省去疊氮化鈉血瓊脂和膽汁七葉苷瓊脂平皿。
對于專性厭氧菌16-29，使用革蘭氏染色測定細菌的革蘭氏反應和細胞形態，細菌涂片前已在富含血紅素和甲萘醌的腦和心臟血浸漬的瓊脂(CDCBA)上、在含80％氮氣、10％氫氣和10％二氧化碳空氣中于37℃溫育2天。為測定細菌活動性，從CDCBA上取菌至所用的、商業性預先造成無氧的無菌(PRAS)培養基中，并于37℃無氧溫育2天。
為確定細菌的培養特性，細菌16-29接種于2份CDCBA和2份MacConkey瓊脂平皿中。1份CDCBA和1份MacConkey瓊脂平皿在空氣中37℃溫育，1份CDCBA和MacConkey瓊脂平皿于37℃無氧溫育。溫育后1、3、5天記錄細菌的生長能力、菌群特性和CDCBA上的溶血類型。
以上結果在表2A-C中顯示。
過氧化氫酶、氧化酶和硝酸鹽還原測定。對于兼性厭氧菌1-9，在血瓊脂上于空氣中37℃溫育2天后，菌群可用于進行過氧化氫酶和氧化酶的測定。過氧化氫酶和氧化酶測定用的試劑分別為3％H2O2和1％四甲基對苯二胺二鹽酸鹽溶液。兩種酶反應記錄為陽性或陰性。每個測定進行兩次。同樣的程序用于測定革蘭氏陰性的兼性厭氧菌10-15，只是培養物只溫育24小時。
對于專性厭氧菌16-29，在CDCBA上于37℃無氧溫育2天后，菌群用于進行過氧化氫酶和氧化酶的測定。兩種酶測定的試劑與上相同。用于兩種酶測定的細菌在加入試劑前先在空氣中暴露30分鐘。所有反應記錄為陽性或陰性。每個測定進行兩次。
使用兩種方法檢測兼性厭氧菌1-15中的硝酸鹽還原酶。對于硝酸鹽瓊脂法，在含0.1％KNO3的瓊脂上接種來自血瓊脂已于空氣中37℃溫育24小時的細菌。于37℃溫育24小時后，使用試劑A和B(N，N′-二甲基萘胺和對氨基苯磺酸)測定。對于無氧的血瓊脂-紙片法，在血瓊脂上劃種細菌后，將一浸漬0.4％KNO3溶液的圓紙片放在劃種細菌密集的區域。平皿于37℃無氧溫育24小時后，將試劑A和B加在測定紙片上。為確定已被還原的硝酸鹽是否超過現存的硝酸鹽，將鋅粉加至經測定試劑處理過的紙片上。所有反應記錄為陰性或陽性。每個測定進行兩次。
對于專性厭氧菌16-29，使用以上的無氧血瓊脂-紙片法測定硝酸鹽還原酶，只是用CDCBA代替血瓊脂。
結果顯示于表3A-C。
有氧碳水化合物利用測定。對于兼性厭氧菌1-9，來自葡萄糖、半乳糖醇、乳糖、麥芽糖、甘露醇、水楊苷和蔗糖的酸性產物，使用1％的底物，在酚紅液體培養基中加以測定。用德拉姆管測定葡萄糖培養液中的產氣量。將已在空氣中37℃溫育24小時的、來自血瓊脂的受檢細菌接種于每個管中。培養液在空氣中于37℃溫育2天。觀察每管的顏色變化。管為紅色記錄為陰性，管呈黃色記錄為陽性。每個測定進行兩次。
用同樣的過程測定革蘭氏陰性兼性厭氧菌10-15，但只分析葡萄糖、乳糖和蔗糖。
將三糖鐵(TSI)瓊脂接種來自已在血瓊脂中37℃溫育24小時的、所有兼性厭氧菌1-15的培養物。在空氣中37℃溫育24小時后，TSI瓊脂反應記錄為陽性或陰性。每個測定進行兩次。
對于兼性厭氧菌1-9，從血瓊脂中接種至Voges-Proskauer液體培養基中，接著在空氣中于37℃溫育24小時。加入試劑A和B(40％KOH和α-萘酚)。反應記錄為陽性或陰性。每個測定進行兩次。
對于革蘭氏陰性兼性厭氧菌10-15，從血瓊脂平皿中接種至2份甲基紅-Voges Proskauer液體培養管(A和B)，接著在空氣中37℃溫育24小時。對于甲基紅測定，將1份甲基紅染料溶液加入A管。對于Voges-Proskauer測定，將試劑A和B(40％KOH和α-萘酚)加入管B。反應用陽性或陰性記錄。每個測定進行兩次。
結果顯示于表3A-C。
氨基酸利用和尿素酶測定。革蘭氏陰性兼性厭氧菌10-15測定賴氨酸脫羧酶和尿素酶，細菌1-15測定吲哚的生成。用賴氨酸鐵瓊脂(LIA)檢測賴氨酸脫羧酶。從血瓊脂平皿中取菌接種至LIA，并在空氣中37℃溫育24小時。反應用陽性或陰性記錄。每個測定進行兩次。
使用兩種方法檢測從色氨酸產生的吲哚。從血瓊脂中取菌接種至色氨酸液體培養基，并在空氣中37℃溫育24小時，接著與Ehrlich′s試劑反應。使用厭氧瓊脂-紙片法，在血瓊脂平皿上劃種細菌，接著將一張紙片放在瓊脂表面。該血瓊脂平皿于37℃無氧溫育24小時，接著用1％對二甲胺基肉桂醛(P-dimethylaminocinnamal dehyde)測定紙片。所有結果用陽性或陰性記錄。色氨酸液體培養基測定重復兩次，而厭氧瓊脂-紙片法一次。
從血瓊脂平皿中取菌接種至尿素瓊脂，接著在空氣中37℃溫育24小時。反應用陽性或陰性記錄。測定重復兩次。
這些結果也顯示于表3A-C。
商業性API 20E系統。革蘭氏陰性兼性厭氧菌10-15還用20種化學反應(表4)加以評估，按廠家說明使用一種商業反應系統(AnalytabProducts，Plainview，NY)。測定重復兩次。
結果顯示于表4。
碳水化合物發酵、明膠液化和氨基酸利用測定。將血瓊脂上兼性厭氧菌1-15的稠密懸液接種于商業性的預先造成無氧的無菌(PRAS)液體培養基中(表5)。該液體培養基在空氣中37℃溫育5天，在接種后第1、3、5天，用pH計測定每份培養物的pH值。培養物的pH≤6.5記為陽性，而培養物pH≥6.6為陰性。精氨酸培養基用增加的pH值評估，而明膠培養基則用液化作用評估。每個測定進行一次。
對于專性厭氧菌16-29可重復相同過程，僅接種物來自CDCBA上生長的細菌，以及所有溫育均在無氧條件下。
結果顯示于表5A-C和3A-C。
商業性的API Rapid STREP系統測定。使用商業性的鑒定腸球菌和鏈球菌系統評估兼性厭氧菌1-9的20種生化特性，測定按廠家說明(Analytab Products，Plainview，NY)。簡而言之，將已在血瓊脂中于空氣37℃溫育24小時的菌落懸浮至3ml的無菌蒸餾水中，以提供與McFarland 5號標準相同的細菌懸液。在每個器皿中接種細菌，然后在空氣中37℃溫育24小時。溫育24小時后，加入試劑以測定羥基丁酮的生成、馬尿酸鹽水解作用和吡咯烷酮基-2-萘酰胺(Pyrrolidonyl-2-naphthylamide)的酶催化反應、α-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酸酶、β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶和亮氨酸芳胺酶。在室溫下溫育10分鐘后以陽性或陰性記錄反應。七葉苷水解、精氨酸二水解酶，以及從核糖、阿拉伯糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、海藻糖、菊粉、蜜三糖、淀粉和糖原來的酸性產物均以陽性或陰性記錄。每個測定進行兩次。
結果顯示于表6。
商業性APESTAPH Trac系統測定。使用商業性的系統評估兼性厭氧菌1-9的19種生化性質(表7)，測定按廠家說明(Analytab Products，Plainview，NY)。簡而言之，將已在血瓊脂中于空氣37℃溫育24小時的菌落懸浮于3ml無菌蒸餾水中，以提供與McFarland 5號標準相同的細菌懸液。每個器皿中接種細菌，并在空氣中37℃溫育24小時。溫育24小時后，加入試劑以測定羥基丁酮生成、堿性磷酸酶、硝酸鹽還原酶和α-甲基-葡萄糖苷的酶促化反應，以及精氨酸二水解酶、葡萄糖、果糖、麥芽糖、甘露醇、甘露糖、蜜二糖、N-乙酰氨基葡萄糖、蜜三糖、蔗糖、海藻糖、尿素酶、木糖醇和木糖。反應用陽性或陰性記錄。每個測定進行兩次。
結果顯示于表7。
商業性APIZYM系統測定。使用商業性半定量酶系統評估所有兼性厭氧菌1-15對19種底物的酶活性，測定按廠家說明(Analytab Products，Plainview，NY)。簡而言之，將已在血瓊脂中于空氣37℃溫育24小時的菌落懸浮于3ml無菌蒸餾水中，以提供與McFarland 5號標準相同的細菌懸液。每個器皿中接種細菌懸液。在暗處于37℃溫育24小時后，每個器皿中加入試劑A和B，然后在室溫條件下反應進行5分鐘。反應的顏色深淺與廠家的示意圖比較，并定級如下0＝無顏色改變，痕跡量＝＜5納摩爾(nmol)，1＝5nmol，2＝10nmol，3＝20nmol，4＝30nmol和5≥40nmol。
對于專性厭氧菌16-29，或重復上述過程，只是接種物來自CDCBA上無氧生長的細菌。
結果顯示于表8A-C。
商業性的Presumpto平皿I、II和III。對于專性厭氧菌16-29，從CDCBA上接種細菌至Presumpto平皿I、II和III上，接著于37℃無氧溫育2天。測定進行和結果記錄均按廠家說明(表9)。每個測定進行兩次。
結果顯示表9A-D。
抗菌劑敏感性測定。用標準的圓盤-擴散法測定兼性厭氧菌1-15對表10顯示的所選抗微生物試劑的抗菌劑敏感性。結果用抗性的(R)或敏感性的(S)(包括中等敏感性的)記錄。每個測定進行一次。
對于專性厭氧菌16-29重復上述過程，只是使用CDCBA并且對培養物進行無氧溫育。
結果顯示于10A-C。
結果。測定結果由表1-10顯示。所有細菌按標準培養物和生化標準加以鑒定。
實施例3用焙烤用(Broiler)雛雞的體內實驗沙門氏菌.從家禽中分離的原代鼠傷寒沙門氏菌得自國立獸醫服務實驗室，Ames，IA 50010，在我們實驗室中被選擇新生霉素(NO)和萘啶酮酸(NA)耐受性，并在含25mg NO和20mg NA/ml的培養基中維持生長。攻擊用接種菌由隔夜培養物制備而來，此培養物已在胰化酪蛋白大豆液體培養基中轉移過三次，并經無菌磷酸緩沖液逐步稀釋至濃度為4×104cfu/1.0mL。攻擊接種物中活菌的濃度在亮綠瓊脂(BGA)平皿上經菌落計數證實。在實驗研究中。用于培養攻擊后對NO-NA耐受的雛雞分離物的培養基中含有25mg NO和20mg NA/mL，以抑制其它細菌和非耐受性沙門氏菌的生長。
實驗設計。得自商業孵卵場的當日孵出的雄性焙烤用雛雞，放置于以松木屑做墊料的有底層的雞籠中。給雛雞維持連續的光照，并供給自由攝取的飼水，以及不含藥物的谷物和大豆飼料，這些飼料含有或超過由國立研究會(1984)推薦的關鍵營養成份的水平。將運輸雛雞盒子的紙襯和隨機選取的3份25g飼料樣品在緩沖性蛋白胨水、亞硒酸鹽胱氨酸液體培養基和如前所述的BGA平皿中(Andrews et al.，1978，Isolationand Identification of Salmonella.InBacteriological AnalyticalManual，5th ed.，Assoc.Off.Anal.Chem.，Washington，D.C.，Chapter6，1-24)依次培養，并檢測沙門氏菌屬的細菌。在紙內襯或飼料中不可檢出spp.沙門氏菌。將雛雞隨機分成兩組，在其第一次飼水中提供1)沒有處理(對照)，或2)特定的細菌培養物(CC)。CC取自實施例1中連續流動培養外流物，含有大約108厭氧菌cfu/ml，并以1∶5的比例加入飲水中(1份CC；4份水)。給處理組的雛雞提供18小時處理過的飲水，而且每只雛雞估計可飲用10ml經CC處理的飲水。18個小時后，取走剩余的處理過的飲水并換成新鮮的自來水。第三天，CC處理后兩天及沙門氏菌攻擊前，每組隨機取10只雛雞并無痛苦拉頸處死。盲腸內容物中丙酸類揮發性脂肪酸(VFA)的濃度和總VFA(乙酸+丙酸+丁酸+異丁酸+戊酸+異戊酸)的濃度由以前報導的氣液色譜法測定(Corrier et al.，1990，Avian Dis.，34617-625)。按推薦的評估盲腸細菌新制備培養物效價的方法，所有剩余的雛雞均用嗉囔管飼法給104cfu的鼠傷寒沙門氏菌加以攻擊(Mead et al.，1989，J.Food Protect.，52500-502)。在10天大小，每組取20只雛雞，無痛苦處死，從每只雞中無菌取出盲腸內容物，并按下文所述的方法評估鼠傷寒沙門氏菌的移生。從上述的10日齡處死的雞中隨機取10份腸內容物，并用前述的方法測定VFA的濃度。以上試驗設計在4個不同的試驗中加以重復，即使用新孵出的雛雞和在連續流動培養中分別持續5天(試驗1)、26天(試驗2)、40天(試驗3)和61天(試驗4)的特定盲腸細菌。在試驗2、3、4過程中測定VFA′s在盲腸內容物中的濃度，而在實驗1中不測定。
與對照組比較，試驗2、3、4在第3天和第10天時，處理組雛雞的盲腸內容物中丙酸濃度顯著升高(p＜0.005)(表11)。另外，3日齡處理組雞的盲腸丙酸濃度增加與10日齡處理組雞盲腸內容物中沙門氏菌數目的log10值下降之間存在著顯著的相關性(p＜0.005)(r＝-0.99)。
在第3天，與對照組比較，處理組雞盲腸內容物中總VFA′s的濃度顯著增加(p＜0.01)(表12)。另外，3日齡處理組雞中總VFA濃度的增加與10日齡處理組雞盲腸內容物中沙門氏菌數目的log10值降低之間存在著顯著相關(p＜0.01)(r＝-0.67)。在第10天，對于試驗3和4，與對照組比較，處理組雞盲腸中總VFA′s的濃度顯著升高(p＜0.05)。
鼠傷寒沙門氏菌在盲腸中的繁殖。如上所述，無菌條件下取走每只雞一部分盲腸，用剪刀剪碎，并在30ml的亞硒酸鹽-胱氨酸液體培養基中于37℃溫育24小時。溫育后將培養液劃種于BGA平皿上，溫育24小時并檢測典型性鼠傷寒沙門氏菌的菌落。將1份來自剩余盲腸的內容物(0.2g)依次以1∶100、1∶1000和1∶10000稀釋并平鋪至BGA平皿上。平皿于37℃溫育24小時，鼠傷寒沙門氏菌的cfu的數目使用自動菌落計數儀(Biotran III，New Brunswick Scientific，Edison，NJ)確定。典型的沙門氏菌菌落還用三糖鐵瓊脂和賴氨酸鐵瓊脂(DefcoLaboratories，Detroit，MI)上的生化測定加以證實，以及使用沙門氏菌0抗血清，組13，因子1、4、12、15(Difco Laboratories，Detroit，MI)做鼠傷寒沙門氏菌的血清學鑒定。沙門氏菌的菌群平皿接種數用每克盲腸內容物中log10沙門氏菌數表示。若盲腸容物在1∶100稀釋下沙門氏菌培養為陰性，而在亞硒酸鹽-胱氨酸培養時呈陽性，則將其log10沙門氏菌/g盲腸容物的值規定為1.50。亞硒酸鹽-胱氨酸的培養物在BGA平皿上為陰性則log10沙門菌值規定為0。
為評估CC處理后對沙門氏菌攻擊抗性的效價按以前所述的方法計算“保護系數”(PF)(Pivnick and Nurmi，1982，The Nurmi Concept andits Rolein the Control of Salmonellae in Poultry，InDevelopmentsin Food Microbiology，Davies(ed.)，Applied Sciences Publishers，London，41-70；Mead etal.，1989，J.Food Protect.，52500-502)。PF＝(對照組log10沙門氏菌的均值/處理組log10沙門氏菌的均值)。
用χ方分析(chi-square)分析各組間鼠傷寒沙門氏菌培養陽性雛雞在數目上的差異。各組均值的差異用Student′s t檢驗確定。相關的顯著性和所有統計過程均按文獻所述進行(Snedecor and Cochran，1967，Statistical Mefhods，6th ed.，Iowa Atate University Press，Ames，IA)。
與對照組比較，處理組雞盲腸內容物中鼠傷寒沙門氏菌的數目顯著降低(p＜0.005)，在1、2、3、4每次實驗中分別降低了6.35、5.39、3.84和5.77個log10單位(表13)。計算保護系數用于估計特定培養物的效價，在試驗1、2、3、4中PF分別測定為63.5、7.14、15.2和10.6。
在四次實驗中，實驗所用的攻擊劑量104鼠傷寒沙門氏菌導致了對照組中90％至100％的10日齡雛雞的盲腸中有沙門氏菌的移生(表14)。與對照組比較，處理組盲腸培養沙門氏菌陽性的雛雞數目顯著降低(p＜0.01)，在1、2、3、4每次試驗中分別下降了100％、65％、75％和60％。
實施例4利生菌的制備使用本發明連續培養方法可制備第二種穩態培養物，其內容如patent application serial no.07/921,173，1992年7月29日提交，的專利所述，其內容在此引入作為參考。
該穩態培養物稱為CF II，由11種不同的細菌組成，包括四種兼性革蘭氏陽性厭氧球菌，兩種兼性革蘭氏陽性厭氧桿菌，三種兼性革蘭氏陰性厭氧桿菌，一種專性革蘭氏陽性氧桿菌和一種專性革蘭氏陽性厭氧球桿菌。細菌鑒定如下(1)糞腸球菌(標為菌株A)，(2)糞腸球菌(標為菌株B)，(3)avium腸球菌，(4)lactis腸球菌，(5)乳酸桿菌類 (標為CMS)，(6)animalis乳酸桿菌，(7)弗氏檸檬酸菌，
(8)大腸桿菌，(9)費羅因德埃希桿菌，(10)animalis雙歧桿菌，和(11)丙酸丙酸桿菌。
當給家禽服用時，這一穩態培養物證明基本上具有利生菌的效果，與未處理家禽相比，它可以顯著降低鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌在家禽中的移生。
應理解，上述詳細描述僅作為闡述，可對其進行改良和變化，而不偏離本發明的宗旨和范圍。
我們要求
表1A組I 組21234567 89揮發性脂肪酸PY/PGPY/PGPY/PGPY/PGPY/PGPY/PGPY/PG PY/PGPY/PG甲酸 S/S S/S -/- T/- -/- -/- -/T-/- -/-乙酸 S/S S/S T/T T/- -/T -/- S/T-/- T/T丙酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/- -/-異丁酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/- -/-丁酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/- -/-異戊酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/- -/-戊酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/- -/-異癸酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/- -/-癸酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/- -/-非揮發性脂肪酸丙酮酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/- -/-乳酸 T/L T/L T/L S/L T/L T/L L/LS/L T/L丁酮二酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/- -/-丙二酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/- -/-延胡索酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/- -/-丁二酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/- -/-苯甲酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/- -/-苯乳酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/- -/-VIAs和NVFAs的量表示如下-＝沒有產生；T＝痕跡量產生；S＝少量產生 L＝大量產生；V＝極大量的產生；
表1B組III 組IV10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20揮發性脂肪酸 PY/PGPY/PGPY/PGPY/PGPY/PGPY/PGPY/PGPY/PGPY/PGPY/PGPY/PG甲酸-/- -/- -/- -/- -/- -/- -/T -/- -/- -/- -/-乙酸S/L S/S S/L T/T T/- S/S T/S S/S T/T -/- S/S丙酸T/- T/- T/- -/- -/- -/- T/L L/L -/- -/- S/S異丁酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-丁酸-/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-異戊酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-戊酸-/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- /-異癸酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-癸酸-/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-非揮發性脂肪酸丙酮酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-乳酸-/L -/L -/L -/- -/S L/- T/S T/S S/S -/- -/-丁酮二酸-/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-丙二酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-延胡索酸-/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-丁二酸 -/- -/- -/- -/- -/T -/- -/- -/- -/- -/- S/S苯甲酸 L/L L/T L/T -/- -/- L/L T/T -/- -/- -/- -/-苯乳酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
表1C組4 組5組621 22 23 24 25 26 27 28 29揮發性脂肪酸 PY/PGPY/PGPY/PGPY/PGPY/PGPY/PGPY/PG PY/PG PY/PG甲酸-/- -/- -/- T/- -/- -/- -/--/--/-乙酸S/L L/S S/- S/- -/- -/S T/TT/TS/T丙酸-/- -/- -/- S/L -/- -/- S/-L/L-/-異丁酸 -/- -/- -/- -/T -/- -/- -/--/--/-丁酸V/L -/S -/- -/S -/- -/- -/--/-L/V異戊酸 -/- -/- -/- -/L -/- -/- -/--/--/-戊酸-/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/--/-異癸酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/--/-癸酸-/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/--/-非揮發性脂肪酸丙酮酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/--/-乳酸T/S T/- -/- -/- S/L T/L -/--/--/-丁酮二酸-/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/--/-丙二酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/--/-延胡索酸-/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/--/-丁二酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/--/-苯甲酸 S/- -/L L/- L/- -/- -/- L/L-/--/-苯乳酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/--/-
表2A細胞、培養和菌落特性條件12345678910革蘭氏反應 +++++++++-形態學 ccccccccb bb活動性 ----------細菌呼吸fa fa fa fa fa fa fa fa fa fa生長于血瓊脂++++++++++MacConkey瓊脂 ---------+疊氮鈉血瓊脂+++++++--NA膽汁七葉苷瓊脂(37℃) +++++++ NA膽汁七葉苷瓊脂(45℃) +++++++ NACDCBA瓊脂 NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA溶血--++++-++-乳糖反應在MacConkey瓊脂 NA NA NA NA NA NA NA NA NA +七葉苷水解 ++++++ NA形態學c＝球菌，b＝桿菌，cb＝球桿菌細菌呼吸oa＝專性厭氧菌，fa＝兼性厭氧菌CDCBA＝富含血紅素和甲萘醌的腦和心臟浸漬血瓊脂溶血測定對兼性厭氧菌在血瓊脂上，對專性厭氧菌在CDCBA上NA＝不能使用表2B細胞、培養和菌落特性條件11121314151617181920革蘭氏反應 - - - - - + + + + +形態學 b b b b b b b b b b活動性 + - + + - - - - - -細菌呼吸fafafafafaoaoaoaoaoa生長于血瓊脂+ + + + + NANANANANAMacConkey瓊脂 + + + + + - - - - -疊氮鈉血瓊脂NANANANANANANANANANA膽汁七葉苷瓊脂(37℃) NANANANANANANANANANA膽汁七葉苷瓊脂(45℃) NANANANANANANANANANACDCBA瓊脂 NANANANANA+ + + + +溶血- - - - - - - +乳糖反應在MacConkey瓊脂 + + - - +七葉苷水解 NANANANANANANANANANA
表2C細胞、培養和菌落特性條件 212223242526272829革蘭氏反應+ + + + + + + --形態學b cbb b b b cbcb活動性- - - - - - - --細菌呼吸 oaoaoaoaoaoaoaoaoa生長于血瓊脂 NANANANANANANANANAMacConkey瓊脂 - - - - - - - --疊氮鈉血瓊脂NANANANANANANANANA膽汁七葉苷瓊脂(37℃)NANANANANANANANANA膽汁七葉苷瓊脂(45℃)NANANANANANANANANACDCBA瓊脂 + + + + + + + ++溶血--乳糖反應 在MacConkey瓊脂七葉苷水解NANANANANANANANANA
表3A生化特性條件1 2 3 4 5 6 7 8 9 10過氧化氫酶 - - - - - - - - - +氧化酶 - - - - - - - - - -硝酸鹽還原硝酸鹽瓊脂- - - - - - - - - +無氧條件 - - - - - - - - + +葡萄糖肉湯培養基產酸 + + + + + + + + + +產氣 - - - - - - - - - +碳水化合物利用半乳糖醇 - - - - - - - - -乳糖 + + + + + + + + + +麥芽糖+ + + + + + + + +甘露醇+ + + + + + + + -水楊苷+ + + + + + + + +蔗糖 + + + + + + + + + +TSI瓊脂Butt/Slant a/aa/aa/aa/aa/aa/aa/aa/aa/aa/a產氣 - - - - - - - - - +硫化氫 - - - - - - - - -甲基紅 + + + + + + + - +Vogues-Proskauer- - - - - - - + - -吲哚生成- - - - - - - - - +枸椽酸鹽+ + - + - - - - - -丙二酸鹽- - - - - - - - -精氨酸二水解酶 + + + + - + + + +賴氨酸脫羧酶NA NA NA NA NA NA NA NA NA +明膠液化+ + - - - - - - -尿素酶 - - - - - - - - - -表3A(繼續)硝酸鹽還原硝酸鹽瓊脂+＝生長，-＝不生長厭氧用血瓊脂紙片法測定碳水化合物利用+＝產酸，-＝不產酸TSI瓊脂butt/slanta＝酸性，b＝堿性，賴氨酸脫羧酶測定于LIA瓊脂NA＝無法使用表3B生化特性條件 1112131415 1617181920過氧化氫酶 + + + + +- - - - -氧化酶 - - + - -- - - - -硝酸鹽還原硝酸鹽瓊脂 + + + + +NANANANANA無氧條件 + + + + +- - -葡萄糖肉湯培養基產酸 + - + +NANANANANA產氣 + - - +NANANANANA碳水化合物利用半乳糖醇 - - -NANANANANA乳糖 + + - - +NANANANANA麥芽糖 - + +NANANANANA甘露醇 - + NANANANANA水楊苷 -NANANANANA蔗糖 + + - + -NANANANANATSI瓊脂Butt/Slanta/a a/a b/b a/b a/a NANANANANA產氣 + + - +NANANANANA硫化氫 + - - -NANANANANA甲基紅 + + - + +NANANANANAVogues-Proskauer - - - - -NANANANANA吲哚生成 - + - - +NANANANANA枸椽酸鹽 + - + + +NANANANANA丙二酸鹽 + + NANANANANA精氨酸二水解酶- - + + -賴氨酸脫羧酶 - + + + +明膠液化 - - - - -尿素酶 - - - - -- - - - -
表3C生化特性條件212223242526272829過氧化氫酶 - - - - - - - - -氧化酶 - - - - - - - - -硝酸鹽還原硝酸鹽瓊脂NANANANANANANANANA無氧條件-葡萄糖肉湯培養基產酸 NANANANANANANANANA產氣 NANANANANANANANANA碳水化合物利用半乳糖醇 NANANANANANANANANA乳糖 NANANANANANANANANA麥芽糖NANANANANANANANANA甘露醇NANANANANANANANANA水楊苷NANANANANANANANANA蔗糖 NANANANANANANANANATSI瓊脂Butt/SlantNANANANANANANANANA產氣 NANANANANANANANANA硫化氫NANANANANANANANANA甲基紅 NANANANANANANANANAVogues-ProskauerNANANANANANANANANA吲哚生成NANANANANANANANANA枸椽酸鹽NANANANANANANANANA丙二酸鹽NANANANANANANANANA精氨酸二水解酶+ + - - + +賴氨酸脫羧酶明膠液化 - - - - - -尿素酶- - - - - +
表4APE 20E系統細菌(分離物)生化測定 101112131415ONPG +/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+精氨酸二水解酶-/- +/+ -/- +/+ +/+ -/-賴氨酸脫羧酶 +/+ -/- +/+ +/+ +/+ +/+鳥氨酸脫羧酶 +/+ -/- +/+ +/+ +/+ -/-枸椽酸鹽 -/- +/+ -/- +/+ +/+ -/-H2S -/- +/+ -/- -/- -/- -/-尿素酶-/- -/- -/- +/+ +/+ -/-色氨酸脫氨酶 -/- -/- -/- -/- -/- -/-吲哚 +/+ -/- +/+ -/- -/- +/+Voges-Proskauer -/- -/- -/- -/- +/+ -/-明膠 -/- -/- -/- +/+ +/+ -/-葡萄糖+/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+甘露醇+/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+肌醇 -/- -/- -/- -/- +/+ -/-山梨醇+/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+鼠李糖+/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+蔗糖 +/+ -/- +/+ -/- +/+ +/+蜜二糖+/+ -/- +/+ -/- +/+ +/+苦杏仁苷 -/- -/- +/+ -/- +/+ +/+阿拉伯糖 +/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+*重復實驗/實驗2的數據表5A碳水化合物發酵測定細菌(分離物)碳水化合物底物1234567891011核糖醇+----+---- -阿拉伯糖 +++++++--+ +半乳糖醇 ---------- -果糖 ++++++++++ +甘油 ++--+++-++ +乳酸 -----ND --+- -麥芽糖++--++++++ +甘露糖++--++++++ +蜜二糖+-+--++--- -蜜三糖---++-+-++ -核糖 +++++++++- +山梨醇+++-+++-++ +蔗糖 ++++++++++ -木糖 ++-+++++++ +苦杏仁苷 ++++++-+-- -纖維二糖 +++++--++- +赤蘚醇-----+---- -葡萄糖++++++++++ +肌醇 ++-------- -乳糖 ++++++++-+ +甘露醇++++++++++ +松三糖++++++---- -丙酮酸鹽 +-----+--- -鼠李糖+-++-++-++ +水揚苷++++++++-+ +淀粉 +---++-+-- -海藻糖++++++-+++ +
表5B碳水化合物發酵測定細菌(分離物)碳水化合物底物1213141516171819202122核糖醇- - - - - - - - -阿拉伯糖 + - - + + + + - -半乳糖醇 - - - - - - - - -果糖 + - + + + + - - +甘油 + - + + - + - - -乳酸 - - + + - - - - +麥芽糖+ - + + + + + - +甘露糖+ - + + + + - - +蜜二糖+ - + + + + - - -蜜三糖+ - - + + + + - +核糖 + - + + + + - - +山梨醇+ - + + + + - - -蔗糖 + - + + + + + - +木糖 + - - + + + - - +苦杏仁苷 - - - + + - - - -纖維二糖 - - - + + - + - +赤蘚醇- - - - - - - - -葡萄糖+ - + + + + + - +肌醇 - - + + - + - - -乳糖 + - - + + + - - +甘露醇+ - + + - + - - +松三糖- - - + - - - - +丙酮酸鹽 - - - + - - - - +鼠李糖+ - - - + - - - +水揚苷+ - + + + - + - -淀粉 - - - + + - - - +海藻糖+ - + + + + + - +
表5C碳水化合物發酵測定細菌(分離物)碳水化合物底物 23 24 25 26 27 28 29核糖醇------阿拉伯糖 -++---半乳糖醇 ------果糖 ++-+++甘油 --++--乳酸 -+----麥芽糖-+++-+甘露糖+--+--蜜二糖---+--蜜三糖-+++--核糖 ------山梨醇------蔗糖 -+++--木糖 +--+--苦杏仁苷 -+----纖維二糖 -+-+-+赤蘚醇------葡萄糖++++-+肌醇 ------乳糖 -+++-+甘露醇+-----松三糖------丙酮酸鹽 ------鼠李糖------水揚苷-++---淀粉 ---+--海藻糖-++--+
表6API快速鏈球菌系統測定細菌(分離物)酶/底物 1 2 3 4 5 6 7 8 9Voges-Proskauer +/++/++/++/++/++/++/++/++/+馬尿酸鹽水解 -/-+/++/++/++/++/++/+-/--/-七葉苷水解 +/++/++/++/++/++/++/+-/+-/-吡咯烷酮基-2-萘胺+/++/++/++/++/++/++/++/+-/-α-半乳糖苷酶-/--/--/--/--/--/--/--/--/-β-葡萄糖醛酸酶 -/--/--/--/-+/+-/-+/+-/--/-β-半乳糖苷酶-/-+/++/++/++/+-/-+/+-/--/-堿性磷酸酶 -/--/--/--/+-/--/-+/+-/--/-亮氨酸芳基胺酶 +/+-/-+/+-/-+/++/++/++/++/+精氨酸二水解酶 +/++/++/++/++/+-/-+/+-/+-/-核糖 +/++/++/++/++/++/++/++/+-/-阿拉伯糖 -/--/-+/++/++/++/++/+-/--/-甘露醇 +/++/++/++/++/++/++/++/+-/-山梨醇 +/++/+-/--/--/-+/++/+-/--/-乳糖 -/--/-+/++/++/++/++/++/+-/-海藻糖 +/++/++/++/++/++/++/++/+-/-胰島素 -/--/--/--/--/--/--/--/--/-蜜三糖 -/--/--/--/-+/+-/-+/+-/--/-淀粉 +/++/++/+-/-+/+-/-+/++/+-/-糖原 -/--/--/--/--/--/--/--/--/-*重復1/重復2的數據表7API STAPH Trac系統測定細菌(分離物)酶/底物 1 2 3 4 5 6 7 8 9葡萄糖 +/++/0+/++/++/++/++/++/++/+果糖+/++/++/++/++/++/++/++/++/+甘露糖 +/++/++/++/++/++/++/++/++/+麥芽糖 +/++/++/++/++/++/++/++/++/+乳糖+/+-/-+/++/++/++/++/++/++/+海藻糖 +/++/++/++/++/++/++/++/++/+甘露醇 +/++/++/++/++/++/++/++/++/+木糖醇 -/--/--/--/--/-+/+-/--/-+/+蜜二糖 -/--/-+/++/++/++/++/+-/-+/+硝酸鹽還原 -/--/--/--/--/--/--/-+/+-/-堿性磷酸酶 +/+-/-+/+-/--/--/--/-+/++/+3-羥基丁酮生成 +/++/++/++/++/++/++/++/++/+蜜三糖 -/--/--/--/-+/++/++/+-/-+/+木糖-/--/--/--/-+/++/++/++/++/+蔗糖+/++/++/++/++/++/++/++/++/+α-甲基-葡萄糖苷+/+-/--/--/-+/++/++/+-/-+/+N-乙酰-葡萄糖苷 +/++/++/++/++/++/++/++/++/+精氨酸二水解酶 +/++/++/++/++/+-/-+/++/+-/-尿素酶 -/--/--/--/--/--/--/--/--/-*重復1/重復2的數據表8AAPI ZYM半定量酶系統測定細菌(分離物)酶分析 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10對照 0/00/00/00/00/00/00/00/00/00/0堿性磷酸酶0/01/0T/TT/T0/02/20/0T/T0/05/4(C4)酯酶 0/01/11/11/12/22/21/10/0T/T0/0酯酶脂酶(C8) 1/32/22/22/22/20/02/22/12/2T/T脂酶(C14) 0/00/00/00/0T/00/00/00/02/20/0亮氨酸氨肽酶 5/3T/11/10/00/00/01/12/33/31/1纈氨酸氨肽酶 0/00/00/00/00/00/00/00/02/2T/T胱氨酸氨肽酶 T/T0/00/00/00/00/00/0T/T1/1T/T胰蛋白酶 0/00/00/00/00/00/00/00/00/0T/T糜蛋白酶 0/10/00/00/02/20/0T/1T/T0/00/0酸性磷酸酶3/31/2T/T0/01/11/11/12/32/23/3磷酸水解酶2/22/21/13/31/11/12/22/22/23/3α-半乳糖苷酶 0/00/00/00/00/00/00/00/04/40/0β-半乳糖苷酶 0/0T/T0/00/00/00/01/11/13/32/3β-葡萄糖醛酸酶 0/00/00/00/00/00/00/01/10/00/0α-葡萄糖苷酶 4/42/30/00/00/00/02/23/30/00/0β-葡萄糖苷酶 4/30/02/21/12/10/0T/T2/20/00/0N-乙酰-β-葡糖胺酶1/10/00/00/00/00/00/01/10/00/0α-甘露糖苷酶 0/00/00/00/00/00/00/00/00/00/0α-巖藻糖苷酶 0/00/00/00/00/00/00/00/00/00/0半定量酶活力按如下方式記錄 0＝＜5nmol，T(痕量)＝＜5nmol，1＝5nmol，2＝10nmol，3＝20nmol，4＝30nmol，和5≥40nmol.*重復1/重復2的數據表8BAPI ZYM半定量酶系統測定 Enzyme System Tests細菌(分離物)酶分析11 12 13 14 15 16 17 18 19 20對照 0/00/00/00/00/00/00/00/00/00/0堿性磷酸酶5/53/22/23/32/33/30/00/00/05/5(C4)酯酶 1/10/03/33/30/00/01/10/00/01/1酯酶脂酶(C8) 1/10/04/33/30/0T/11/10/0T/01/1脂酶(C14) 1/T1/T3/32/30/00/00/00/00/00/0亮氨酸氨肽酶 3/45/54/44/44/40/00/00/00/00/0纈氨酸氨肽酶 1/12/32/22/21/10/00/00/00/00/0胱氨酸氨肽酶 T/T0/01/11/10/00/00/00/00/00/0胰蛋白酶 T/T2/22/22/20/00/00/00/00/00/0糜蛋白酶 T/T0/00/00/00/01/10/00/00/00/0酸性磷酸酶5/53/42/24/44/42/30/02/2T/T2/2磷酸水解酶4/33/31/12/24/32/21/12/2T/T2/2α-半乳糖苷酶 2/10/00/02/20/05/54/40/00/02/2β-半乳糖苷酶 4/43/30/04/32/22/35/50/03/33/3β-葡萄糖醛酸酶 1/10/00/01/1T/00/00/00/00/00/0α-葡萄糖苷酶 1/1T/T0/02/20/01/13/42/23/30/0β-葡萄糖苷酶 0/00/00/00/00/05/50/00/03/30/0N-乙酶-β-葡糖胺酶0/00/00/02/2T/03/30/00/00/05/5α-甘露糖苷酶 0/00/00/00/00/00/00/00/00/00/0α-巖藻糖苷酶 0/00/00/00/00/00/00/00/00/00/0
表8CAPI ZYM半定量酶系統測定細菌(分離物)酶分析21 22 23 24 25 26 27 28 29對照 0/00/00/00/00/00/00/00/00/0堿性磷酸酶0/00/00/00/05/5T/T5/50/00/0(C4)酯酶 T/T0/01/10/00/00/00/00/0T/T酯酶脂酶(C8) T/T1/11/1T/T0/00/01/10/01/T脂酶(C14) 0/00/00/00/00/00/00/00/00/0亮氨酸氨肽酶 0/00/00/00/00/00/0T/T0/00/0纈氨酸氨肽酶 0/00/00/00/00/00/00/00/00/0胱氨酸氨肽酶 0/00/00/00/00/00/00/00/00/0胰蛋白酶 0/00/00/00/00/00/00/00/00/0糜蛋白酶 0/00/00/00/00/00/00/00/00/0酸性磷酸酶0/0T/00/00/02/21/14/22/21/1磷酸水解酶1/11/11/12/21/11/15/32/12/2α-半乳糖苷酶 2/2T/02/10/00/00/04/20/01/Tβ-半乳糖苷酶 0/0T/00/00/00/00/04/20/00/0β-葡萄糖醛酸酶 0/00/00/00/00/00/05/30/00/0α-葡萄糖苷酶 0/03/21/T0/00/02/23/20/00/0β-葡萄糖苷酶 0/01/T1/T0/02/30/00/00/00/TN-乙酰-β-葡糖胺酶0/00/00/00/00/00/03/20/00/0α-甘露糖苷酶 0/00/00/00/00/00/00/00/00/0α-巖藻糖苷酶 0/01/T0/00/00/00/01/00/00/0
表9APresumpto平皿系統測定Presumtpo象限號細菌(分離物)平皿編號 瓊脂基質 生長能力/生化測定16 17 1819I 1 LD培養基 生長 ++++++ +吲哚 - - -2 LD-七葉苷生長 +++ + +++過氧化氫酶- - -七葉苷水解 +++ - -3 LD-卵黃 生長 +++ + +++卵磷脂酶 - - -脂酶 - - -蛋白水解 - - -4 LD-膽汁 生長 I I III 1 LD-DNA 生長 +++++++++脫氧核糖核酸酶+ - -2 LD-葡萄糖生長 +++++++++葡萄糖發酵+ + -3 LD-牛奶 生長 +++++++++酪蛋白水解- - -4 LD-淀粉 生長 +++++++++淀粉水解 - - -III 1 LD-甘露醇生長 +++++++++甘露醇發酵- + -2 LD-乳糖 生長 +++++++++乳糖發酵 + + -3 LD-鼠李糖生長 +++++++++鼠李糖發酵+ - -4 LD-明膠 生長 +++++++++明膠水解 - - -在LD-膽汁瓊脂上相當的生長與LD瓊脂比較I＝很少生長；和E＝相同生長表9B Presumpto平皿系統測定Presumtpo象限號細菌(分離物)平皿編號 瓊脂基質 生長能力/生化測定20212223I 1 LD培養基 生長吲哚2 LD-七葉苷生長過氧化氫酶七葉苷水解3 LD-卵黃 生長卵磷脂酶脂酶蛋白水解4 LD-膽汁 生長II 1 LD-DNA 生長脫氧核糖核酸酶2 LD-葡萄糖生長葡萄糖發酵3 LD-牛奶 生長酪蛋白水解4 LD-淀粉 生長淀粉水解III 1 LD-甘露醇生長甘露醇發酵2 LD-乳糖 生長乳糖發酵3 LD-鼠李糖生長鼠李糖發酵4 LD-明膠 生長明膠水解表9CPresumpto平皿系統測定Presumtpo象限號細菌(分離物)平皿編號 瓊脂基質 生長能力/生化測定24252627I 1 LD培養基 生長吲哚2 LD-七葉苷生長過氧化氫酶七葉苷水解3 LD-卵黃 生長卵磷脂酶脂酶蛋白水解4 LD-膽汁 生長II 1 LD-DNA 生長脫氧核糖核酸酶2 LD-葡萄糖生長葡萄糖發酵3 LD-牛奶 生長酪蛋白水解4 LD-淀粉 生長淀粉水解III 1 LD-甘露醇生長甘露醇發酵2 LD-乳糖 生長乳糖發酵3 LD-鼠李糖生長鼠李糖發酵4 LD-明膠 生長明膠水解表9DPresumpto平皿系統測定Presumtpo象限號細菌(分離物)平皿編號 瓊脂基質 生長能力/生化測定2829I 1 LD培養基 生長 +++吲哚 -2 LD-七葉苷生長 +++過氧化氫酶-七葉苷水解-3 LD-卵黃 生長 +++卵磷脂酶 -脂酶 -蛋白水解 -4 LD-膽汁 生長 EII 1 LD-DNA 生長 +++脫氧核糖核酸酶-2 LD-葡萄糖生長 +++葡萄糖發酵-3 LD-牛奶 生長 +++酪蛋白水解-4 LD-淀粉 生長 +++淀粉水解 -III 1 LD-甘露醇生長 +++甘露醇發酵-2 LD-乳糖 生長 +++乳糖發酵 -3 LD-鼠李糖生長 +++鼠李糖發酵-4 LD-明膠 生長 +++明膠水解 +
表10A抗菌劑敏感性測定細菌(分離物)抗菌劑1 2 3 4 5 6 7 8 9 10丁胺卡那霉素 R S S S S S S S S S氨芐青霉素S S S S S S S S S奧格門丁 S S S R R S S桿菌肽R R R R R S R S S R羧芐青霉素S S S R S R S R S S頭孢菌素IIS R S R R S R S S S頭孢菌素I S S R R S S S S S S氯霉素S S S S S S S S S S氯四環素 R R S S S S R S S S氯林可霉素R R R R R R R S S R鄰氯青霉素R R R R R R R R R R紅霉素R R S S S S R S S S慶大霉素 S S S S S S S S S S卡那霉素 R R R R S R R S S S林可霉素 R R R R R R R R S R甲氧苯青霉素 R R R R R S R S R R萘啶酮酸 R R R R R R R R R S新霉素S S S S S S R S S S呋喃妥英 S S S S S S S S S新生霉素 R R R S S S R S青霉素R R R R S S S R S R多粘菌素B R R R R R R R R R S利福平S S S S S S S S S S鏈霉素R R R R S R R R S S磺胺嘧啶 R R R R R R R R S S三甲氧芐氨嘧啶R S R R R R S R S S四環素R S S S S S R S S S萬古霉素 S S S S S S S S R RS＝敏感的，R＝抗性的表10B抗菌劑敏感性測定細菌(分離物)抗菌劑11121314151617181920丁胺卡那霉素 S S S S S R S R R R氨芐青霉素R S R S S奧格門丁 S S R S S S S桿菌肽R R R R R R R R R R羧芐青霉素S S S S S S S S S S頭孢菌素IIR S R R R R S S S S頭孢菌素I R S R R S R S S S S氯霉素S S S S S S S S S S氯四環素 S S S S S S R R R氯林可霉素R R R R R S S S S S鄰氯青霉素R R R R R R R R R R紅霉素R S S R S S S R R R慶大霉素 S S S S S R S R R R卡那霉素 S S S S S R S R R R林可霉素 R R R R R R S R R R甲氧苯青霉素 R R R R R R R R R R萘啶酮酸 S S S S S R S R R R新霉素S S S S S R S R R R呋喃妥英 S S R S S新生霉素 R S S青霉素R R R R R R R S S S多粘菌素B S S S R S R S R R R利福平R S S S R S S S S S鏈霉素S S S S S R S R R R磺胺嘧啶 S S S S S S R R R R三甲氧芐氨嘧啶S S R S R R R R R R四環素S S S S S S R R R萬古霉素 R R R R R S S S S
表10C抗菌劑敏感性測定細菌(分離物)抗菌劑 212223242526272829丁胺卡那霉素R R R R R R R S S氨芐青霉素奧格門丁S S S S S S S S S桿菌肽 R R R R R R R R R羧芐青霉素 S S S S S S S S S頭孢菌素II S S S S S S S S S頭孢菌素I S S S S S S S S S氯霉素 S S S S S S S S S氯四環素R R R R R R R S S氯林可霉素 S S S S S S S S S鄰氯青霉素 R R R R R R R R R紅霉素 R R R R R R R S S慶大霉素R R R R R R R S S卡那霉素R R R R R R R S S林可霉素R R R R R R R S S甲氧苯青霉素R R R R R R R R R萘啶酮酸R R R R R R R S S新霉素 R R R R R R R S S呋喃妥英新生霉素青霉素 S S S S S S S R R多粘菌素B R R R R R R R S S利福平 S S S S S S S S S鏈霉素 R R R R R R R S S磺胺嘧啶R R R R R R R R R三甲氧芐氨嘧啶 R R R R R R R R R四環素 R R R R R R R S S萬古霉素S S S S S S S R R
表11 盲腸細菌特性培養物的處理對3日齡和10日齡焙烤用雛雞的盲腸內容物中丙酸濃度的影響1。
試驗2 試驗3 試驗4組 第3天第10天 第3天 第10天 第3天第10天對照組 .61±.58 1.82±.61 .68±.602.46±.93 .54±.582.67±0.88處理組21.28±15.75*27.64±10.15*16.85±8.14*27.01±9.48*20.73±10.78*47.75±12.4*1數值為10只雛雞的均值±SD和mmol/g盲腸內容物。*與對照組比顯著性差異(p＜0.005)
表12 盲腸細菌特性培養物的處理對3日齡和10日齡焙烤用雛雞的盲腸內容物中總揮發性脂肪酸濃度的影響1。
試驗2試驗3 試驗4組 第3天第3天 第3天 第10天 第10天 第10天對照組 9.03±2.30 73.01±6.43 14.03±6.75 52.87±16.98 16.66±2.71 71.95±16.25處理組14.75±5.80** 80.84±20.6945.60±8.05**69.14±23.04*50.67±22.59**107.03±28.63*1數值為10只雛雞的均值±SD和mmol/g盲腸內容物。*與對照組比顯著性差異(p＜0.005)表13 盲腸細菌特性培養物的處理對10日齡焙烤用雛雞的盲腸內容物中鼠傷寒沙門菌數目的影響1。
每克盲腸內容物中沙門氏菌log10值組試驗1 試驗2 試驗3 試驗4對照組6.35±0.9916.28±0.53 4.11±2.15 6.37±0.60處理組 0±0*0.89±1.50*0.27±0.69*0.60±0.75*1數據表示為20只雛雞的X±SD.*與對照組比顯著性差異(p＜0.005)表14 盲腸細菌特性培養物的處理對10日齡烤肉用雛雞盲腸培養呈鼠傷寒沙門氏菌陽性的數目的影響1。
沙門氏菌培養呈陽性雛雞/雛雞總數 (％)組試驗1 試驗2 試驗3 試驗4對照組20/20(100) 20/20(100) 18/20(90) 20/20(100)處理組 0/20(0)* 7/20(35)* 3/20(15)* 8/20(40)**與對照組比顯性差異(p＜0.01)1數值為10只雛雞的均值±SD和mmol/g盲腸內容物。*與對照組比顯著性差異(p＜0.005)1數值為10只雛雞的均值±SD和mmol/g盲腸內容物。*與對照組比顯著性差異*＝(p＜0.005)；**＝(p＜0.01)
權利要求
1.一種抑制禽類沙門氏菌移生的組合物，包括生物學基本純化的細菌種群，所述的細菌基本包括下列所有的細菌I.兼性厭氧菌，革蘭氏陽性球菌(1)第一糞腸球菌菌株，(2)第二糞腸球菌菌株，(3)第一faecium腸球菌菌株，(4)第二faecium腸球菌菌株，(5)第三faecium腸球菌菌株，(6)avium腸球菌，(7)第三糞腸球菌菌株，II.兼性厭氧菌，革蘭氏陽性球桿菌(8)lactis乳酸球菌，(9)第一乳酸桿菌菌株，III.兼性厭氧菌，革蘭氏陰性桿菌(10)第一大腸桿菌菌株，(11)弗氏檸檬酸菌，(12)一種屬于腸桿菌科的細菌，(13)一種假單胞菌屬的菌種，(14)液化沙雷氏菌，(15)第二大腸桿菌菌株，IV.專性厭氧菌，革蘭氏陽性桿菌(16)第一丙酸桿菌的菌種，(17)第二丙酸桿菌的菌種，(18)第二乳酸桿菌的菌株，(19)第一雙歧桿菌的菌株或第三乳酸桿菌的菌株，(20)第三丙酸桿菌的菌株，(21)第一真細菌的菌株，(22)第二真細菌的菌株，(23)一種標為OAGPB-5的未知細菌菌株，(24)第三真細菌的菌株，(25)第二雙歧桿菌的菌株或第四乳酸桿菌的菌株，(26)第三雙歧桿菌的菌株或第五乳酸桿菌的菌株，(27)第四丙酸桿菌的菌株，V.專性厭氧菌，革蘭氏陰性球菌(28)一種韋永球菌的菌種，和VI.專性厭氧菌，革蘭氏陰性桿菌(29)一種梭形桿菌屬菌種。
2.權利要求1所述的組合物，其中所述組合物包括ATCC保存號55515的細菌，和/或所述組合物包括26種所述的細菌，和/或所述組合物包括27種所述的細菌，和/或所述組合物包括28種所述的細菌，和/或所述組合物包括所有的所述細菌，和/或所述組合物進一步包括乳糖，和/或所述組合物進一步包括無抗革蘭氏陽性菌活性的抑球蟲劑，和/或所述組合物進一步包括載體，和/或所述組成的所述細菌制成膠囊。
3.一種飼料產品，它包含與權利要求1中所述組合物相結合的動物飼料。
4.一種抑制禽類沙門氏菌移生的方法，包括給禽類施用一種組合物，所述組合物包括生物學基本純化的細菌的種群，所述細菌包括基本上下列所有的I.兼性厭氧菌，革蘭氏陽性球菌(1)第一糞腸球菌的菌株，(2)第二糞腸球菌的菌株，(3)第一faecium腸球菌的菌株，(4)第二faecium腸球菌的菌株，(5)第三faecium腸球菌的菌株，(6)avium腸球菌，(7)第三糞腸球菌的菌株，II.兼性厭氧菌，革蘭氏陽性球桿菌(8)lactis乳酸球菌，(9)第一乳酸桿菌的菌株，III.兼性厭氧菌，革蘭氏陰性桿菌(10)第一大腸桿菌的菌株，(11)弗氏檸檬酸菌，(12)一種屬于腸桿菌科的細菌，(13)一種假單胞菌屬的菌種，(14)液化沙雷氏菌，(15)第二大腸桿菌的菌株，IV.專性厭氧菌，革蘭氏陽性桿菌(16)第一丙酸桿菌種的菌種，(17)第二丙酸桿菌的菌種，(18)第二乳酸桿菌的菌株，(19)第一雙歧桿菌的菌株或第三乳酸桿菌的菌株，(20)第三丙酸桿菌的菌株，(21)第一真細菌的菌株，(22)第二真細菌的菌株，(23)一種標為OAGPB-5的未知細菌菌株，(24)第三真細菌的菌株，(25)第二雙歧桿菌的菌株或第四乳酸桿菌的菌株，(26)第三雙歧桿菌的菌株或第五乳酸桿菌的菌株，(27)第四丙酸桿菌的菌株，V.專性厭氧菌，革蘭氏陰性球菌(28)一種韋永球菌的菌株，VI.專性厭氧菌，革蘭氏陰性桿菌(29)一種梭形桿菌的菌株。其中所述組合物以抑制沙門氏菌在所述禽類腸道中的移生有效的劑量施用。
5.權利要求4中所述的方法，其中所述組合物包括ATCC保存號55515的細菌，和/或所述組合物包括26種所述的細菌，和/或所述組合物包括27種所述的細菌，和/或所述組合物包括28種所述的細菌，和/或所述組合物包括所有的所述細菌。
6.權利要求4中所述的方法，其中所述的禽類為家禽。
7.權利要求6中所述的方法，其中所述的家禽選自包括雞、火雞、鴨、鵪鶉和鵝的一組動物，和/或其中所述的家禽小于約14日齡。
8.權利要求4中所述的方法，進一步包括給所述的禽類施用乳糖，和/或施用對抗革蘭氏陽性菌基本無活性的抑球蟲劑。
9.權利要求4中所述的方法，其中所述的細菌種群與載體一起施用，和/或其中所述的細菌被膠囊化。
10.權利要求4中所述的方法，其中施用的步驟包括口服該細菌種群至所述家禽中，優選與家禽的飼料和/或飲水結合，和/或將該細菌種群噴灑在所述家禽上，和/或將該細菌種群與家禽的泄殖腔接觸。
11.一種用于分離可有效用于抑制沙門氏菌在家養動物中移生的利生菌的方法，包括(a)將成年家養動物的糞便、盲腸內容物或大腸內容物接種至培養基中，并在無氧條件下以成批培養的形式溫育，以提供一種中間培養物，(b)將該中間培養物以連續培養形式溫育，并在周轉率約為0.029至0.10小時-1，pH約為4.7至6.5和無氧條件下連續溫育充足的時間以建立穩態，和(c)從步驟(b)中回收穩態培養物。
12.權利要求11中所述的方法，進一步包括(d)篩選從(c)中回收的穩態培養物對沙門氏菌在所述家養動物中移生的抑制作用。
13.權利要求11中所述的方法，其中所述的家畜為家養動物為家禽。
14.權利要求11中所述的方法，其中所述成批培養的溫育步驟持續6-18小時，和/或所述成批培養在pH5.5左右維持，和/或所述成批培養的溫育步驟持續直至光密度達到至少1.0左右，和/或所述成批培養的溫育步驟在pH達到約4.2后，只繼續不超過2小時左右，和/或在所述連續培養中周轉率為約0.0416小時-1并且所述pH約5.5，和/或所述成批培養的pH值不低于4.2，和/或所述成批培養和連續培養的溫度約在26℃至47℃之間。
15.權利要求11中所述的方法，其中所述培養基含有乳糖。
16.權利要求12中所述的方法，其中篩選步驟包括(1)提供受試的家養動物并給其施用取自(c)的穩態培養物；(2)提供未經處理的對照動物；(3)飼養受試和對照動物2-3天；(4)測定受試和對照動物盲腸內容物中丙酸和總揮發性脂肪酸的濃度；(5)比較受試動物和對照動物中丙酸濃度和總揮發性脂肪酸濃度；其中所述的穩態培養物被確定可有效用于抑制沙門氏菌在家養動物中的移生，條件是當(1)受試動物中丙酸的濃度超過或等于約10mmol/g盲腸內容物時，和/或(2)受試動物總揮發性脂肪酸濃度超過對照動物約100％或更多時。
17.權利要求16中所述的方法，其中總揮發性脂肪酸濃度包括乙酸加丙酸加丁酸加異丁酸加戊酸加異戊酸的濃度。
18.通過權利要求12方法產生的利生菌。
19.一種方法，它用于篩選可作為利生菌用于有效抑制沙門氏菌在家養動物中的移生的細菌組合物，包括(a)提供受試的家養動物和給其施用待試細菌組合物；(b)提供未經處理的對照動物，(c)飼養受試和對照動物2-3天，(d)測定受試和對照動物盲腸內容物中丙酸和總揮發性脂肪酸的濃度；并且(e)比較受試和對照動物中丙酸濃度和總揮發性脂肪酸濃度；其中所述的細菌組合物被確定可有效用于抑制沙門氏菌在家養動物中的移生，條件是當(1)受試動物中丙酸的濃度超過或等于約10mmol/g盲腸內容物時，和(或)(2)受試動物總揮發性脂肪酸濃度超過對照動物約100％或更多時。
20.權利要求19中所述的方法，其中總揮發性脂肪酸濃度包括乙酸加丙酸加丁酸加異丁酸加戊酸加異戊酸的濃度。
21.權利要求19中所述的方法，其中所述的動物為家禽。
22.一種細菌組合物，它可有效地抑制通過權利要求19方法產生的家養動物的沙門氏菌的移生。
全文摘要
一種限定性利生菌或厭氧菌組合物可有效用于控制或抑制家禽沙門氏菌的移生。該利生菌包括29種生物學上基本純的細菌的種群或培養物。在使用中，可給受試家禽施用有效量的利生菌以提高家禽對沙門氏菌移生的抗性。本發明還涉及一種從成年動物糞便、盲腸內容物或大腸中分離利生菌的新方法，以用于有效控制或抑制沙門氏菌在家畜中的移生，將糞便、盲腸內容物或大腸與培養基結合，并在無氧條件下進行不稀釋溫育(即成批培養)。緊接著這一初步溫育，所得培養物在連續流動條件下溫育直至達到一種穩態，在這以后的時間里，穩態培養物可以回收作為利生菌使用。
文檔編號A61P31/04GK1142773SQ94194949
公開日1997年2月12日 申請日期1994年12月13日 優先權日1993年12月13日
發明者D·J·尼斯貝特, D·E·科里埃, J·B·迪羅阿希 申請人:美國政府農業部