專利名稱：高效血管生成抑制劑的設計及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬生物工程制藥技術領域。
血管生成是指從已有的血管衍生、生長出新的血管。血管新生在許多人類重要疾病，如惡性腫瘤、類風濕性關節炎、視網膜和脈絡膜血管新生，以及許多皮膚疾病中起著重要作用。抗血管生成治療，即血管生成抑制療法，是30年前由Judah Folkman博士率先提出的(Folkman，J.N.Engl.J.Med.，285，1182-1186，1971；Folkman，J.Ann.Surg.，175，409-416，1972)。他提出可以通過切斷腫瘤的血液供應，達到消滅腫瘤的目的。在血管生成的過程中，有許多調節因子在發揮作用，如生長因子，細胞外基質分子，細胞膜結合的蛋白質，生長因子受體等。目前正在進行臨床實驗的抗血管生成藥物一血管生成抑制劑，也可因其作用靶分為內皮細胞抑制劑、基質金屬蛋白酶抑制劑、血管生成生長因子拮抗劑等。其中最為著名的為Judah Folkman博士實驗室發現的血管生成抑制劑angiostatin(O′Reilly，M.S.等，Cell 79，315-328，1994)，endostatin(O′Reilly，M.S.等，Cell88，277-285，1997)，人纖溶酶原kringle 5(Cao，Y.H.等，J.Biol.Chem.272，22924-22928，1997)，以及其它實驗室發現的vasostatin，restin，arresten，canstatin，tumstain，prolactin N端16kD片段，troponin I，pigment epithelium derived factor，platelet factor 4等。盡管這些血管生成抑制劑呈現出非常誘人的應用前景，但是其缺陷也非常明顯在小鼠動物模型實驗時，angiostatin的使用劑量高達上百毫克/公斤體重，endostatin的劑量也為幾十毫克/公斤體重，kringle 5的使用劑量也在幾十毫克--上百毫克/公斤體重，據估計當這些血管生成抑制劑在人體使用時，使用劑量將達到至少幾克/人的劑量。這樣大的藥物使用劑量勢必會增加今后該類藥物毒副作用發生的可能性，造成該類藥物質量控制難度加大、生產規模和生產成本增大、而且藥物價格居高。
整聯蛋白(integrin)是由α、β兩個亞基組成的跨膜蛋白異二聚體，它們通過和細胞外基質分子的相互作用控制細胞的遷移、分化和增殖。20多種整聯蛋白中的大多數分子都能識別含RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，Arg-Gly-Asp)或NGR(天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸，Asn-Gly-Arg)等序列的細胞外基質配基。一些整聯蛋白能對血管生成過程起調節作用，針對某些整聯蛋白的抗體也被發現具有抑制血管新生的作用。
血管生成是一個復雜的生理過程，正在新生的血管具有多種分子標記，而非單一的標記，使它們區別于已經生成的血管。因此一個好的抗血管生成的血管生成抑制劑應該具有對新生血管的多種標記分子的選擇性，這樣才能達到對新生血管具有導向性、選擇性作用的效果；對新生血管多個標記分子或靶點同時發生作用，將會從總體上提高藥物對血管生成的抑制作用；而對新生血管多靶點，和導向性、選擇性的作用結果就能導致只要使用較低劑量藥物，就能高效地發揮抗血管生成的作用。迄今為止的抗血管生成藥物，諸如上述的angiostatin、endostatin、kringle 5等都只針對新生血管的單一靶點進行作用的分子，它們對血管的專一性和選擇性尚嫌不夠、對新生血管生成的抑制也只是從一個靶點進行單兵作戰、效果有限，所以結果導致需要如此高的使用劑量。
本發明的目的是研制一種新的高效血管生成抑制劑，即構建一種對整聯蛋白(integrn)具有結合作用的血管生成抑制劑，使現有的血管生成抑制劑具有對整聯蛋白的親和性或結合能力，賦予現有血管生成抑制劑以整聯蛋白的親和性。該種高效血管生成抑制劑能夠顯著提高現有的血管生成抑制劑抑制內皮細胞生長及血管新生的活性和效率，提高血管生成抑制劑對內皮細胞及新生血管的特異性和選擇性，降低現有血管生成抑制劑的使用劑量。
本發明的目的可以通過以下措施來達到構建含有RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)或NGR(天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸)等整聯蛋白結合序列肽段的血管生成抑制劑(如angiostatin、endostatin，kringle 5等) 基因-即高效血管生成抑制劑基因，可以將該高效血管生成抑制劑基因克隆在基因治療載體中，直接用于基因治療；可以利用重組DNA技術進行基因工程表達含RGD或NGR等整聯蛋白結合序列肽段的高效血管生成抑制劑，分離純化重組高效血管生成抑制劑蛋白質；或用多肽合成方法合成含有RGD或NGR等整聯蛋白結合序列的肽段，然后用化學偶聯的方法將含有RGD或NGR等序列的肽段連接到天然來源的或重組DNA來源的血管生成抑制劑上，構成能夠和整聯蛋白具有結合作用的血管生成抑制劑，即本發明所述的高效血管生成抑制劑。和整聯蛋白具有結合作用的，含有RGD或NGR等序列的肽段可以融合在血管生成抑制劑的N端或C端，或同時融合在血管生成抑制劑的N端和C端 A肽、B肽分別是長度為3至90個氨基酸殘基的、含有RGD或NGR等整聯蛋白結合序列的多肽片段，A肽、B肽分別具有和整聯蛋白結合的能力。本發明所述的高效血管生成抑制劑可顯著提高現有的血管生成抑制劑抑制內皮細胞增殖和血管生成的生物活性，能夠作為治療疾病的藥物，更有效地治療人或動物的、和血管新生相關的疾病，如惡性腫瘤、類風濕性關節炎、視網膜和脈絡膜血管新生，以及相關的皮膚疾病等，或者作用診斷用的藥物，對人或動物的、和血管新生相關的疾病進行定位和診斷。本發明所述的高效血管生成抑制劑的基因工程生產或多肽合成及化學偶聯方法傳統，常規，簡單，易行，產量高，對研制生產高效血管生成抑制劑具有重要的指導意義和實用價值。
實施例11.合成編碼含有RGD或NGR等整聯蛋白結合序列的多肽片段的PCR引物，按血管生成抑制劑基因5’或3’基因序列設計PCR引物，通過PCR反應擴增獲得含有RGD或NGR等整聯蛋白結合序列肽段的血管生成抑制劑基因。如合成引物15’CGGGATCGATGACGACGACAAGGCATGCGACTGCCGTG 3’，引物25’GACTGCCGTGGTGACTGCTTCTGCGGTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGAC 3’，引物35’GCGAATTCTAGGCTGCACACTGAGGGAC 3’。其中，引物1編碼了BamHI位點和腸激酶識別位點序列，引物2中GACTGCCGTGGTGACTGCTTCTGCGGT編碼了含有RGD序列的肽段，GTCCTGCTTCCAGATGTAGAGAC編碼人纖溶酶原第449-456位氨基酸，即環柄結構域5(kringle 5)的N端；引物3編碼人纖溶酶原第538-543位氨基酸。
以人纖溶酶原基因cDNA為模板，以引物2和3為引物，進行PCR擴增反應，再以引物1和3為引物，以第一次的PCR產物為模板，進行PCR擴增反應，獲得含有RGD序列的環柄結構域5基因，即本發明所述的高效血管生成抑制劑的一個分子--高效血管生成抑制劑分子1RGD-Kringle 5(含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列肽段的人纖溶酶原環柄結構域5)。該高效血管生成抑制劑分子1RGD-Kringle 5的氨基酸序列為ACDCRGDCFCGVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAA2.為了便于比較本發明所設計的高效血管生成抑制劑分子1--RGD-Kringle5的實際效果和優越之處，本實例中我們同時克隆、表達了不含有RGD序列的環柄結構域5，以作為對照和比較。
分別合成編碼人纖溶酶原環柄結構域5N端和C端的引物，引物45’CGGGATCGATGACGACGACAAGGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGAC3’，引物4編碼人纖溶酶原第449-456位氨基酸，即環柄結構域5的N端，其5’端有腸激酶識別位點序列編碼序列。以人纖溶酶原基因cDNA為模板，以引物4和3為引物，進行PCR擴增反應，獲得環柄結構域5基因。
3.將從1、2中.獲得的基因分別經限制性內切酶消解，克隆在各種基因工程表達載體中，如將從1.中獲得的PCR產物經BamHI、EcoRI酶切，克隆在大腸桿菌GST融合表達載體pALEX中，首先進行DNA序列分析，驗證PCR產物DNA序列的正確性，然后將重組表達菌分別經0.5mM IPTG誘導表達2小時后，進行SDS-PAGE分析表達水平。
4.對3中的表達菌分別進行超聲破碎，分別將超聲上清進行Glutathione-Agarose親和層析，收集洗脫峰，一步親和層析純化即可得到較純的GST融合蛋白。對于獲得的GST-kringle 5和GST-RGD-kringle 5融合蛋白，用腸激酶對融合蛋白進行切割(酶∶底物＝1∶1000～4000)，兩種融合蛋白經37℃酶切10小時后幾乎均可被切割完全。
GST-Kringle 5和GST-RGD-Kringle 5融合蛋白酶切產物分別再次進行Glutathione-Agarose親和層析，收集穿過峰。獲得的Kringle 5和高效血管生成抑制劑實例之一RGD-Kringle 5經SDS-PAGE電泳和C18反相HPLC驗證純度。
5.為了比較Kringle 5和高效血管生成抑制劑實例之一RGD-Kringle 5的生物活性的差異，我們進行了內皮細胞增殖抑制活性測定。在添加10％小牛血清、抗生素及3ng/ml的人重組bFGF(來源于暨南大學生物工程研究所)的DMEM培養基中培養ECV304細胞(人內皮細胞株)。實驗在24孔細胞培養板中進行，樣品的濃度范圍為20nM～1280nM，每個濃度作3個重復，以磷酸緩沖液為空白對照，37℃，5％CO2，培養48小時，用胰酶消化細胞，血球計數板計數，比較樣品及空白孔中的活細胞個數，以此計算出不同濃度Kringle 5和高效血管生成抑制劑實例之一RGD-Kringle 5對ECV304細胞生長的抑制率。
結果顯示重組Kringle 5在320nM時，對ECV304細胞生長的抑制率為31％，1280nM時，抑制率為55％；而作為本發明所設計的高效血管生成抑制劑實例之一的RGD-Kringle 5在320nM時，對ECV304細胞生長的抑制率為58％，1280nM時，抑制率為100％。
從實例1中，我們可以看到在體外內皮細胞生長抑制實驗中，本發明所設計的高效血管生成抑制劑實例之一的RGD-Kringle 5對人內皮細胞株ECV304細胞生長的抑制活性至少是Kringle 5的4倍，其ED50僅為Kringle 5 ED50的四分之一。本發明所設計的高效血管生成抑制劑確實顯著提高了現有的血管生成抑制劑Kringle 5的生物活性。
實施例2Angiostatin是美國哈佛大學Folkman博士實驗室發現的第一個成功的血管生成抑制因子。Angiostatin含有四個kringle分子，kringle 1-4，其中kringle 1的對angiostatin血管內皮細胞抑制活性貢獻最大，單獨的kringle 1血管內皮細胞抑制活性占angiostatin血管內皮細胞抑制活性的50％以上。為了進一步驗證本發明所設計的高效血管生成抑制劑的實際效果和優越之處，本實例2中我們同時克隆、表達了含有RGD序列的環柄結構環柄結構域1(kringle 1)，在實驗模型動物體內對它們抗血管生成的生物活性進行了比較。
1.合成編碼含有RGD或NGR等序列的多肽片段的PCR引物，按血管生成抑制劑基因5’或3’基因序列設計PCR引物，通過PCR反應擴增獲得含有RGD或NGR等整聯蛋白結合序列肽段的血管生成抑制劑基因。合成引物15’CGGGATCCATGCCATGGCATGCGACTGCCGTG 3’；引物25’GACTGCCGTGGTGACTGCTTCTGCGGTGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGG 3’；引物35’GCGAATTCTAAGCACACTCAAGAATGTCGCAGTAGTC 3’；引物45’CGGGATCCATGCCATGGTGTATCTCTCAGAGTGCAAG 3’。其中，引物1編碼了BamH I和Nco I限制性內切酶識別位點，和起始密碼子ATG；引物2中GACTGCCGTGGTGACTGCTTCTGCGGT編碼了含有RGD序列的肽段，GTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGG編碼人纖溶酶原第80-88位氨基酸，即環柄結構域1(kringle 1)的N端8個氨基酸；引物3編碼人纖溶酶原第157-164位氨基酸，即環柄結構域1(kringle 1)的C端9個氨基酸，和終止密碼子，以及一個EcoRI限制性內切酶識別位點；引物4只含有BamH I和Nco I限制性內切酶識別位點，起始密碼子ATG和一段編碼人纖溶酶原第80-88位氨基酸的序列。
以人纖溶酶原基因cDNA為模板，以引物2和3為引物，進行PCR擴增反應，再以引物1和3為引物，以第一次的PCR產物為模板，進行PCR擴增反應，獲得含有RGD序列的環柄結構域1基因，即本發明所述的高效血管生成抑制劑的一個分子—高效血管生成抑制劑分子2RGD-Kringle 1(含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列肽段的人纖溶酶原環柄結構域1)。該高效血管生成抑制劑分子2RGD-Kringle 1的氨基酸序列為ACDCRGDCFCGVYLSECKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECA；同時以人纖溶酶原基因cDNA為模板，以引物4和3為引物，進行PCR擴增反應，獲得不含有RGD序列的環柄結構域1基因。
2.將從1、2中.獲得的基因分別經限制性內切酶消解，克隆在各種基因工程表達載體中，如將從1.中獲得的PCR產物分別經Nco I、EcoR I酶切，克隆在大腸桿菌非融合表達載體pNJUTRX-1中，首先進行DNA序列分析，驗證PCR產物DNA序列的正確性，然后將重組表達菌分別經0.5mM IPTG誘導表達2小時后，進行SDS-PAGE分析表達水平。
對表達菌分別進行超聲破碎，分別將超聲上清進行Lysine Sepharose 4B親和層析，用緩沖液(0.5M NaCl，0.5M arginine，20mM Tris-HCl，pH 7.4)進行洗脫，收集洗脫峰，進行透析后，一步親和層析純化獲到較純的Kringle 1和RGD-Kringle 1重組蛋白質。獲得的Kringle 1和高效血管生成抑制劑實例之二RGD-Kringle 1經SDS-PAGE電泳和C18反相HPLC驗證純度，并用牛內皮細胞株BCE細胞進行內皮細胞生長抑制活性實驗，確定重組產物的的生物活性。
5.在接種膀胱移行細胞癌的腫瘤小鼠動物模型上，接種癌細胞懸液后第五天，進行Kringle 1和RGD-Kringle 1抗腫瘤生物活性實驗，重組Kringle 1和RGD-Kringle 1的用量皆為20mg/kg體重/天，腹腔注射，每日一次，以腹腔注射0.1ml生理鹽水組的小鼠為對照，連續給藥15天后，測定小鼠腫瘤的大小和重量，計算抑瘤率(腫瘤抑制效率)，抑瘤率＝(1-給藥組小鼠平均腫瘤重量/生理鹽水對照組小鼠平均腫瘤重量)×100％。結果顯示在20mg/kg體重/天的劑量下，Kringle 1的抑瘤率為8％，而本發明的高效血管生成抑制劑實例之二RGD-Kringle 1的抑瘤率為68％，與Kringle 1相比較，RGD-Kringle 1的抑瘤率提高了8倍。
從實例1和2中，我們可以明顯看到本發明與現有技術相比較具有明顯的優點和創新。本發明所設計的具有整聯蛋白的親和性和結合能力的高效血管生成抑制劑確實在體內外實驗中都能大幅度地改善和提高現有血管生成抑制劑抑制內皮細胞生長和血管新生的活性和效率，具有很好的、作為治療血管新生相關疾病(如腫瘤)藥物的前景。實例1和2有力證明了本發明設計的高效血管生成抑制劑科學、合理、可行和有效。
權利要求
1.一種高效血管生成抑制劑，其特征在于該高效血管生成抑制劑是具有整聯蛋白的親和性和結合能力的血管生成抑制劑。
2.根據權利要求1.所述的高效血管生成抑制劑，其特征在于在血管生成抑制劑分子的一端或兩端分別連接有對整聯蛋白具有親和性和結合能力的肽段。
3.根據權利要求1和2.所述的高效血管生成抑制劑，其特征在于在血管生成抑制劑分子的一端或兩端分別連接的、對整聯蛋白具有親和性和結合能力的肽段可以是含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的段肽，或者是含有天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸序列的段肽，也可以是同時含有上述兩種序列的肽段。
4.根據權利要求3所述的高效血管生成抑制劑，其特征在于人纖溶酶原環柄結構域1蛋白質上連接有含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的段肽。
5.根據權利要求3所述的高效血管生成抑制劑，其特征在于人纖溶酶原環柄結構域5蛋白質上連接有含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的段肽。
6.一種高效血管生成抑制劑的應用，其特征在于該種高效血管生成抑制劑能夠顯著提高現有的血管生成抑制劑抑制內皮細胞生長和血管新生的活性和效率，降低現有血管生成抑制劑的使用劑量；該種高效血管生成抑制劑能夠作為治療疾病或者診斷用的藥物，治療人或動物的、和血管新生相關的疾病。
7.根據權利要求4和5所述的高效血管生成抑制劑的應用，其特征在于該種血管生成抑制劑能夠有效抑制內皮細胞生長，能夠作為治療疾病或者診斷用的藥物，更有效地治療人或動物的、和血管新生相關的疾病。
8.高效血管生成抑制劑的生產方法，其特征在于構建含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸或天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸等整聯蛋白結合序列肽段的血管生成抑制劑基因，將該基因用于基因治療；或進行基因工程表達，分離純化重組蛋白質；或用多肽合成方法合成含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸或天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸等整聯蛋白結合序列的肽段，然后用化學偶聯的方法將含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸或天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸等整聯蛋白結合序列的肽段連接到天然來源的或重組DNA來源的血管生成抑制劑上，構成能夠和整聯蛋白具有結合作用的高效血管生成抑制劑。
9.根據權利要求8所述的高效血管生成抑制劑的生產方法，其特征在于，獲得編碼含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列肽段的人纖溶酶原環柄結構域1基因，用于基因治療；或者進行基因工程表達，分離、加工、純化、制備獲得含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列肽段的人纖溶酶原環柄結構域1。
10.根據權利要求8所述的高效血管生成抑制劑的生產方法，其特征在于，獲得編碼含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列肽段的人纖溶酶原環柄結構域5基因，用于基因治療；或者進行基因工程表達，分離、加工、純化、制備獲得含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列肽段的人纖溶酶原環柄結構域5。
全文摘要
本發明涉及高效血管生成抑制劑及其生產方法與應用。本發明特點是1、本發明提出了具有整聯蛋白的親和性和結合能力的高效血管生成抑制劑，并給出了該高效血管生成抑制劑的一般結構形式，以及含有精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸肽段－人纖溶酶原環柄結構域1和含有精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸肽段－人纖溶酶原環柄結構域5的具體結構形式。2、本發明給出了高效血管生成抑制劑的一般生產方法，以及含有精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸肽段－人纖溶酶原環柄結構域1和含有精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸肽段－人纖溶酶原環柄結構域5的具體生產方法。3、本發明指明了高效血管生成抑制劑在顯著提高現有的血管生成抑制劑抑制內皮細胞生長和血管新生的活性和效率，降低現有血管生成抑制劑的使用劑量方面的應用前景。
文檔編號A61P43/00GK1478541SQ02138188
公開日2004年3月3日 申請日期2002年8月30日 優先權日2002年8月30日
發明者華子春 申請人:華子春