專利名稱：：噠嗪并[4,5－b]喹啉5－氧化物衍生物,它們的制備和作為甘氨酸拮抗劑的應用的制作方法新的吡啶并2,3-二氮雜萘二酮化合物，含有它們的藥物組合物，及其治療與興奮性神經中毒和谷氨酸能(glutamatergic)神經傳導功能障礙(malfunctioning)有關的神經紊亂的用途。谷氨酸大概是中樞神經系統主要的興奮傳導物質，但也可能涉及許多病理過程和神經性中毒過程，因此，谷氨酸拮抗劑治療應用的發展受到了很大的關注(見Danysz等，1995年綜述)。谷氨酸激活三個主要類型的離子移變受體，即α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異噁唑丙酸(AMPA)、紅藻氨酸和N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體，以及幾種代謝受體。NMDA受體拮抗劑可能具有廣泛的治療用途，對位于陽離子通道內的不同識別區進行作用，可以實現NMDA受體功能的抑制，如初級傳導區、士的寧不敏感的甘氨酸區(甘氨酸B)、多胺區和苯環已哌啶區。受體的脫敏作用是一個生理過程，充當起一個內在的控制機制，阻止谷氨酸受體的長期神經毒性激活，但又允許短暫的生理性激活。對于NMDA受體，助興奮劑(co-agonist)甘氨酸作為內源配體，通過激活甘氨酸B區能阻礙這種脫敏作用。令人感興趣的是，局部缺血不僅增加了細胞外的谷氨酸濃度，也增加了其甘氨酸的濃度，盡管后一種效應沒有前者顯著，但持續時間要長的多。因此，在類似情況下，一些良好的甘氨酸B拮抗劑可以將NMDA受體強化脫敏至其生理水平，以恢復正常的突觸傳導。確實，對試驗動物中樞神經給藥的基礎上表明，與NMDA受體復合物其它識別區的作用藥物相比較，甘氨酸B拮抗劑可以提供更好的治療渠道。遺憾的是，直到最近，除了對這一結果的明確證實之外，通過系統給藥得到的大部分甘氨酸B拮抗劑的藥物動力學性能卻很差。但是，已報道的一些甘氨酸B拮抗劑，對痛覺過敏癥進行系統給藥，以及作為抗焦慮藥，均有良好的治療指標。我們已經開發了一系列三環“吡啶并2,3-二氮雜萘二酮”，Ⅰ類化合物結構上涉及Zeneca的專利甘氨酸B拮抗劑(ICI,EPA0516297A1,02,12,92)，Ⅱ類化合物是這些化合物N-氧化物衍生物，尚未在Zeneca專利中提出或公開。Ⅱ類化合物在體外試驗中也是有效的甘氨酸B拮抗劑，在體內試驗還顯示出比Ⅰ組化合物更好的全身利用度和/或血腦屏障穿透性。此外，這些化合物的鹽衍生物，如加入膽堿制備的鹽和4-四甲基銨(4-NH3)，更提高了生物利用率。可以預見，本發明的新化合物可用于治療下列疾患1．急性神經中毒，如中風期間的局部缺血、創傷、缺氧、低血糖和肝腦病；2．慢性神經元變性疾病，如帕金森癥、亨廷頓舞蹈病、復合硬化癥、肌萎縮性脊髓側索硬化、艾滋病神經元變性疾病、橄欖體腦橋小腦萎縮、圖雷特綜合癥、運動神經元疾病、線粒體機能障礙、科爾薩科夫精神病、克羅伊茨費爾特-雅各布病；3．與中樞神經系統長期的適應力改變有關的其它病癥，如慢性疼痛、藥物耐受、藥物依賴和及藥物成癮(如鴉片、可卡因、苯并二氮類和酒精)和遲發性運動障礙；4．癲癇(全身性和不完全癲癇綜合癥)、精神分裂癥、焦慮癥、抑郁癥、急病癥、痙攣和耳鳴。本發明的目的是提供新的更有效的吡啶并2,3-二氮雜萘二酮化合物，它們的藥物組合物和治療與興奮性神經中毒和谷氨酸能(glutamatergic)神經傳導功能障礙(malfunctioning)有關的神經紊亂的方法。本發明更進一步的目的是提供能滿足上述理論要求的新的化合物、組合物和方法。另外的目的請見于下文，對本領域人員來說，本發明的其它目的是易理解的。本發明尤其包括以下各自獨立的幾個方面或其組合具有下式的吡啶并2,3-二氮雜萘二酮化合物和其藥學上可接受的鹽其中R1和R2選自氫、鹵素和甲氧基，或者R1和R2一起形成亞甲二氧基；所述化合物的鹽選自它們的膽堿鹽和4-四甲基銨鹽；所述化合物選自4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，8-氯-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，8-溴-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，8-氟-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，7,8-二氯-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，7-溴-8-氯-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，7-氯-8-溴-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，和上述化合物的藥學上可接受的鹽；所述化合物選自4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽，8-氯-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽，8-溴-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽，8-氟-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽，7,8-二氯-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽，7-溴-8-氯-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽，7-氯-8-溴-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽。還有藥物組合物，包括有效劑量的作為甘氨酸B拮抗活性組分的該化合物；所述藥物組合物，包括有效劑量的以其膽堿鹽的形式作為甘氨酸B拮抗活性組分的所述化合物；該藥物組合物，包括有效劑量的選自下列的化合物作為甘氨酸B拮抗活性組分4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，8-氯-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，8-溴-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，8-氟-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，7,8-二氯-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，7-溴-8-氯-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，7-氯-8-溴-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，或上述化合物的藥學上可接受的鹽；所述藥物組合物，包括有效劑量的選自下列的化合物作為甘氨酸B拮抗活性組分4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽，8-氯-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽，8-溴-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽，8-氟-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽，7,8-二氯-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽，7-溴-8-氯-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽，7-氯-8-溴-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽。此外還有治療與活體的動物中興奮性神經中毒和谷氨酸能(glutamatergic)神經傳導功能障礙(malfunctioning)有關的神經紊亂的方法，包括對需要治療的動物活體給予有效甘氨酸B拮抗劑量的該化合物或藥物組合物；所述方法，其中的化合物選自4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，8-氯-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，8-溴-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，8-氟-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，7,8-二氯-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，7-溴-8-氯-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，7-氯-8-溴-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，或上述化合物的藥學上可接受的鹽；及治療與動物活體中興奮性神經中毒和谷氨酸能(glutamatergic)神經傳導功能障礙(malfunctioning)有關的神經紊亂的方法，包括對需要治療的動物活體給予有效甘氨酸B拮抗劑量的該化合物或藥物組合物；其中所用的化合物為其膽堿形式且選自4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽，8-氯-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽，8-溴-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽，8-氟-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽，7,8-二氯-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽，7-溴-8-氯-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽，7-氯-8-溴-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽。以下詳述內容、實施例和藥理學內容是對本發明的說明，但不應作為本發明的限制。方法和結果Ⅰ類和Ⅱ類三環“吡啶并2,3-二氮雜萘二酮”的基本結構R1/R2=H和/或鹵素R1/R2=H和/或O-CH3R1/R2=H和/或亞甲二氧基化學制備喹啉2,3-二羧酸二甲酯-1-氧化物(3)的一般方法將2-硝基苯甲醛1(25mM)與鈉(27mM)的無水甲醇(40ml)冷溶液(冰浴)用(二乙氧基氧膦基)丁二酸二甲酯2(30mM，按照S.Linke等，Lieb.Ann.Chem.,1980(4),542所述方法制備)的無水甲醇(10ml)溶液處理30min，所得黑色溶液在0-5℃下攪拌1.5h，減壓蒸去溶劑，殘留物在乙酸乙酯和水之間分配，將乙酸乙酯部分用硫酸鈉干燥，再減壓蒸發，殘留物用異丙醇重結晶，得到標題化合物喹啉2,3-二羧酸二甲酯-1-氧化物3的近白色(或淺黃色)粉末。化合物3的理化性質和1H-NMR譜圖數據列于表1和2。a.5-溴-4-氯-2-硝基苯甲醛(1f)在0-5℃往硫酸(40ml)和硝酸鈉(2.66g,31.3mM)混合物中加入3-溴-4-氯-苯甲醛(6.25g,28.5mM)，所得混合物在室溫下攪拌7h，用冰水(300ml)稀釋，濾出固體沉淀物，用水洗滌并干燥，得一粉末，將該物質用異丙醇和水(2∶1)的混合物重結晶，得到標題混合物2-硝基苯甲醛1f(3.6g,51.5％)的黃色粉末，m.p.81-82℃。C7H3BrCLNO3元素分析計算值(％)C31.79H1.14N5.30實驗值(％)C31.55H0.98N5.091H-NMR(CDCl3),δ:8.22(s,1H),8.23(s,1H),10.39(s,1H).b.4-溴-5-氯-2-硝基苯甲醛(1g)除了以4-溴-3-氯-苯甲醛(2.97g,13.5mM)開始外，采用步驟(a)獲得標題化合物1g(1.9g,53.0％)的黃色粉末，m.p.95-98℃。C7H3BrCLNO3元素分析計算值(％)C31.79H1.14N5.30實驗值(％)C31.60H1.01N5.111H-NMR(CDCl3),δ:8.02(s,1H),8.43(s,1H),10.39(s,1H).制備喹啉2,3-二羧酸二甲酯(7)的一般方法將N-氧化物3(10mM)與三氯化磷(30mM)的無水氯仿(100ml)溶液回流7h，減壓蒸去溶劑，殘留物在乙酸乙酯和水之間分配，有機層用硫酸鈉干燥，再減壓蒸發，殘留物用異丙醇重結晶，得到標題化合物喹啉2,3-二羧酸二甲酯7的近白色(或淺黃色)粉末。化合物7的理化性質和1H-NMR譜圖數據列于表3和4。制備4-羥基-1-氧-1,2-二氫噠嗪并[4,5-b]-喹啉5-氧化物(5)的一般方法在氬氣氣氛下，往攪拌著的喹啉2,3-二羧酸二甲酯1-氧化物(5mM)的沸騰乙醇(25ml)溶液(或懸濁液)中，加入水合肼(15mM)，將混合物回流3h，其間有黑色沉淀生成，冷卻至室溫后，過濾反應混合物，所得固體用乙醇和乙醚洗滌，干燥，獲得肼鹽4。將該物質在70-100℃于乙酸(15ml)中攪拌3h，冷至室溫后，用水(45ml)稀釋混合物，過濾并收集固體，所得固體用乙醇洗滌，干燥，得黃褐色固體，用二甲基甲酰胺重結晶數次，得到標題化合物噠嗪并[4,5-b]-喹啉5-氧化物5橙色粉末。化合物5的理化性質和1H-NMR譜圖數據列于表5和6。制備1,4-二氧-1,2,3,4-四氫噠嗪并[4,5-b]-喹啉(9)的一般方法往攪拌著的喹啉2,3-二羧酸二甲酯7(5mM)的沸騰乙醇(25ml)溶液(或懸濁液)中，加入水合肼(30mM)，將混合物回流8h，其間有沉淀生成，冷卻至室溫后，過濾反應混合物，所得固體用乙醇和乙醚洗滌，干燥，獲得肼鹽8。將該物質在70-100℃于乙酸(15ml)中攪拌3h，冷至室溫后，用水(45ml)稀釋混合物，過濾并收集固體，所得固體用乙醇和乙醚洗滌，干燥，得到標題化合物噠嗪并[4,5-b]-喹啉9黃色粉末。化合物5的理化性質和1H-NMR譜圖數據列于表5和6。制備4-羥基-1-氧-1,2-二氫噠嗪并[4,5-b]-喹啉5-氧化物膽堿鹽(6)和1,4-二氧-1,2,3,4-四氫噠嗪并[4,5-b]-喹啉膽堿鹽(10)的一般方法往攪拌著的噠嗪并[4,5-b]-喹啉9或N-氧化物(10mM)的甲醇(50ml)懸濁液中，加入膽堿氫氧化物(10.5mM,45wt％甲醇溶液)，所得溶液在旋轉蒸發器中濃縮，固體殘留物用乙醇重結晶得到標題化合物膽堿鹽10或6暗橙色(hygroscopicorange)(或紅色)粉末。表1所制備的喹啉2,3-二羧酸二甲酯-1-氧化物3表2化合物3的1H-NMR(CDCl3)譜圖數據<p>表3所制備的喹啉2,3-二羧酸二甲酯7p><p>表4化合物7的1H-NMR(CDCl3)譜圖數據<p>表5所制備的4-羥基-1-氧-1,2-二氫噠嗪并[4,5-b]-喹啉5-氧化物5</tables>表6化合物5的1H-NMR(DMSO-d6)譜圖數據表7所制備的1,4-二氧-1,2,3,4-四氫噠嗪并[4,5-b]-喹啉9<p>表8化合物9的1H-NMR(DMSO-d6)譜圖數據<p>表9所制備的4-羥基-1-氧-1,2-二氫噠嗪并[4,5-b]-喹啉5-氧化物膽堿鹽6<p>表10化合物6的1H-NMR(CD3OD)譜圖數據表11所制備的1,4-二氧-1,2,3,4-四氫噠嗪并[4,5-b]-喹啉膽堿鹽10*x=0.25(d)1.0(d,e)2.5(c)表12化合物10的1H-NMR(CD3OD)譜圖數據藥理學體外試驗受體結合研究膜的制備和蛋白測定按照Forster和Wong(1987)進行組織制備，將雄性Sprague-Dawleys鼠(200-150g)斷頭并迅速切除其腦組織，分割皮層，并于20倍體積0.32M的冰冷蔗糖溶液中，用玻璃-特氟隆勻漿器勻化。勻漿在1000×g離心分離10min，棄去團粒，上清液在20000×g離心分離10min，將所得的團粒再懸浮于20倍體積的蒸餾水，在8000×g離心分離20min，然后在5mMTris-HCl,pH7.4條件下，將上清液和米色膜層離心分離三次(48000×g,20min)，所有離心分離步驟均在4℃下進行。重新懸浮于5倍體積的5mMTris-HCl,pH7.4溶液后，在-80℃下將膜懸浮液快速冷凍，保持至測定日，于測定日將膜解凍，用5mMTris-HCl,pH7.4溶液再懸浮，離心分離48000×g20min，如此洗滌4次，將最后的團粒懸浮于緩沖測定液中。根據Lowry(1951)方法和一些改進(Hartfree,1972)，測定最后膜制品的蛋白含量。將50μl蛋白樣品(一式三份)稀釋至1ml，并取由2g酒石酸鈉鉀和100gNa2CO3于500ml1NNaOH和500ml水中組成的溶液0.9ml，進行處理；空白樣和標樣(含牛血清白蛋白)按同一方法制備。試管放入50℃水浴中10min并冷至室溫，加入2g酒石酸鈉鉀和1gCu2SO4·5H2O于90ml水和10ml1NNaOH中所得的溶液100μl，樣品在室溫下至少放置10min，然后快速混合下加入3mlFolin-Ciocalteu試劑(1ml試劑用15ml水稀釋)。試管在50℃再加熱10min并冷至室溫，用1cm比色皿讀出650nm處的吸收強度。用于我們進行研究的最終蛋白濃度為100-250μg/ml。在兩種結合測定中，均使用Millipor過濾系統終止培育。所有樣品均一式三份，在恒定真空下，于Schleicher&amp;Schuell玻璃纖維過濾器上，用2.5ml冰冷的測定緩沖液洗滌3次，分離和洗滌后，將過濾器置于閃爍液(5ml,UltimaGold)，以常用液閃計數器測定保留在過濾器上的放射性(HewlettPackard,LiquidScintillationAnalyser)。‘結合總量’是指不存在任何添加劑的條件下，所結合的放射性配體的絕對量；而在高濃度競爭體存在時，測定其‘非特異性’結合。[3H]5,7-DCKA結合測定按照由前組方法(Canton等人，1992；Yoneda等，1993)改進的方法進行試驗，將膜懸浮于10mMTris-HCl,pH7.4緩沖液培育，培育時間為4℃45min。加入未標記甘氨酸至0.1mM，確定[3H]5,7-DCKA非特異性結合。終止溶液(stop-solution)含有10mMTris-HCl和10mM硫酸鎂，pH7.4，盡快過濾。取代試驗用10nM的固定[3H]5,7-DCKA濃度進行。測試化合物用水或DMSO稀釋，至少加入5種不同的濃度。[3H]甘氨酸結合測定[3H]甘氨酸結合測定按照Kessler和同事(1989)所述的方法進行，鼠腦皮層膜按前述方法制備，最后的團粒懸浮于50mMTris-乙酸鹽，pH7.4緩沖液，在士的寧堿存在下，將至少5種不同的濃度測試化合物與20nM[3H]甘氨酸于4℃培育30min。所有化合物分別溶于水或DMSO。在培育混合物中引入100μM甘氨酸測定非特異性結合。用2ml終止溶液(50mMTris-HCl引入10mM硫酸鎂，pH7.4，冷至＜2℃)稀釋試樣終止培育，隨后再用2.5ml緩沖液洗滌，盡快過濾。結果在[3H]5,7-DCKA測定中，八個所測試的化合物的IC50≤1μM(見表13)。很容易看出，所選的六個化合物在[3H]5,7-DCKA測定中結合效力更大，但是這并未反映在傳質系數(Kds)的很大差別(未顯示)。特別注意到成對化合物中，Ⅱ組化合物在[3H]5,7-DCKA測定中具有更大的親和力，這一差別在[3H]甘氨酸測定中不那么明顯。表13a表13b</tables>膜片鉗方法從鼠胚胎(E20-E21)獲取更高級腦丘，移至冰冷的不含鈣和鎂的Hank緩沖鹽溶液(Gibco)，用0.66％胰蛋白酶/0.1％DNA酶(Sigma)進行15min預培育后，于0.05％DNA酶/0.3％卵類粘蛋白(Sigma)中將細胞機械解離，將解離細胞在18G離心分離10min，再懸浮于很少量的基質介質，以200,000cellscm-2的密度將其平鋪在用聚-L-賴氨酸(Gibco)預涂的成形佩特里培養平碟(Falcon)上，使用少量加有5％胎腓腸血清和5％馬血清(Gibco)的NaHCO3/HEPES緩沖的基質介質營養細胞，并在37℃、5％CO2和95％濕度條件下進行培育，于試管中7天后，用胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖甙(20μMSigma)將基質介質完全換掉，以阻止膠質細胞的有絲分裂，此后每周兩次部分更換介質。這樣選擇更高級腦丘培養物進行試驗，能提供非常穩定的記錄條件，這對電壓-依賴性試驗和動力學試驗是絕對必要的。此外，對于濃度鉗試驗(concentrationclamp)，較小的神經元(體組織15-20μmφ)非常有利于將緩沖擴散問題最小化。在室溫下(20-22℃)，使用全室型(wholecellmode)拋光玻璃電極(4-6mΩ)和輔助放大器EPC-7(List)，由這些神經元得到膜片夾記錄。通過特制的快速過冷系統的開關通道，以一般流出速度提供測試物質(10-20ms交換時間)，細胞內溶液成分如下(mM)CsCl(120),TEACl(20),EGTA(10),MgCl2(1),CaCl2(0.2)，葡萄糖(10),ATP(2),cAMP(0.25)；pH用CsOH或HCl調節至7.3。細胞外溶液含有的基本成分如下(mM)NaCl(140),KCl(3),CaCl2(0.2),葡萄糖(10),HEPES(10)，蔗糖(4.5)，海豚毒素(TTX,3×10-4)。在大部分試驗中，所有溶液均含有甘氨酸1μM，在進行三環“吡啶并2,3-二氮雜萘二酮”的甘氨酸-依賴性測試時，甘氨酸的濃度連續增加(1-10μM)。結果五對三環“吡啶并2,3-二氮雜萘二酮”阻止向NMDA(200μM)內流的IC50處于低μM范圍，Ⅱ類化合物的效力一般比Ⅰ類化合物大約2-3倍(表14a)，其中最有效的是Mrz2/502和Mrz2/514，這一效應甘氨酸B區調節，其可由在著甘氨酸濃度增加的情況下，濃度響應曲線的平行移位所證實。按照Cheng-Prusoff關系估計的Mrz2/502的Kb值與1、3、10μM甘氨酸對應的值相似(分別為80、124和118nM)，另外，Mrz2/501和Mrz2/502的效果不依賴于電壓，所有受試化合物阻止穩態流比阻止峰值流的效力約大3-10倍。膽堿鹽衍生物在體外試驗中，具有和游離酸相似的效力(表14b)。相反，三個有效的甘氨酸B拮抗劑對AMPA(100μM)內流卻僅是很弱的拮抗劑。Mrz2/502、2/514和2/516阻止峰AMPA誘導的電流的IC50分別為25、73和18μM，但對阻止平高區電流基本上是無效的，所有IC50＞100μM(表14a)。該作用盡管很弱，卻是競爭性的AMPA受體拮抗劑所特有的，它們優先阻斷受體的峰非脫敏態、低親和態(見Parsons等人，1994)。表14a表14b體外興奮性神經毒性方法皮質神經元的分離與膜片夾記錄所述方法相似，只是使用妊娠17-19天的胎鼠，以300,000細胞/孔的密度將神經元鋪于涂有0.025mg/ml聚-D-賴氨酸的24-多孔板(Greiner)上，在Dulbecco改進基質(DMEM,GIBCO)中培養細胞，其中加有10％的熱滅活胎腓腸血清(GIBCO)。培養物在37℃、5％的CO2中保持，一周后第一次更換介質，以后每三天用新鮮的介質替換一半，培養持續17天，用于試驗。對EAA的曝露在不含血清的EM-N2介質(Bottenstein1979)進行，其中含有0.5mMNMDA/1μM甘氨酸和被測試藥物。在加入NMDA前將細胞用藥物和1μM甘氨酸預培育15min,24h后，在相襯顯微鏡下進行細胞毒性反應的形態學測定，并測量所釋放的LDH，進行生化定量。按照Wroblewskih和LaDue方法測定24h后上清液中的LDH作用。簡而言之，在室溫下將0.1ml上清液加入到0.9ml磷酸鈉緩沖液(pH=7.5)，其中含有丙酮酸鹽(22,7mM)和NADH(0.8mg/10ml)，用Kontron分光光度計在340nm記錄10min內丙酮酸鹽向乳酸鹽的轉化。結果完整的濃度-響應曲線尚未得到。但是在體外試驗中，低μM濃度的Mzr2/501和Mzr2/502是有效的神經保護劑，Mzr2/502在這方面似乎更為有效(見表15)表15體內試驗抗驚厥活性目的通過評估所測試的試劑的抗驚厥活性，對其NMDA拮抗性質進行評估，此外，在抗驚厥活性期間，使用抑制劑羧苯磺胺，評估有機酸在所測試試劑從腦中排除中的轉運作用。方法將每籠10-15只的雄性白化Swiss鼠(19-21g)用于NMDA致死率試驗(Leander等人，1988)，在五甲烯四氮唑(PTZ)致驚厥試驗中，使用每籠40只的雄性白化Swiss鼠(25-34g)，而在最大電休克和運動原損傷試驗中，使用每籠5只的NMR雌性鼠(19-21g)。在12-h照明-黑暗(6a.m.開始照明)和控溫(20±0.5℃)條件下，所有動物保持有隨意的水扣食物，所有試驗在10a.m.-5p.m.進行。如果沒有另外說明(見下文)，所測試的試劑在驚厥感應前15min進行i.p.注射，Mrz2/502溶解于加有NaOH的鹽水中，其它大部分試劑溶解于下述溶液0.606gTris；5.0g葡萄糖；0.5gTween80；和95ml水，膽堿鹽和四甲基銨鹽溶解于蒸餾水。在NMDA所致的鼠驚厥試驗中，首先進行NMDA的劑量-響應關系測定，給出ED97劑量，其用于確定拮抗性能。將注射ED97劑量后的動物置于小籠中(20×28×14cm)觀察20min，陣攣性驚厥和強直性抽搐后的死亡即為藥理學終點。以90mg/kg劑量注射五甲烯四氮唑，一般性強直驚厥出現在30min，對NMDA拮抗劑，這一參數比陣攣性驚厥更為靈敏，藥理學終點定為后肢出現伸展性緊張。MES(100Hz,0.5sec震擾期，50mA震擾強度，0.9ms脈沖期，UgoBasile)試驗通過角膜電極進行，記錄強直性驚厥的出現，(后爪強直伸展時與軀體的最小角度為90°)。在另外的試驗中，給鼠服用所測試的試劑前30min，注射以羧苯磺胺(200mg/kg)，以評估在排除(作用)有機酸的轉運作用。目的是使用LitchfieldWilcoxon(1949)量子劑量響應試驗獲得所有記錄參數的ED50。結果在所測試的化合物中，只有四個化合物而且全部是Ⅱ類化合物，在M.E.S．試驗中給出的i.p．顯示是有效的(Mrz2/499，Mrz2/502,Mrz2/516和Mrz2/514，見表16a)。相應的Ⅰ類化合物是無效的。顯然，全部四個化合物在體內的半衰期很短。對給出i.p．的甘氨酸B拮抗劑的活性測定，PTZ試驗似乎是更為靈敏的模型。實際上，Ⅰ類化合物在某一劑量仍然無效時，而同樣的Ⅱ類化合物在低于2-4倍的劑量是有效的。這些同樣的N-氧化物衍生物(結構Ⅱ)膽堿鹽在全部三種試驗模型中均有明顯的抗驚厥活性，而它們的非N-氧化物衍生物沒有活性，或者活性很弱(表16b)。此外，膽堿鹽的作用持續時間似乎更長。注射羧苯磺胺大大延長了所有測試化合物的抗驚厥作用的持續時間，例如，在沒有羧苯磺胺時，2/514和2/570的半衰期分別為約40min和80min。試驗羧苯磺胺時，其半衰期分別延長至約180min和210min。因此有機酸在腦外脈絡叢中的轉運，在所測試化合物的作用持續時間短的情況下具有重要作用。所用劑量(200mg/kg)的羧苯磺胺對MES所致的驚厥，本身沒有獨立的作用。表16a<EAA拮抗劑對體內脊髓神經的微量電泳試驗使用i.v．給藥，阻止鼠脊髓獨立神經元對AMPA和NMDA的微量電泳的響應，從而評估這些甘氨酸B拮抗劑在體內作為NMDA受體拮抗劑的能力。Ⅱ類化合物Mrz2/502和2/516是有效的體內NMDA受體拮抗劑，其ID50分別為1.2和1.8mg/kgi.v.，而對應的Ⅰ類化合物在劑量達16mg/kgi.v．時，完全沒有作用。在3-4倍的劑量下，對AMPA也具有拮抗響應，盡管這與體外試驗相對照，缺乏明顯的選擇性。表17a在該試驗模式下，使用i.v．給藥后，膽堿鹽與三種游離酸幾乎同等有效，但其對NMDA比對AMPA的選擇性稍好一些。同樣，非N-氧化物衍生物(Ⅰ類化合物)沒有作用效果。表17b討論四種Ⅱ類化合物Mrz2/499,2/501,2/514和2/516在體外試驗中是甘氨酸B拮抗劑，而且在體內試驗中，與它們相應的Ⅰ類化合物(Mrz2/585,2/501,2/503和2/519)相比，其系統的和/或CNS有效性要好的多。對幾乎所有的現有甘氨酸B拮抗劑，通過CNS是一個主要問題，但是該類新化合物克服了這一主要障礙，因此而成為治療用的甘氨酸B拮抗劑。加成鹽根據前文概述的方法，制備化合物5,6,7,8,9,和10與季胺(如，4-四甲基銨，4-四乙基銨)、季胺醇(如，膽堿)或季胺酸(如N,N,N-三甲基絲氨酸)的加成鹽。膽堿和4-四甲基銨鹽明顯改善生物利用率，更為優選。藥物組合物本發明的化合物可以加工為藥物組合物，除了包括本發明的活性化合物外，還有藥學上可接受的載體或稀釋劑。該組合物可以通過口服或非腸道途徑給予動物，尤其是人，例如，口服的固體劑型或藥物組合物可以是膠囊、片劑、丸劑、粉劑或顆粒劑，在這些固體藥劑中，活性物質或其前藥至少與一種藥學上可接受的稀釋劑或載體相混合，例如，蔗糖、乳糖、淀粉、滑石或者合成的或天然的膠質，粘合劑如明膠，潤滑劑如硬脂酸鈉，和/或崩解劑如碳酸氫鈉。為了獲得持續釋放效果，藥物組合物這可以施入象水膠體或其它聚合物類物質。作為本領域常規技術，還可以加入其它物質，如潤滑劑或緩沖劑。如果需要，片劑、丸劑或顆粒劑還可以進行腸溶包衣。用于口服的液體可以是含有常用惰性稀釋劑(如，水)的脂質體、乳劑、溶液或懸浮劑。此外，這些液體藥物組合物還可以含有潤濕劑、乳化劑、分散劑或常用的表面活性劑，以及甜味劑、調味劑或賦香物質。適當的非腸道使用的制劑可以包括其它形式、滅菌的水溶液或非水溶液、懸浮液、脂質液或乳液，對于這種形式的藥物組合物，許多已知的其它物質都可以用作藥學上可接受的稀釋劑或載體。根據所選擇的使用方式和治療持續時間，本發明的活性化合物在制劑中的確切劑量可以不同，優選按照主治醫師或獸醫認為合適的劑量。顯然，本發明的活性物質也可以和其它藥理活性物質結合使用。在本發明的組合物中，活性物質所占組合物的不同份額范圍可以很寬，只要本發明的活性組分或其前藥構成或是一個有效的量，即所采用的劑量形式與所獲得的有效劑量值是一致的。顯然，幾種制劑形式可以在同一時間給藥，而幾種獨立的活性化合物甚至可以以同一藥物組合物或制劑給藥。治療方法如前所示，本發明的化合物，優選其藥物組合物或制劑形式，適用于口服或非腸道給藥，具體病例治療過程中，按照已有的藥物和/或獸藥原則，在主管醫師或獸醫的指導下，確定具體的的一次劑量或日用劑量。除了口服或非腸道給藥之外，還可以采用直腸和/或靜脈給藥，盡管優選口服給藥，但非腸道給藥所使用的劑量一般大大減小。每天重復或分次服用約1-3g的劑量是合適的。根據具體病例的情況，也可以采用更寬的范圍每天0.5-10g。雖然500mg活性物很適合用于片劑，但一次劑量可以為約200-1000mg不同，建議片劑使用的500mg適用于口服給藥，例如，每天1-3次。不言而喻，單次給藥劑量可以多于一片，以按照需要攝取上文建議的日口服給藥劑量，每天1-3g。正如已經說明的那樣，本發明的化合物或其前藥可以以許多方式給予動物包括人體，例如，口服膠囊或片劑，以無菌溶液或懸浮液形式非腸道給藥，或藥丸植入法，和在某些情況下，以無菌溶液形式靜脈注射，其它顯見的給藥形式是通過皮膚、皮下、頰部、肌肉腹膜給藥，以及主管醫師或獸醫慣用的特殊給藥方式。由此看出，本發明提供了新的吡啶并2,3-二氮雜萘二酮化合物和它們的藥物組合物，以及用它們治療與興奮性神經中毒和谷氨酸能(glutamatergic)神經傳導功能障礙(malfunctioning)有關的神經紊亂的方法，這些一并對本領域前期一直存在而終未解決的問題給出了久已期待的解決方法。本發明不應當理解為僅限于所公開的具體化合物、組合物、方法或工藝，因為對于本發明所屬領域的專業技術人員來講，在此基礎上的諸多改進和變化是顯而易見的，因此，本發明只應當理解為與附后權利要求法律意義一致的全部限定范圍。參考文獻BottensteinJE,SatoGH(1979):Proc.Natl.Acad.Sci.USA76,pp.514-517.CantonT,DobleA,MiquetJM,JimonetP,BlanchardJC(1992)藥物藥理雜志.44,PP.812-816.Dansyz,W,ParsonsCG,BresinkI,QuaekG(1995)醫藥新聞及前景英國藥理雜志8,pp.261-277.FosterAC,WongEHF(1987)英國藥理雜志.91,pp.403-409.HartfreeEF(1972)生化分析48,pp.422-427.KesslerM,TerramaniT,LynchG,BaudryM(1989):J.Neurochem.52,PP.1319-1328.LeanderJD,LawsonRR,OrnsteinPL,ZimmermanDM(1988)腦研究。448,p.115.LitchfieldJT,WilcoxonF(1949)藥理實驗雜志。Ther.96,p.99.LowryOH,RosebroughNJ,FarrAL,RandellRJ(1951)生化雜志。193,pp.265-275.ParsonsCG,GrunerR,RozentalJ(1994)神經藥理學33,pp.589-604.WroblewskiF,LaDueJS(1955)實驗、生物，藥物會志.90,p.210.YonedaY,SuzukiT,OgitaK,HanDK(1993)神經化學雜志.60,pp.634-645.權利要求1．一種具有下式的吡啶并2,3-二氮雜萘二酮化合物或其藥學上可接受的鹽其中R1和R2選自氫、鹵素和甲氧基，或者R1和R2一起形成亞甲二氧基。2．一種權利要求1的化合物，其中的鹽選自它們的膽堿鹽和4-四甲基銨鹽。3．一種權利要求1的化合物，選自4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，8-氯-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，8-溴-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，8-氟-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，7,8-二氯-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，7-溴-8-氯-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，7-氯-8-溴-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，和上述化合物的藥學上可接受的鹽。4．一種權利要求2的化合物，選自4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽，8-氯-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽，8-溴-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽，8-氟-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽，7,8-二氯-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽，7-溴-8-氯-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽，7-氯-8-溴-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽。5．一種藥物組合物，包括作為活性成分的有效甘氨酸B拮抗量的權利要求1化合物，和藥學上可接受的載體和稀釋劑。6．一種藥物組合物，包括作為活性成分的有效甘氨酸B拮抗量的權利要求1化合物的膽堿鹽，和藥學上可接受的載體和稀釋劑。7．一種藥物組合物，包括作為活性成分的有效甘氨酸B拮抗量的選自下列的化合物4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，8-氯-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，8-溴-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，8-氟-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，7,8-二氯-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，7-溴-8-氯-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，7-氯-8-溴-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，或上述化合物的藥學上可接受的鹽。8．一種藥物組合物，包括作為活性成分的有效甘氨酸B拮抗量的選自下列的化合物4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽，8-氯-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽，8-溴-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽，8-氟-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽，7,8-二氯-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽，7-溴-8-氯-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽，7-氯-8-溴-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽。9．一種治療動物活體中與興奮性神經中毒和谷氨酸能(glutamatergic)神經傳導功能障礙(malfunctioning)有關的神經紊亂的方法，包括對需要治療的動物活體給予有效甘氨酸B拮抗劑量的權利要求1化合物。10．一種治療動物活體與興奮性神經中毒和谷氨酸能(glutamatergic)神經傳導功能障礙(malfunctioning)有關的神經紊亂的方法，包括以其膽堿鹽的形式，對需要治療的動物活體給予有效甘氨酸B拮抗劑量的權利要求1化合物。11．一種治療動物活體與興奮性神經中毒和谷氨酸能(glutamatergic)神經傳導功能障礙(malfunctioning)有關的神經紊亂的方法，包括對需要治療的動物活體給予有效甘氨酸B拮抗劑量的選自下列的化合物4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，8-氯-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，8-溴-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，8-氟-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，7,8-二氯-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，7-溴-8-氯-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，7-氯-8-溴-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物，或上述化合物的藥學上可接受的鹽。12．一種治療動物活體與興奮性神經中毒和谷氨酸能(glutamatergic)神經傳導功能障礙(malfunctioning)有關的神經紊亂的方法，包括對需要治療的動物活體給予有效甘氨酸B拮抗劑量的選自下列的化合物4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽，8-氯-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽，8-溴-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽，8-氟-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽，7,8-二氯-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽，7-溴-8-氯-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽，7-氯-8-溴-4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物的膽堿鹽。13．一種制備4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物(5)的方法，包括將2,3-喹啉二酸二甲酯-1-氧化物(3)與水合肼反應轉化為肼鹽(4)，再將所得肼鹽(4)水解生產所要的4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物(5)。14．權利要求13的制備方法，其中所得的4-羥基-1-氧代-1,2-二氫-噠嗪并[4,5-b]-喹啉-5-氧化物(5)與膽堿氫氧化物反應轉化成為它的膽堿鹽。全文摘要具有式(Ⅰ)的吡啶并2,3－二氮雜萘二酮及其藥學上可接受的鹽,和含有它們的有效甘氨酸文檔編號A61P43/00GK1228778SQ97197534公開日1999年9月15日申請日期1997年7月25日優先權日1996年7月25日發明者W·丹尼斯,M·高德,I·卡威什,C·G·R·帕爾森斯,I·皮斯庫諾瓦,E·羅滋寇夫申請人:莫茨股份公司