專利名稱：一種檢測腫瘤納米探針的制備方法
技術領域：
本發明涉及腫瘤檢測技術領域，更具體涉及一種檢測腫瘤納米探針的制備方法， 通過在鐵蛋白籠型結構表面展示熒光蛋白和RGD腫瘤靶向短肽，并在其內腔合成Fe3O4納米顆粒，制備出具有腫瘤靶向、磁性、熒光三種功能的納米顆粒探針。這種三功能納米探針能夠用于腫瘤細胞或活體的腫瘤靶向的磁共振成像(MRI)和熒光成像等檢測。
背景技術：
癌癥是人類死亡主要原因之一。盡管腫瘤生物學和腫瘤醫學有了很大的發展，比如腫瘤生物標記物的發現，簡便的手術流程，放療和化療的發展，但是總癌癥存活率在過去的二十年中都沒有顯著的提高。為了提高腫瘤患者的存活率，我們急需發展新的腫瘤早期診斷方法和治療方法。納米科學和技術的發展帶動了用于分子細胞成像和癌癥治療的納米材料的發展， 也帶動了用于癌癥檢測和篩查的納米器件的開發。納米顆粒不僅能提供癌癥病人的高靈敏和特異性成像信息，而且還能運輸抗癌藥物到腫瘤的位置。當前，我們在以下這三個方面的認識還是有限的一是適合用來成像的生物標記物；二是成像靶標和反差增強材料的選擇；三是用來使成像探針生物化的化學方法。我們在發展癌癥特異性成像試劑上同樣遇到很多困難，比如1)靶向組織或腫瘤的探針的運輸；2)生物相容性和生物毒性；3)探針的穩定性和體內信號增強的有效性；4)足夠多的成像方法和策略。當今，腫瘤靶向性的納米探針的發展也存在很大的挑戰。磁共振成像 (Magneticresonance imaging,MRI)是一種很好的成像方式，提供了細膩的軟組織對比度， 能夠揭示組織形態學和解剖學上的細節，甚至可以用于動物和人的全身成像。磁性造影劑常被用來增強反差和放大信號。雖然釓-二乙烯三胺五乙酸(Gd-DTPA)有很強的縮短Tl值的效應而且在臨床上被廣泛接受，但是它反差效應相對較低且體內存留時間過短。細胞內吞釓時和內吞釓后的毒性和生物相容性還是未知的。最近，磁性氧化鐵納米顆粒成為新一代的靶向特異性的MRI T2造影劑。磁性氧化鐵納米顆粒比Gd-DTPA在促進弛豫方面更有效。磁性氧化鐵納米顆粒的磁學性質可以通過控制核心的大小和表面修飾物來操控。更重要的是，磁性氧化鐵納米顆粒具有很長的血液存留時間，生物降解性和低生物毒性等特性。盡管我們在發展基于磁性氧化鐵納米顆粒的MRI造影劑方面做出了很多努力， 但是很多難題依然存在。主要的難題是發展一種表面修飾材料，該材料不僅可以穩定納米顆粒還可以提供用于探針分子可控生物交聯的活性功能基團。傳統的用于穩定磁性氧化鐵納米顆粒的分子(如葡聚糖)由于與納米顆粒間的相互作用力弱，所以很容易從納米顆粒的表面脫落下來而導致納米顆粒在生理條件下和儲存期間的團聚、沉淀。同時，雖然MRI是腫瘤學的一種主要成像方法，但是用于分子和細胞成像時它的分辨率很有限。而且，單獨的MRI造影劑如磁性氧化鐵納米顆粒難以靶向腫瘤細胞或組織。鐵蛋白是一個由24個結構相同的亞基自組裝形成的八面體對稱的球狀蛋白籠形結構。鐵蛋白的外部直徑是12nm，內部是一個6-8nm的空腔。鐵蛋白同SV40—樣也是一種典型的蛋白籠形結構。內源性人類鐵蛋白有兩種不同的亞基組成，H鏈和L鏈，H鏈和L 鏈的分子量大小不同，分別是21kDa和19kDa。H鏈含有一個保守的亞鐵氧化酶的酶活性位點，可以催化兩個Fe2+氧化；L鏈內部帶有大量的負電荷，參與鐵氧化物核心的形成。在哺乳動物鐵蛋白的H鏈內有一個能催化Fe2+氧化成Fe3+的亞鐵氧化酶。哺乳動物鐵蛋白的H 鏈單獨也能自組裝成24聚體球狀蛋白籠形結構。鐵蛋白的氨基端伸向外表面，非常易于基因操作，融合各種蛋白和短肽。所以，嘗試基于鐵蛋白籠型結構發展一種具有腫瘤靶向、磁性、熒光等三種功能的納米顆粒，用于腫瘤靶向的磁共振成像和熒光成像。

發明內容
本發明的目的是在于提供了一種檢測腫瘤納米探針的制備方法，在鐵蛋白H鏈的氨基端融合一個綠色熒光蛋白(GFP)，然后再融合一段RGD腫瘤靶向短肽。純化好的帶有腫瘤靶向肽和GFP的鐵蛋白，再在其內腔合成Fe3O4納米顆粒，從而發展具有腫瘤靶向、磁性、 熒光等三種功能的納米顆粒探針一種的三功能納米顆粒。這種三功能納米探針能夠用于腫瘤的活細胞或活體的腫瘤靶向的磁共振成像(MRI)和熒光成像等腫瘤的方便檢測。為了實現上述的目的，本發明采用以下技術措施一種檢測腫瘤納米探針的制備方法，其步驟是(1)、構建表達鐵蛋白重鏈的表達質粒(pET-rHF)，大腸桿菌(E. coli BL21)(購自 promega)表達、純化鐵蛋白，電子顯微鏡驗證表征其籠型結構。(2)、在鐵蛋白氨基端融合一個綠色熒光蛋白，表達純化制備表面展示了熒光蛋白的鐵蛋白籠型結構，進行結構和熒光性能表征。(3)、在氨基端融合有綠色熒光蛋白鐵蛋白H鏈的氨基端再融合一段腫瘤靶向短肽RGD(購自上海生工)，制備出表面同時展示了熒光蛋白和腫瘤靶向肽的鐵蛋白籠型結構。(4)、基于表面同時展示了熒光蛋白和腫瘤靶向肽的鐵蛋白籠型結構、在其內腔合成Fe3O4納米顆粒，制備成具有腫瘤靶向、熒光、磁性的鐵蛋白多功能探針。一種納米探針檢測腫瘤，其步驟是(1)、利用A549 (購自武漢大學中國典型培養物保藏中心)、U87MG(購自武漢大學中國典型培養物保藏中心)等腫瘤細胞驗證探針用于腫瘤的靶向識別功能。(2)、顯微成像檢測該三功能探針用于腫瘤的熒光成像功能。(3)、核磁共振成像驗證三功能探針用于腫瘤的磁共振成像功能。(4)、三功能探針檢測能夠特異性地鑒定腫瘤細胞，并實現腫瘤細胞的熒光成像及磁共振成像本發明與現有技術相比，具體以下優點和效果本研究利用基因操縱技術，在鐵蛋白H鏈的氨基端融合了腫瘤靶向肽和綠色熒光蛋白，并基于鐵蛋白原有的亞鐵氧化酶的功能，對鐵蛋白能進行體外生物礦化、在其內腔合成Fe3O4納米顆粒，從而制備出一種有機/無機雜合的三功能腫瘤檢測納米探針。鐵蛋白本身具有優良的生物相容性、作為Fe3O4納米顆粒的表面保護基團還可以穩定內腔的Fe3O4納米顆粒。該納米探針把腫瘤靶向、熒光成像、磁共振成像多功能融為一體，使用方便并能夠實現多模式的同步檢測，可望應用于特異的腫瘤細胞研究、腫瘤臨床診斷的多功能適時成像及腫瘤的載藥靶向治療等。


圖1為一種檢測腫瘤納米探針的制備方法示意圖。腫瘤靶向肽和綠色熒光蛋白展示于鐵蛋白籠型顆粒表面，在其內腔合成Fe3O4納米顆粒。圖2A_a為一種純化的鐵蛋白電泳表征2A_b 2B為一種純化的鐵蛋白與綠色熒光蛋白的融合蛋白的電泳表征2A-c為一種純化的鐵蛋白、綠色熒光蛋白及腫瘤靶向肽RGD的融合蛋白的電泳表征2B_a為一種鐵蛋白籠型顆粒結構的電鏡表征2B_b為一種表面展示了綠色熒光蛋白的鐵蛋白籠型顆粒電鏡表征2B-c為一種表面展示了綠色熒光蛋白和腫瘤靶向肽RGD的鐵蛋白籠型顆粒的電鏡表征3A為一種鐵蛋白籠型顆粒內腔合成Fe3O4納米顆粒的電鏡表征3B為一種表面展示了綠色熒光蛋白、內腔合成了 Fe3O4納米顆粒的鐵蛋白籠型顆粒電鏡表征3C為一種表面展示有熒光蛋白和腫瘤靶向肽的鐵蛋白籠型結構，既完整的三功能納米探針表電鏡表征圖。圖4A為一種三功能納米探針用于腫瘤細胞A549特異的熒光成像。圖4B為一種與圖4A中熒光成像的A549腫瘤細胞的明場圖像。圖4C為一種三功能納米探針用于腫瘤細胞U87MG特異的熒光成像。圖4D為與圖4A中熒光成像的U87MG腫瘤細胞的明場圖像。圖5A為不同濃度(0，2，6，20，60，200nM)的三功能探針T2磁共振成像結果5B為不同濃度(0，2，6，20，60，200nM)的三功能探針磁共振成像對應的T2弛豫時間圖5C_a為未處理的A549細胞的T2磁共振成像結果5C_b為無靶向功能鐵蛋白顆粒處理的A549細胞的T2磁共振成像結果5C-c為具有靶向、熒光、磁性的三功能鐵蛋白顆粒探針處理的A549細胞的T2 磁共振成像結果5C_d為未處理的U87MG細胞的T2磁共振成像結果5C_e為無靶向功能鐵蛋白顆粒處理的U87MG細胞的T2磁共振成像結果5C_f為具有靶向、熒光、磁性的三功能鐵蛋白顆粒探針處理的U87MG細胞的T2 磁共振成像結果圖。
具體實施例方式鐵蛋白是直徑為12納米的中空蛋白球，具有三個不同界面外表面和亞基界面和內腔，這三個界面通過人工設計可被賦予新的功能。在鐵蛋白的氨基端融合了 RGD腫瘤靶向短肽和綠色熒光蛋白，制備籠型鐵蛋白顆粒，使其表面展示腫瘤靶向短肽和綠色熒光蛋白，然后基于鐵蛋白原有的亞鐵氧化酶的功能，在其內腔合成Fe3O4納米顆粒，從而制造成一種腫瘤靶向的磁共振成像和熒光成像的多功能納米顆粒，可望應用于特異的腫瘤細胞研究、腫瘤臨床診斷的多功能適時成像和腫瘤的載藥靶向治療等。實施例1 一種檢測腫瘤納米探針的制備方法，其步驟是(1)通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增合成人鐵蛋白重鏈基因rHF，插入到表達載體pET-28a(購自promega公司)上，構建出表達鐵蛋白重鏈的表達質粒ρΕΤ-rHF，轉化入大腸桿菌E. coli BL21UDE3)(購自promega公司)，37°C恒溫、200r/min振蕩培養培養至 0D600在0. 4 0. 6之間，向培養物加IPTG至終濃度lmmol/L，培養物均在25°C繼續誘導培養8h后，4°C、6000g離心收集細胞，細胞沉淀以Tris-HCl緩沖液(20mM Tris-HCl, 50mM NaCl,pH 8. 0)清洗菌體一次，然后重懸于30mLTris-HCl緩沖液中，超聲破碎后，以12000r/ min離心30min，收集上清液置于60°C水浴中反應lOmin，然后12000r/min離心20min，收集上清液用Amicon Ultral5超濾管(IOOKDa MW cut-off)(購自millipore公司)濃縮。濃縮的蛋白樣品用分子篩柱Superdex 20010/300GL或Superose 610/300GL(購自GE公司) 純化，收集洗脫峰，獲得純化的籠型結構的鐵蛋。(2)質粒pET-rHF中插入綠色熒光蛋白基因(PCR擴增合成)，構建表達鐵蛋白與綠色熒光蛋白的融合蛋白的表達質粒pET-GFP-rHF，大腸桿菌E. coli BL21(ADE3)表達、 純化融合蛋白(具體試驗方法同上)，制備出表面展示了熒光蛋白的鐵蛋白籠型結構。(3)在質粒pET-GFP-rHF中插入RGD短肽表達基因(購自上海生工)，構建表達鐵蛋白-綠色熒光蛋白-腫瘤靶向肽RGD的融合蛋白的表達質粒pET28a-RGF，大腸桿菌 E. coli BL21(ADE3)表達、純化融合蛋白(具體試驗方法同上)，制備出表面同時展示了熒光蛋白和腫瘤靶向肽的鐵蛋白籠型結構。(4)基于表面同時展示了熒光蛋白和腫瘤靶向肽的鐵蛋白籠型結構，在其內腔合成Fe3O4納米顆粒，具體方法為30mL 0. 4 μ M rHF蛋白(或GFP-rHF蛋白或RGF蛋白)的 NaCl (0. 1M)溶液脫氣后加到滴定儀的反應杯中，通入高純氮氣，置于65°C恒溫水浴中。采用滴定儀恒滴定模式，整個反應過程反應液的PH值用50mM的NaOH滴定控制在8. 5。12. 5mM 的硫酸亞鐵銨((NH4)2Fe(SO4)2 · 6H20)和4. 17mM的H2O2新鮮配制溶液同時以0. 16mL/min 的速度加入到上述反應液中，30分鐘后停止滴加，使反應液中每個蛋白籠形結構的理論鐵原子載量達到5000。反應液在停止滴加后繼續反應5分鐘，然后加入0. 6mL 0. 3M的檸檬酸鈉溶液螯合掉多余的鐵離子，接著降溫到室溫，即成功獲得內腔合成Fe3O4納米顆粒的鐵蛋白探針，鐵蛋白籠型結構表面展示了熒光蛋白和腫瘤靶向肽，由于其表面已具有了熒光蛋白和腫瘤靶向肽，再加上內腔的Fe3O4納米顆粒，即為完整的具有腫瘤靶向、熒光、磁性的鐵蛋白多功能探針。實施例2 三功能腫瘤檢測探針用于腫瘤細胞的特異性熒光成像，其步驟是(1)選擇人惡性膠質母細胞瘤細胞株U87MG(購自武漢大學中國典型培養物保藏中心)和人非小細胞肺癌細胞株A549細胞購自武漢大學中國典型培養物保藏中心)，其細胞表面都具有腫瘤標志物α νβ 3整合素特異的上調表達。細胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養液，在37°C，5%的二氧化碳環境中傳代培養。傳代比例1 2。(2)U87MG和A549細胞鋪在中央粘好蓋玻片的培養皿中，在37°C，5%的二氧化碳環境中24-36小時，達到50%細胞匯合度后，PBS緩沖液洗3遍，換為結合緩沖液(20mM Tris-HCl，150mM NaCl,lmM Ca2+，ImM Mg2+, 1 % BSA,pH 7. 4)，把制備好的三功能鐵蛋白納米探針加入細胞至終濃度為50nM，37°C孵育1個小時，在熒光顯微鏡下檢測其熒光，并用沒有融合腫瘤靶向肽的鐵蛋白顆粒作為對照。(3)熒光檢測發現在U87MG和A549細胞的表面，具有很明顯的綠色熒光信號(圖 4)，而沒有攜帶腫瘤靶向肽的鐵蛋白顆粒不能在U87MG和A549細胞上產生熒光信號，說明上述制備的多功能探針可以用于腫瘤細胞的特異性靶向識別和熒光成像。實施例3 三功能腫瘤檢測探針作為造影劑用于腫瘤細胞的磁共振成像。其步驟是(1)選擇人惡性膠質母細胞瘤細胞株U87MG(購自武漢大學中國典型培養物保藏中心)和人非小細胞肺癌細胞株A549細胞購自武漢大學中國典型培養物保藏中心)，其細胞表面都具有腫瘤標志物α νβ 3整合素特異的上調表達。細胞用含有10%胎牛血清的 DMEM培養液，在37°C，5%的二氧化碳環境中傳代培養。傳代比例1 2。(2)106個現71^和々549細胞(購自武漢大學中國典型培養物保藏中心)PBS緩沖液洗 3 遍，換為結合緩沖液(20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, ImMCa2+, ImM Mg2+, 1% BSA, pH 7. 4)，把制備好的三功能鐵蛋白納米探針或是沒有融合腫瘤靶向肽、但融合有熒光蛋白并含有Fe3O4納米顆粒鐵蛋白顆粒加入細胞中使其探針終濃度為50nM，37°C孵育30分鐘。(3)三功能納米探針處理的細胞利用4. 7T成像儀進行T2成像，U87MG和A549細胞的T2弛豫時間分別為283. 8ms和314. Oms0而用沒有融合腫瘤靶向肽的鐵蛋白顆粒處理的U87MG和A549細胞的T2弛豫時間分別為457. 3ms和451. 3ms。沒有用任何造影劑處理的U87MG和A549細胞的T2弛豫時間分別為454. 4ms和447. 6ms。說明上述制備的三功能納米探針用于腫瘤細胞磁共振成像時可以引起T2弛豫時間的顯著降低。所以該三功能納米探針可以用于腫瘤細胞的特異性靶向識別和磁共振成像。
權利要求
1. 一種檢測腫瘤納米探針的制備方法，其步驟是A、通過聚合酶鏈式反應擴增合成人鐵蛋白重鏈基因r/F，插入到表達載體pET-28a上， 構建出表達鐵蛋白重鏈的表達質粒pET-rfF，轉化入大腸桿菌五coli BL21 (ADE3),37 °C恒溫、200 r/min振蕩培養培養至0D600在0.4 0. 6之間，向培養物加IPTG至終濃度 1 mmol/L，培養物均在25 °C繼續誘導培養8 h后，4 6000 g離心收集細胞，細胞沉淀以Tris-HCl緩沖液20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 8. 0，清洗菌體一次，然后重懸于30 mLTris-HCl緩沖液中，超聲破碎后，以12000 r/min離心30 min，收集上清液置于60 ！水浴中反應10 min，然后12000 r/min離心20 min，收集上清液用Amicon Ultral5超濾管濃縮，濃縮的蛋白樣品用分子篩柱Superdex 200 10/300 GL或Superose 6 10/300 GL純化，收集洗脫峰，獲得純化的籠型結構的鐵蛋；B、質粒pET-r/F中插入綠色熒光蛋白基因，構建表達鐵蛋白與綠色熒光蛋白的融合蛋白的表達質粒pET-ff^-rfF，大腸桿菌五coli BL21 ( λ DE3)表達、純化融合蛋白，制備出表面展示了熒光蛋白的鐵蛋白籠型結構；C、在質粒pET-ff^-rl中插入RGD短肽表達基因，構建表達鐵蛋白-綠色熒光蛋白-腫瘤靶向肽RGD的融合蛋白的表達質粒pET28a-/ 6F，大腸桿菌五coli BL21 (XDE3)表達、 純化融合蛋白，制備出表面同時展示了熒光蛋白和腫瘤靶向肽的鐵蛋白籠型結構；D、基于表面同時展示了熒光蛋白和腫瘤靶向肽的鐵蛋白籠型結構，在其內腔合成Fe3O4 納米顆粒，方法為30 mL 0.4 μ M rHF蛋白或GFP-rHF蛋白或RGF蛋白的NaCl溶液脫氣后加到滴定儀的反應杯中，通入高純氮氣，置于65 °C恒溫水浴中，采用滴定儀恒滴定模式， 整個反應過程反應液的PH值用50 mM的NaOH滴定控制在8. 5，12. 5 mM的硫酸亞鐵銨和 4.17 mM的H202新鮮配制溶液同時以0. 16 mL/min的速度加入到上述反應液中，30分鐘后停止滴加，使反應液中每個蛋白籠形結構的理論鐵原子載量達到5000，反應液在停止滴加后繼續反應5分鐘，然后加入0.6 mL 0. 3 M的檸檬酸鈉溶液螯合掉多余的鐵離子，接著降溫到室溫，成功獲得內腔合成Fe3O4納米顆粒的鐵蛋白探針，鐵蛋白籠型結構表面展示了熒光蛋白和腫瘤靶向肽，再加上內腔的Fe3O4納米顆粒，為完整的腫瘤靶向、熒光、磁性的鐵蛋白多功能探針。
全文摘要
本發明公開了一種檢測腫瘤納米探針的制備方法，其步驟(1)、構建表達鐵蛋白重鏈的表達質粒，大腸桿菌表達、純化鐵蛋白，電子顯微鏡驗證表征其籠型結構。(2)、在鐵蛋白氨基端融合一個綠色熒光蛋白，表達純化制備表面展示了熒光蛋白的鐵蛋白籠型結構。(3)、在氨基端融合有綠色熒光蛋白鐵蛋白H鏈的氨基端再融合一段腫瘤靶向短肽RGD，制備出表面同時展示了熒光蛋白和腫瘤靶向肽的鐵蛋白籠型結構。(4)、基于表面同時展示了熒光蛋白和腫瘤靶向肽的鐵蛋白籠型結構、在其內腔合成Fe3O4納米顆粒，制備成具有腫瘤靶向、熒光、磁性的鐵蛋白多功能探針。該納米探針把腫瘤靶向、熒光成像、磁共振成像多功能融為一體，能夠實現多模式的同步檢測。
文檔編號A61K49/14GK102234679SQ20111020353
公開日2011年11月9日 申請日期2011年7月20日 優先權日2011年7月20日
發明者危宏平, 崔宗強, 張先恩, 張治平, 李可 申請人:中國科學院武漢病毒研究所