專利名稱：環脂肽類抗生素及其制備和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的環脂肽類抗生素一環九肽菌素及其制備與應用，屬于生物醫學技術領域。
背景技術：
由于抗生素的廣泛應用或濫用，使得一度在細菌感染性疾病治療中起著顯著作用的抗生素出現了廣泛的失效。許多常見細菌對常用抗生素的耐藥性不斷增強。目前，細菌耐藥性已經嚴重威脅人類的健康。耐甲氧西林金黃葡萄球菌，耐青霉素肺炎鏈球菌以及產超廣譜內酰胺酶(ESBLs)的大腸埃希菌和克雷伯菌等多重耐藥菌已成為醫院中傳播率和致死率很高的病原體。耐萬古霉素腸球菌(VRE)的快速出現，加劇了人們對致病菌耐藥性問題的擔心。另外，隨著免疫抑制劑和廣譜抗生素的廣泛應用，導管、插管、燒傷搶救、放化療和 器官移植的推廣，真菌感染的發病率也逐年增加。據不完全統計，近10年來，全身性真菌感染的發病率增加了 3 5倍，而且預后差、死亡率高。根據化學結構，可將上市的抗真菌藥分為四大類丙烯類(特比萘芬)、多烯類(兩性霉素B等)、唑類(伊曲康唑等)、棘白霉素類(卡泊芬凈)等。特比萘芬療效低，不能單獨給藥；多烯類有嚴重的不良反應；唑類僅能抑制而不能殺滅真菌；棘白霉素類雖然對于念珠菌屬以及曲霉菌屬均有效，而且安全性較高，但卻面臨尚無口服劑型和價格昂貴等兩大問題，故而限制了它們在臨床上的應用。鑒于此，尋找結構新穎、不易產生交叉耐藥以及適合工業化生產的新型抗生素將是人類面臨的一項長期而艱巨的任務。

發明內容
本發明的目的是克服上述不足之處，提供一種針對臨床耐藥致病菌，具有潛在醫療應用價值的新的脂肽類抗生素——環九肽菌素的制備方法與應用。按照本發明提供的技術方案，一種環脂肽類抗生素，結構簡式如下
權利要求
1.一種環脂肽類抗生素，其特征是結構簡式如下
2.一株制備環脂肽類抗生素的菌株，其特征是所述菌株為類芽孢桿菌(Paenibacillus ehirnensis strain B7),保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日期2012年6月24日，地址中國武漢武漢大學，保藏號為CCTCC NO M 2012244。
3.環脂肽類抗生素的制備方法，其特征是步驟為 (1)培養發酵將類芽抱桿菌(Paenibacillusehirnensis strain B7)接種到發酵培養基，得到活化菌株，活化菌株在種子培養基中振蕩培養兩次，得到二級種子液，二級種子液接入發酵培養基中振蕩培養發酵，得到發酵液，離心、取發酵液上清，去沉淀，先經大孔吸附樹脂吸附，將發酵上清以合適速度流經用蒸餾水平衡好的、裝填有大孔吸附樹脂的層析柱； (2)分離純化待樣品上完后,先分別用蒸餾水和甲醇水溶液沖洗,然后用甲醇水溶液洗脫；收集各洗脫峰，測活，將活性組分濃縮蒸干得到粗品；將粗品用甲醇溶解，離心過濾，用固相萃取柱進一步純化；再用制備型高效液相色譜進行精純，收集活性組分，濃縮、凍干即可得到所述環九肽菌素。
4.如權利要求3所述環脂肽類抗生素的制備方法，其特征是具體步驟為 (1)將保存于-80V冰箱的甘油管中的類芽孢桿菌(Paenibacillus ehirnensisstrain B7)轉接到營養瓊脂培養基上，28 35°C培養24 96h，得到活化菌株； 營養瓊脂培養基，按如下組成配制牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂17g，蒸餾水IOOOmL, pH7. 2 ； (2)將活化菌株接入盛于250mL三角瓶的50mL種子培養基中，于28 35°C，220rpm振蕩培養24h，即為一級種子液； (3)將步驟(2)所得的一級種子液接入盛于500mL三角瓶的200mL種子培養基中，于·28 35°C，220rpm振蕩培養24h，即為二級種子液； 種子培養基為營養肉湯培養基，按如下組成配制牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，自來水 IOOOmL, ρΗ7· 2 ； (4)將步驟(3)所得的二級種子液按體積比5% 10%的接種量接入含500mL發酵培養基的2L三角瓶中，于28 35°C，200rpm振蕩培養96h，獲得發酵液； 發酵培養基按如下組成配制:葡萄糖，O 10g/L ；CaCl2,0. 01 O. 7g/L ；MgS04 · 7H20，·0. 05 lg/L ；ZnS04,0 . 00 5 0. lg/L ；NaCl,0. 05 0. 5g/L ;FeS04,0 . 00 5 0. 05g/L ；(NH4)2SO47O. 5 4. Og/L ；MnS04 · H20,0. 001 0. Olg/L ；KH2PO4, 0. 5 5g/L ;溶劑為蒸餾水，pH 7· 0 7· 5 ; (5)步驟(4)取得的發酵液轉到離心瓶中，平衡后于6500X g離心30min，去除沉淀，得澄清發酵上清液； (6)將步驟(5)所得的上清液以10 50mL/min的流速流穿用蒸餾水平衡好的Amberlite XAD-16層析柱，待樣品上完后分別用蒸餾水及含體積比為45%的甲醇的水溶液各沖洗5個床體積，然后用含體積比為90%的甲醇的水溶液洗脫，收集體積比為90%的甲醇水溶液洗脫的洗脫峰，55 65°C濃縮蒸干，得到粗品I ; (7)將粗品I用甲醇溶解，用O.45 μ m的濾膜過濾后上樣至用體積比25%的乙腈水溶液平衡好的C-18固相萃取柱，樣品加完后再用體積比為25%的乙腈水溶液沖洗5個床體積，然后用體積比65%的乙腈水溶液洗脫，收集洗脫峰，濃縮蒸干，得到粗品2 ； (8)將粗品2用甲醇溶解、12000rpm離心lOmin，并過O.45μΜ濾膜后，用制備型HPLC進行分離；分離后A液為含體積比O. 1%三氟乙酸的水溶液，B液為色譜純乙腈；洗脫梯度為在40min時間里B液從體積比15%提高到60% ;收集活性部分，55 65 °C濃縮、-50°C _60°C真空冷凍干燥，即得產品環脂肽類抗生素。
5.如權利要求4所述環脂肽類抗生素的制備方法，其特征是所述發酵培養基為葡萄糖，3. 5g/L ；CaCl2,0. 05g/L ；MgS04 · 7Η20，0· lg/L ；ZnS04,0. Olg/L ；NaCl,0. 3g/L ；FeS04,0. Olg/L ； (NH4)2SO4, 2. 5g/L ；MnSO4 · H20,0. 004g/L ；KH2PO4, 2. 5g/L ;溶劑為水，pH 7. 0 7. 2。
6.環脂肽類抗生素的應用，其特征是環脂肽類抗生素能夠用于制備抗細菌感染藥物。
7.如權利要求6所述環脂肽類抗生素的應用，其特征是環脂肽類抗生素用于制備抗多重耐藥細菌所致感染的藥物。
8.如權利要求7所述環脂肽類抗生素的應用，其特征是環脂肽類抗生素用于制備抗多重耐藥革蘭氏陰性菌所致感染的藥物。
全文摘要
本發明涉及一種新的環脂肽類抗生素—環九肽菌素及其制備與應用，屬于生物醫學技術領域。其將類芽孢桿菌接種到發酵培養基，于28~35℃下培養24~96h，離心、取發酵液上清，先經大孔吸附樹脂吸附，然后經進一步分離純化得到所述環脂肽類抗生素，可應用于制備抗細菌感染藥物。本發明提供了一種毒性優于多粘菌素B、具有較高醫療應用價值的環九肽菌素及其制備方法和應用，體外實驗表明該化合物對所有測試過的革蘭氏陽性和陰性致病菌，包括多重耐藥以及超級耐藥菌，均具有顯著的抑制作用；體內實驗表明該化合物對超廣譜耐藥銅綠假單胞引起的小鼠敗血癥具有明顯的防治效果。
文檔編號A61K38/08GK102911257SQ20121035678
公開日2013年2月6日 申請日期2012年9月21日 優先權日2012年9月21日
發明者黃朝暉 申請人:無錫市第四人民醫院