專(zhuān)利名稱(chēng)：用于免疫調(diào)節(jié)和佐劑治療的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于免疫調(diào)節(jié)和佐劑治療及預(yù)防免疫體系減弱的藥物制品。
目前用于治療各種免疫缺陷、自身免疫病及惡性病的免疫調(diào)節(jié)組合物可根據(jù)它們的組成和起源分為幾組。這些組合物的重要一組例如通胸腺激素形成，此胸腺激素可從動(dòng)物組織提取產(chǎn)生，并在指定的Thymus V—fraction(Hoffmann LaRoche)、Thymodulin和Leu-cotropina(Ellem)、Thymunox(Cilag)或TFX(Poffa)范圍內(nèi)分布。另一組特別是在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域頗受注意的免疫調(diào)節(jié)化合物是細(xì)胞因子，細(xì)胞因子是在細(xì)胞水平控制免疫應(yīng)答的主要化合物。基因工程技術(shù)使重組蛋白質(zhì)易于制備，它們是免疫調(diào)節(jié)組合物中活性成份，例如，Roferon(干擾素α2)、(Hoffmann LaRoche)、或血小板生成因子G—CSF(Hoffman LaRoche)分布在指定的Neupogen范圍內(nèi)。在感染的免疫療法會(huì)議上(Berlin，1993年5月4—7日)使用IL—2的經(jīng)典療法已經(jīng)討論了，特別討論了在部分患者失敗的觀點(diǎn)。白細(xì)胞的透析液也是很流行的免疫調(diào)節(jié)劑。在捷克共和國(guó)，它們被稱(chēng)為轉(zhuǎn)移因子(Sevac)。依賴于選擇的抗原的佐劑活性的化合物屬于最古老的和仍常用的試劑，此抗原源于細(xì)菌細(xì)胞膜的成份，例如，Stava(Sevac)、Olimostimulin(Medical Faculty of the Palacky Uniuersity，Olo-mouc，)。東方醫(yī)藥，特別是中國(guó)醫(yī)藥，以古老的傳統(tǒng)為基礎(chǔ)，注重于植物起源的免疫刺激化合物，及根據(jù)本歐洲研究(感激的免疫療法，Berlin，1993年5月4—7日)水平它們的活性機(jī)制。
來(lái)自希臘專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)72440(dr.T.H.Alivizatos)的已知組合物為包含D—核糖、DL—丙氨酸、尼克酸和維生素C的混合物，此混合物也被認(rèn)為是一種組合物，此組合物有重要的免疫調(diào)節(jié)活性，能重建代謝平衡，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力。
根據(jù)免疫調(diào)節(jié)療法的現(xiàn)代概念，進(jìn)行機(jī)體免疫力的靶向作用，而且必須限定功能區(qū)及任何藥物制品的功能特性。如此定義在仍最常用的免疫調(diào)節(jié)化合物存在情況下，是非常復(fù)雜和非常困難的。所有這些困難存在的原因一方面是從生物資源(因此，定義所有它們可能的生物活性是困難的)獲得一些免疫調(diào)節(jié)化合物，另一方面，所有這些化合物有許多生物活性，使在調(diào)節(jié)免疫體系的范圍方面其功能的定位不可能。基于單個(gè)細(xì)胞因子使用的療法根據(jù)現(xiàn)代經(jīng)驗(yàn)是復(fù)雜的，經(jīng)許多危害，它們是細(xì)胞因子受體的自身調(diào)節(jié)機(jī)制的相關(guān)結(jié)果，而且繼而免疫體系的效率降低了。也知道，經(jīng)外源性細(xì)胞因子激活免疫體系不是有充分價(jià)值的，而其它天然成份是丟失的。因此有希望制備一種免疫調(diào)節(jié)制品，它能活化在“生理水平上”的體系，意味著在天然調(diào)節(jié)相關(guān)和控制的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的目的在于用于免疫調(diào)節(jié)和佐劑療法的藥物組合物，此組合物包括代謝增強(qiáng)劑。根據(jù)關(guān)于免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)及通過(guò)代謝增強(qiáng)劑可能影響此應(yīng)答的已知信息，本發(fā)明拓寬了上述希臘專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)的知識(shí)范圍。代謝增強(qiáng)劑是一種天然非毒性化合物，在此情況下D—單糖的脫氧衍生物可影響細(xì)胞因子的生產(chǎn)，這意味著它是細(xì)胞水平免疫應(yīng)答的真正調(diào)節(jié)劑。
本發(fā)明的目的是用于免疫調(diào)節(jié)和佐劑療法的藥物組合物，此組合物包括D—核酸 10—35g2—脫氧—D—核糖(代謝增強(qiáng)劑)10—35gDL—α—丙氨酸 2—12g尼克酸 2—10gL—抗壞血酸 7—20g硫胺0.2—2g谷氨酰胺0.01—15g將這些成份溶于1000ml生理鹽水中。
D—單糖脫氧衍生物的存在使其能對(duì)免疫體系產(chǎn)生靶向作用，而且能用于治療較寬范圍免疫缺陷及免疫系統(tǒng)疾病，特別是自身免疫疾病及和上述希臘專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)比較的腫瘤疾病的藥物制品的應(yīng)用。
本發(fā)明實(shí)施例實(shí)施例1根據(jù)實(shí)施例A的藥物制品的組合物10g D—核糖10g 2—脫氧—D—核糖2g DL—α—丙氨酸2g尼克酸7g抗壞血酸溶于1000ml生理鹽水中。
實(shí)施例2生產(chǎn)特異性抗體的實(shí)施例1的制品的活性。
用C3H小鼠血清免疫7天后，通過(guò)卵蛋白，用ELISA測(cè)定特異性抗體。根據(jù)實(shí)施例A重復(fù)給定了制品，5次0.2mli.p.。結(jié)果見(jiàn)下表組 抗體x對(duì)照(％)對(duì)照672，8±55，62 100試驗(yàn)組 1055，3±387，6156，8X(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)從表1給定的值清楚地看出，根據(jù)此實(shí)施例的藥物制品顯著地促進(jìn)了特異性抗體的生產(chǎn)。
實(shí)施例3通過(guò)促細(xì)胞分裂劑誘導(dǎo)的脾細(xì)胞增殖及混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)方面，根據(jù)實(shí)施例A(實(shí)施例1)的制品的活性。
使用懸浮小滴方法進(jìn)行試驗(yàn)。根據(jù)實(shí)施例A，給定制品的量為3×0.2ml。腹腔注射于C3H小鼠。在緊接著用藥的最后一天，切除脾，并進(jìn)行試驗(yàn)。使用了促細(xì)胞分裂劑ConcavallinA(CONA)、Phyto-haemagglutinine(PHA)及脂多糖(LPS)。在試驗(yàn)對(duì)混合淋巴細(xì)胞(MLR)培養(yǎng)時(shí)，使用了來(lái)自于DBA/1小鼠的脾細(xì)胞作為同種抗原。
下列表中給出了此實(shí)施結(jié)果從結(jié)果中看出，根據(jù)此實(shí)施例，本發(fā)明的制品不能刺激由CONA、PHA和LPS誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞的增殖，甚至可以看到抑制此增殖。組 dpm±SE 對(duì)照(％)CON A對(duì)照組834，8±175，0100試驗(yàn)組490，7＝70，9 58，8PHA對(duì)照組1065，4±306，0 100試驗(yàn)組593，7±125，955，7LPS對(duì)照組1068，9±274，4 100試驗(yàn)組521，8±96，7 44，8MLR對(duì)照組494，2±49，6 100試驗(yàn)組477，3±97，2 96，6實(shí)施例4根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例B藥物制品的定量構(gòu)成35g D—核糖35g 2—脫氧—D—核糖12g DL—α—丙氨酸10g尼克酸20g抗壞血酸溶于1000ml生理鹽水中。
實(shí)施例5根據(jù)實(shí)施例B，生產(chǎn)特異性抗體的藥物制品的活性。
用C3H小鼠的血清，在免疫第7天用卵蛋白給ELISA測(cè)定特異性抗體。根據(jù)實(shí)施例B，重復(fù)給定了制品，5次0.2ml，腹腔注射。結(jié)果見(jiàn)下表。
組 抗體x對(duì)照(％)對(duì)照組672，8±55，62100試驗(yàn)組592，4±95，4 88x數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差從結(jié)果看出，根據(jù)實(shí)施例B的藥物制品不能刺激特異性抗體的產(chǎn)生。
實(shí)施例6通過(guò)促細(xì)胞分裂劑誘導(dǎo)的脾細(xì)胞的增殖及混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，根據(jù)實(shí)施例B的制品的活性。
使用懸浮小滴方法進(jìn)行試驗(yàn)。根據(jù)實(shí)施例B，使用制品的量為3×0.2ml，腹腔注射于C3H小鼠。在接著用藥的最后一天除去脾，進(jìn)行試驗(yàn)。使用了促細(xì)胞分裂劑ConcavallinA(CONA)、Phytchaemagglu-tinine(PHA)和脂多糖(LPS)。在進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)(MLR)試驗(yàn)時(shí)，來(lái)自DBA/1小鼠的脾細(xì)胞用作同種抗原。
組 dpm±SE 對(duì)照(％)
CON A對(duì)照組834，8±175，0 100試驗(yàn)組 1109，4±225，3 132，9PHA對(duì)照組1065，4±306，0 100試驗(yàn)組1475，6±213，4 138，5LPS對(duì)照組1068，9±274，4 100試驗(yàn)組1500，6±258，2 140，4MLR對(duì)照組494，2±49，6 100試驗(yàn)組411，0±47，7 83，2從結(jié)果中看出，根據(jù)實(shí)施例B的藥物制品不能顯著地刺激由CONA、PHA和LPS誘導(dǎo)的脾細(xì)胞的增殖。說(shuō)明在試驗(yàn)中沒(méi)有使用通用的標(biāo)準(zhǔn)品，因?yàn)閃HO還沒(méi)有建立合適的而且一般有效的免疫調(diào)節(jié)制品，這種制品與其它或新制品可進(jìn)行比較(免疫調(diào)節(jié)制品特性的定義問(wèn)題已于有關(guān)現(xiàn)有技術(shù)情況的段落中討論了)。
實(shí)施例7根據(jù)實(shí)施例B，培養(yǎng)小鼠黑色素瘤B16，藥物制品的活性。
將小鼠黑色素瘤經(jīng)右側(cè)皮內(nèi)接種于20個(gè)小鼠，C57B16細(xì)胞株。吸入移植液后，使用藥物制品，根據(jù)Grossmann V.，JarkovskaI.，KvetinaJ.Farmacie9，1988400—404用于體表人/小鼠量的改變。這意味著，根據(jù)實(shí)施例B每只鼠總是有0.04ml制品進(jìn)入尾靜脈。每使用5次，間隔兩天，二十八天使用二十次制品。對(duì)照組鼠獲得同等量的生理鹽水(10個(gè)鼠移植了B16黑色素瘤)。每三天觀察腫瘤一次，使用Slide calliper估計(jì)腫瘤大小。同時(shí)估計(jì)生長(zhǎng)曲線和鼠的重量。根據(jù)實(shí)施例B在治療期間通過(guò)使用藥物制品可證實(shí)在腫瘤的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間腫瘤大小的顯著差異。治療之后，此差異已不顯著。顯然有必要找出一種合適的藥物使用期，論述此制品活性之間及在開(kāi)始此療法前腫瘤塊之間的相關(guān)性。
曲線1、2、3分別給定了小鼠的重量改變、相對(duì)體積和腫瘤的相對(duì)表面指數(shù)。
實(shí)施例8根據(jù)實(shí)施例B，大鼠白血病過(guò)程中藥物制品的活性在定向試驗(yàn)中，細(xì)胞株SD/IPCV，大鼠白血病過(guò)程之后估計(jì)了體重、大鼠的存活及血象值。血象值對(duì)個(gè)別類(lèi)型細(xì)胞，在使用本制品前，根據(jù)實(shí)施例B，如下紅細(xì)胞 8050 000白細(xì)胞 12300血小板 826 000分化胚胎因子4髓細(xì)胞 0晚幼粒細(xì)胞 6柱細(xì)胞 0片段25嗜酸性細(xì)胞 0單核細(xì)胞4淋巴細(xì)胞56
X—細(xì)胞9使用制品進(jìn)入尾靜脈，根據(jù)人/鼠體表(見(jiàn)實(shí)施例7)的比率敘述使用的量。
第5次給藥后，血象值改變?nèi)缦录t細(xì)胞 7350 000白細(xì)胞 10900血小板 982000分化胚胎因子4髓細(xì)胞 0晚幼粒細(xì)胞 3柱細(xì)胞 0片段46嗜酸性細(xì)胞 0單核細(xì)胞3淋巴細(xì)胞35X—細(xì)胞 9每周估計(jì)類(lèi)似的值。治療結(jié)束，獲得下列值紅細(xì)胞 6310 000白細(xì)胞 9300血小板 1162000分化胚胎因子0髓細(xì)胞 0
晚幼粒細(xì)胞 0柱細(xì)胞 2片段39嗜酸性細(xì)胞 0單核細(xì)胞6淋巴細(xì)胞51治療結(jié)束，將動(dòng)物再飼養(yǎng)4周，在此期間末獲得下列值紅細(xì)胞 8700 000白細(xì)胞 8400血小板 778000分化胚胎因子0髓細(xì)胞 0晚幼粒細(xì)胞 0柱細(xì)胞 1片段22嗜酸性細(xì)胞 1單核細(xì)胞4淋巴細(xì)胞72X—細(xì)胞 0在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中估計(jì)了動(dòng)物的體重。此值在8周的過(guò)程中沒(méi)有明顯改變，動(dòng)物的臨床狀況也沒(méi)有明顯改變。從此結(jié)果看出，根據(jù)實(shí)施例B，經(jīng)此療法，通過(guò)使用藥物制品，可能使接受治療的動(dòng)物血象“正常化”。
在此實(shí)施例中獲得的結(jié)果，將作為用于靶試驗(yàn)的起始物，此試驗(yàn)與藥物制品的活性有關(guān)。此藥物制品在設(shè)定的用于治療腫瘤疾病的條件下，用于血液腫瘤病，也用于骨質(zhì)疏松癥。
實(shí)施例9根據(jù)實(shí)施例B在小鼠和大鼠經(jīng)靜脈和腹腔單一注射制品后的急性毒性限制試驗(yàn)。
為了進(jìn)行試驗(yàn)，使用了正常飼養(yǎng)，鼠齡6周的MMRI鼠。雄性體重為31—37g，雌性重量為27.5—32g，這用于在靜脈注射的情況下。在用于腹腔注射的情況下，雄性重量為32—37g，而雌性重量為28—33.5g。
根據(jù)實(shí)施例B，在兩個(gè)應(yīng)用模型中，使用制品的量為2ml/100g。靜脈應(yīng)用經(jīng)尾靜脈進(jìn)行，腹腔應(yīng)用經(jīng)腹腔左下四分之一處進(jìn)行。動(dòng)物飼養(yǎng)于帶有空調(diào)的室內(nèi)，控制生活制度(照光時(shí)間12小時(shí)，不照光時(shí)間12小時(shí)，溫度為23—25℃，相當(dāng)濕度為50—70％)，動(dòng)物飼養(yǎng)于聚丙烯鼠籠中(Type T3 Velaz)，在雌性情況下，每組5個(gè)動(dòng)物。由于其對(duì)聚丙烯鼠籠(Type T2 Velaz)的侵犯性，雄性動(dòng)物單獨(dú)飼養(yǎng)，在鼠籠中灑下消毒的木屑。在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中任意給動(dòng)物ST1飼料(Velaz)和飲用水。
使用制品后21天期間每天觀察動(dòng)物的臨床健康狀況及行為，每周估計(jì)動(dòng)物體重一次。在此期末，動(dòng)物經(jīng)宏觀病理觀察。
根據(jù)國(guó)際上有價(jià)值的OECD規(guī)則，為研究急性毒性，進(jìn)行試驗(yàn)。
臨床研究靜注應(yīng)用后，觀察到規(guī)律地深深地吹微風(fēng)(使用后立即出現(xiàn)直到使用后30分鐘)，然后，直至此期結(jié)束，繼續(xù)觀察動(dòng)物，不可能看到臨床毒性癥狀。生長(zhǎng)曲線也未能顯出任何明顯的改變，以證實(shí)使用的藥物制品的有選擇的毒性作用。經(jīng)腹腔注射應(yīng)用后，又觀察到了有規(guī)律地深深地吹微風(fēng)，以及痙攣性行走及“書(shū)寫(xiě)”痙攣癥狀。30分鐘后，通過(guò)所有接著的時(shí)期，動(dòng)物沒(méi)有出現(xiàn)任何臨床毒性癥狀。在上述實(shí)驗(yàn)期間，不可能觀察到任何動(dòng)物頻臨死亡，即不是在靜注后，也不是在腹腔注射后。21天的時(shí)間結(jié)束后，經(jīng)寵觀病理觀察，觀察動(dòng)物。靜注應(yīng)用后，證明沒(méi)有相駁于正常狀況的病理改變既沒(méi)有雄性，也沒(méi)有雌性，在腹腔器官和胸腔器官中。而且在代替應(yīng)用中，沒(méi)有觀察到病理改變。在腹腔注射應(yīng)用情況下，觀察結(jié)果一致。能觀察到脾表面有白色包被，脾部分或全部與胃相接觸，腎臟有點(diǎn)輕。
根據(jù)上述結(jié)果，在國(guó)際有價(jià)值的OECD規(guī)則下，關(guān)于藥物制品的急性毒性研究的急性毒性限制試驗(yàn)，對(duì)劑量為20ml/kg，靜注或腹腔使用后，兩性別小鼠，不能證實(shí)有任何毒性癥狀，而且也不可能證實(shí)小鼠的瀕臨死亡。
為了進(jìn)一步試驗(yàn)，使用了，鼠齡為6周的Wistar大鼠(常規(guī)飼養(yǎng))。雄性體重為194—209g，雌性體重為159—170g，這指在靜脈使用的情況下。在腹腔使用的情況下，雄性體重為190至215g，雌性為161—175g。
根據(jù)實(shí)施例B，在兩種應(yīng)用類(lèi)型使用制品的量為2ml/100g，靜注應(yīng)用經(jīng)尾靜脈進(jìn)行，腹腔應(yīng)用經(jīng)腹腔左上四分之一處進(jìn)行。動(dòng)物飼養(yǎng)于帶空調(diào)的房間，控制生活制度(12小時(shí)照光時(shí)間，12小時(shí)非照光時(shí)間，溫度為23—25℃，濕度為50—70％)于聚丙烯鼠籠中(TypT4 Velaz)，每組為同一性別，5個(gè)動(dòng)物，并灑消毒木屑。在整個(gè)試驗(yàn)期動(dòng)物任意飼用標(biāo)準(zhǔn)顆粒狀飼料ST1(Velaz)和飲用水。
使用制品21天期間，每天觀察動(dòng)物的臨床健康狀況及行為，每周估計(jì)動(dòng)物體重一次。在此期末，動(dòng)物接受肉眼病理觀察。
根據(jù)國(guó)際上有價(jià)值的OECD規(guī)則，為研究急性毒性，進(jìn)行試驗(yàn)。
臨床研究腹腔注射后，也是在靜注后觀察到有規(guī)律的深吹微風(fēng)，及輕微的跛行，直至用后5小時(shí)都可見(jiàn)到。在全部維持期內(nèi)，動(dòng)物沒(méi)出現(xiàn)任何臨床癥狀，生長(zhǎng)曲線也不能顯示任何顯著改變，以證實(shí)使用藥物制品的選擇性毒性作用。在試驗(yàn)期間，在靜注后或制品的腹腔注射后，沒(méi)有動(dòng)物死亡。
在21天結(jié)束，觀察動(dòng)物，使動(dòng)物接著肉眼病理觀察。靜注使用后，證明沒(méi)有相駁于正常狀態(tài)的病理改變，既不在雄性，也不在雌性，在腹腔和胸腔器官中，而且在取代應(yīng)用中，仍沒(méi)有任何病理改變。只有腎臟略輕，腹腔注射后，雄性和雌性觀察結(jié)果是一致的觀察到在脾的表面有白色包被，脾部分或全部和胃相附，肝小葉連在一起，并有白色包被，腎臟略輕。
組織學(xué)研究，在超出要求研究范圍，通過(guò)OECD規(guī)則進(jìn)行了。在肝臟不可能觀察到局部慢性增殖性肝炎，肝實(shí)質(zhì)無(wú)病理改變。肝臟發(fā)現(xiàn)結(jié)果在正常范圍之內(nèi)。在肝皮質(zhì)的一些上皮細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)了透明樣沉積物。
根據(jù)上述結(jié)果，急性毒性的限制試驗(yàn)在OECD規(guī)則下進(jìn)行，以測(cè)定藥物組合物的急性毒性。根據(jù)實(shí)施例B，用藥量為20ml/kg靜注或腹腔注射，在兩種性別的大鼠不產(chǎn)生任何顯著的毒性癥狀。在試驗(yàn)期內(nèi)無(wú)動(dòng)物死亡。
權(quán)利要求
1.用于免疫調(diào)節(jié)和佐劑治療的藥物組合物，其特征在于此組合物含有溶于1000ml生理鹽水中的D—核糖 10至35g2—脫氧—D—核糖10至35g(代謝增強(qiáng)劑)DL—α—丙氨酸 2至12g尼克酸 2至10gL—抗壞血酸 7至20g硫胺0.2至2g谷氨酰胺0.01至15g
2.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其特征在于，它是靜脈應(yīng)用的合適形式。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其特征在于，它是腹腔應(yīng)用的合適形式。
4. 2—脫氧—D—核糖用于制造權(quán)利要求1至3藥物組合物以用于免疫調(diào)節(jié)和佐劑治療的用途。
全文摘要
用于免疫調(diào)節(jié)和佐劑療法的藥物組合物，它包括代謝增強(qiáng)劑、2-脫氧-D-核糖和其它活性成分，即，核糖、DL-丙氨酸、尼克酸、L-抗壞血酸、維生素、硫胺和谷氨酸酰胺。此藥物組合物用于免疫調(diào)節(jié)和佐劑療法及預(yù)防免疫體系的減弱。
文檔編號(hào)A61K31/70GK1128948SQ94193037
公開(kāi)日1996年8月14日 申請(qǐng)日期1994年7月12日 優(yōu)先權(quán)日1993年7月12日
發(fā)明者O·庫(kù)福達(dá)基 申請(qǐng)人:阿拉喬斯醫(yī)藥公司