專利名稱：一種當歸苦參提取工藝的制作方法
技術領域：
本發明屬于中藥領域，具體涉及一種當歸苦參復方提取工藝。
背景技術：
痤瘡、濕疹為臨床常見皮膚病，影響著患者的生活質量和美觀。西醫治療痤瘡、濕 疹等皮膚病多用激素、抗生素或其它的一些消炎抑菌藥，易產生過敏，肝、腎損傷，色素沉 著，停藥后反彈等副作用(參見王海生等主編，臨床新藥手冊[M]，天津天津科技出版社， 2000年9月，第1版1，434.)；而當歸苦參丸是我國第一批非處方中成藥，其作用緩和，毒 副作用小，價格低廉，無需聯合用藥，是治療這些皮膚病較理想的復方。當歸苦參丸來源于《古今醫鑒》參歸丸，原書記載“參歸丸，治酒糟鼻，乃血熱入 肺”。近代醫家在辨證基礎上，將其廣泛用于治療血燥濕熱所致的頭面瘡瘍，粉刺疙瘩以及 濕疹等疾病。但當歸苦參丸多以藥材原粉入藥制成大蜜丸，不但服用不便，劑量大，雜質多， 易霉變，而且揮發性成分易損失，質量難以控制，大大限制了其臨床應用。目前，對當歸苦參 丸方藥成分提取和劑型改革方面的研究報道很少，為此，需要開發新方法對其進行提取研 允。當歸苦參方中選苦參為君，該藥味苦性寒，具有清熱燥濕，祛風殺蟲之功。然苦參 屬苦燥傷陰之品，血虛生燥易加重瘙癢，故佐以當歸，該藥味甘辛苦，性溫能養血潤燥，與苦 參相伍，既可防苦參性寒助濕之弊，又可用其辛散活血、補血之功，阻遏濕邪重濁粘滯之性， 使之能寒溫并施，寒不助濕，溫不增燥，燥濕無妨補血，補血無礙燥濕，血活濕不得留滯，共 奏清熱活血，祛風燥濕，殺蟲止癢之功。有實驗研究表明具有此類作用的復方有較強的抑 制小鼠變態性接觸性皮炎的作用(參見涂彩霞等，四種中藥復方對小鼠實驗性皮炎作用的 研究[J]，中華皮膚科雜志，1998，31 (4) 244.)。現代藥理研究表明苦參堿具有明顯的抑制金黃色葡萄球菌、皮膚致病性真菌及 變態反應的作用(參見樊宏偉等，苦參堿類生物堿的體外抑菌、抑病毒及誘生干擾素的實 驗研究[J]，中醫藥信息，2000，17 (4) 75 ；吳玲清等，氧化苦參堿對小鼠腹腔肥大細胞組胺 釋放的抑制作用及其機制的研究[J]，中華微生物和免疫學雜志，1992，12(1) 41 ；樓之岑 等，常用中藥材品種整理和質量研究[M]，北京北京醫科大學中國協和醫科大學聯合出版 社，1995 343.)，裴仁九等人研究證明苦參堿對網狀內皮系統吞噬功能、遲發性超敏反應、 血清溶血素的生成均有抑制作用(參見裴仁九等，苦參堿對小鼠免疫功能的影響[J]，海峽 藥學，1998，10 (2) :7.)。苦參總生物堿對金黃色葡萄球菌也有抑制作用(參見陳婷婷等， 苦參總堿有效成分對柯薩基B3m病毒感染的Hele細胞的保護作用[J]，中國實驗臨床免 疫學雜志，1997，9(1) :18.)。苦參抑制變態反應的機制與氨茶堿相同，即苦參中的苦參總 堿能抑制環核苷酸磷酸二酯酶，提高體內環磷腺苷，阻止肥大細胞脫顆粒釋放組胺(參見 殷金珠等，苦參治療I型變態反應性疾病的機理研究[J]，北京醫科大學學報，1993，25 (2) 84 ；秦萬章主編，現代中醫藥應用與研究大全·皮膚科[M]，上海上海中醫藥大學出版社， 1994 :128.)。當歸含有阿魏酸、多糖、17種氨基酸及微量金屬元素等成分，具有提高機體細
3胞免疫、體液免疫功能(參見韓克慧，中藥免疫實驗研究和臨床應用[M]，北京學術期刊 出版社，1999.)及類雌激素樣作用(參見寇俊萍等，當歸芍藥散對多種記憶損傷動物模型 的影響[J]，中成藥，2002，24 (3) 191.)的作用。當歸中的阿魏酸具有抗氧化作用，通過對 自由基的消除，阻斷了自由基的反應而發揮抗損傷、提高免疫系統功能，同時還有抗菌消炎 等作用(參見歐仕益等，阿魏酸及其衍生物的藥理作用研究進展[J]，中藥材，2001，24(3) 220.)。當歸主要含揮發性和水溶性成分兩大部分，阿魏酸是水溶性成分中主要有效成分之一。中藥制劑與西藥制劑最大的差別是制劑的原料，因此中藥制劑的基礎研究，除與 西藥制劑一樣，包括制劑成型理論和技術、質量控制、合理應用等內容，還包括對中藥或方 劑藥效物質的提取、精制、濃縮、干燥等內容，其中關鍵問題是“提取”。用何種思路和方法 將中藥或方劑的藥效物質最大限度地提取出來，以保持中藥或方劑特有的療效值得深思， 是提取方法研究的核心；同時又是減小劑量、創新劑型、提高臨床療效的基本前提。目前， 多數中藥制劑的制備仍局限于傳統的水提醇沉，或僅以提取單體成分為目的的有機溶劑提 取，前者在某些方面是合理的，但若把此種方法視為中藥提取的“通則”就絕對化了，會阻礙 復方中藥提取工藝的發展。后者則忽視了藥物間各成分的協同作用，不能體現復方的整體 作用，更不符合中醫臨床用藥的綜合作用特點。如何在中醫藥理論指導下，充分利用先進的 工藝技術，以盡可能的保留原方的活性物質，提高藥效，是目前中醫藥界面臨的重大問題之
ο必須指出，中醫用藥絕不是單體成分，而是多種成分相互作用的綜合結果，這種綜 合效能從化學成分上考慮，可能是一種中藥共存成分之間或(和)多種中藥成分之間的復 合作用；從藥劑學的角度考慮，可能是藥材(飲片)提取過程中生成新的化合物；從藥物代 謝過程考慮，可能是體內發揮藥效過程中的復合作用。藥物化學結構唯一決定藥效的觀點 已被打破；中藥成分“無效”與“有效”的舊有界限也逐步被打破，某些過去認為是無效的成 分，現在發現它有新的生物活性，如人參、黃芪、枸杞子、豬苓等具補益作用的中藥中所含的 多糖類成分，在增強人體免疫機能、抗癌等方面顯示出較強的生物活性；天花粉蛋白質可用 于中期妊娠引產；金龍膽草中含有的樹脂具鎮咳平喘功能；鞣質在注射劑中應作為雜質去 除，而在五倍子中是具收斂作用的成分。因此只以復方中某單體化學成分的動物體外實驗 為指標研究中藥提取工藝和制定質量標準，有很大的局限性。“化學等值不一定生物等效”。 體內藥效的發揮不僅包括原型藥物，更包括其代謝產物。多數藥物代謝后活性減弱或喪失， 但也有的藥物代謝物活性增強，還有的沒有生物活性的藥物經代謝后產生活性物。將復方 體外與體內藥效物質的化學研究緊密結合起來進行提取工藝和質量控制研究應該說是一 種創新型研究，也是時代發展的必然。固體發酵技術(Solid-State-Fermentation Technology)是生物技術的一種，是 指某些生長需水很少的微生物利用疏松而含有必需營養物的固體培養基進行的發酵。真菌 是固體發酵最普遍被使用的微生物，因其菌絲如同植物的根能在固態表面生長，并滲透到 基質內，產生多樣的胞外酵素能力，故比其他單細胞的細菌及酵母菌更適合固體發酵的環鏡。目前，發酵技術應用于中藥的研究主要是液體發酵技術。固體發酵技術應用中藥 復方的研究還沒有。

發明內容
本發明針對目前當歸苦參丸多以藥材原粉入藥制成大蜜丸，不但服用不便，劑量 大，雜質多，易霉變，而且揮發性成分易損失，質量難以控制，并且目前，對當歸苦參丸方藥 成分提取和劑型改革方面的研究報道很少等問題，發明人從中藥復方中各種成分的層次 性、聯系性，復方的整體作用角度出發，根據中藥復方的作用特點是多成分、多途徑、多環節 和多靶點，意在提供一種當歸苦參新的提取工藝，通過采用固體發酵技術預處理當歸和苦 參后，再結合傳統的水煎提取工藝對發酵產物處理，以得到抗炎作用效果更強的提取液產 物。為實現本發明的目的，發明人提供如下的技術方案一種當歸苦參提取工藝，包括下述步驟(1)固體發酵處理將原料按重量份當歸和苦參400-600份、麥麩0-20份，氧化鈣1_6份及水20_40份 稱取并混勻，混合物經滅菌處理后接種雞腿菇，然后于溫度25-29°C下發酵培養25-31天，(2)水提取處理步驟⑴得到的發酵產物加入其重量6-10倍的水，煎提處理得到提取液。本發明固體發酵處理中，當歸和苦參為底物，麥麩的作用是提供碳源、氮源，氧化 鈣為無機鹽，其主要作用為調節PH值。無機鹽類是微生物生命活動所不可缺少的物質。主 要功用是①構成菌體成分；②作為酶活性基的組成部分或維持酶的活性；③調節滲透壓、 PH值、氧化還原電位等；④作為自養菌的能源。水為溶劑，其作用為潤濕藥材。影響固體發 酵的因素較多，如C/N、底物濃度、溫度、時間等。根據發明人的研究發現，對于本發明來說， 碳源和氮源以及C/N對該復方發酵的結果影響不明顯，其發酵結果基本與單獨用當歸、苦 參最為底物的結果相同。故發明人對不同組合發酵菌種用正交設計安排一系列發酵實驗， 探索時間、溫度、接種量等因子的實驗室最佳水平，以選擇最佳菌種使本發明的藥材發酵。雞腿菇，學名毛頭鬼傘，別名雞腿蘑、刺蘑菇，拉丁名=Copyinds Comatus(MUILFr)Gray。發明人為了篩選出適合本發明當歸苦參用的真菌菌種，做了大量 研究。下面就以雞腿菇、靈芝及雞腿菇靈芝混合物為例，說明本發明選用雞腿菇作為發酵菌 種的原因。取200g當歸(過20目篩)、200g苦參(過20目篩)，麥麩IOg及氧化鈣2g，攪 拌均勻，加入20ml的水(至藥材濕潤)，充分攪勻后的藥料裝入發酵培養袋，密封。將發酵 培養袋放入高壓蒸汽滅菌鍋內滅菌，使滅菌壓力升至0. IMPa，保持壓力在0. 1-0. 15MPa之 間，時間1. 5h。放涼后取出培養袋。分別選用雞腿菇、靈芝、雞腿菇靈芝進行接種，接種量為 2g(0. 5% )。如取雞腿菇母種試管，接種針在試管口放涼片刻，然后將母種表面老化的菌種 部分除去，取一部分放入貼標簽的培養袋中，迅速密封放好。同樣的操作接種靈芝組、雞腿 菇靈芝組。然后將3組放入20°C恒溫箱中培養30天。30天后的3組菌種發酵情況是，雞 腿菇組與靈芝單種組、比雞腿菇加靈芝合種組相比，其菌絲生長情況最好。雞腿菇菌種在當 歸、苦參中發酵良好，菌絲覆蓋全部藥材，而靈芝菌種在當歸、苦參上面基本沒有菌絲生長， 靈芝與雞腿菇共同發酵組，其菌絲生長情況介于二者之間，故本發明選用雞腿菇做當歸苦 參固體發酵的菌種。3組菌種發酵結果圖片(參見附圖la、圖Ib和圖lc)，附圖Ia是雞腿
5菇組菌種發酵圖片，可以看出，菌絲覆蓋全部藥材；附圖Ib是靈芝組菌種發酵圖片，可以看 出，菌絲沒有生長；附圖Ic是雞腿菇靈芝組菌種發酵圖片，菌絲部分生長。雞腿菇菌種在當歸苦參方藥中發酵良好，其機制可能是雞腿菇更適合于當歸苦參 藥材的發酵條件，靈芝則相反。而當它們共同發酵的時候，發酵結果介于兩者之間，這可能 是兩種真菌相互競爭抑制的結果。進一步發明人在優選出雞腿菇作為最佳菌種的基礎上，以固體發酵菌絲體質量為 指標，考察了藥材量(當歸苦參按重量1 1比例配比)、生長溫度、發酵時間及培養基添加 麥麩量4個因素，以L9 (34)正交表設計實驗，作多因素正交試驗優選固體發酵條件，因素水 平見表1，正交試驗結果見表2。表1正交試驗優選固體發酵條件 表2正交試驗結果 注=A 藥材量(g) ；B 溫度(°C ) ；C 發酵時間(d) ；D 麩皮量(g) ；Y 菌絲體重量 (g)。表3發酵條件方差分析表由各因素的離均差平方和計算可知SSA = 9X 10_6SSd = 0. 0003. 22。以上SSA、SSd很小，這表明該因素對試驗結果沒有影響或影響甚微，可以認為該列 的離均差平方和主要是試驗誤差引起的。為了提高分析精度，常把它們合并在誤差離均差 平方和中一起作為試驗誤差。注*(F0.05(2，4) =6.94)有顯著意義，# (F0. 01 (2，4)= 18. 00)有極顯著意義。 注*(F0.05(2，4) = 6. 94)有顯著意義，#(F0. 01 (2，4) = 18. 00)有極顯著意義。分析表明因素B對試驗結果有非常極顯著的影響，C對試驗結果也有顯著影響， 而A和D的影響不顯著。結論正交試驗方差分析原則只選取有顯著意義因素的最高水平和交互作用的最優搭 配，確定出最佳方案，不顯著的因素，原則上可以根據實際條件(如節約、省時等)酌情確定 一個水平。由以上原則B可取B2, C可取C3，A從節約藥材的角度可選A1, D從實際經驗的角 度考慮可選D2。綜合上訴分析，得到最佳方案為A1B2C3D2，藥材量為400g，溫度27°C，發酵時 間31d，麩皮量10g。按照優選出工藝進行了驗證性實驗，結果菌絲體重量為0. 162g。中藥復方用固體發酵技術提取的主要理論依據有以下幾點(1)微生物及其代謝過程中產生豐富的酶類，能降解大量中藥植物纖維素，降低淀 粉等高分子對中藥成分的包裹作用，利于有效成分溶出。微生物在代謝過程中可產生成百 上千的胞內酶，并且可以分泌幾十種胞外酶到培養基中去，這些酶可水解植物細胞壁的纖 維素、半纖維素、果膠質等，使細胞破裂，細胞間隙增加，減小細胞壁、細胞間質等傳質屏障 對有效成分從胞內向提取介質擴散的傳質阻力，利于有效成分溶出(參見Yang X et al, Bioconversion of corn straw by coupling ensiling and solid-state fermentation,Bioresour Technol，2001 Jul，78 (3) =277-280) 0而且淀粉等大分子物質可以作為微生物 生長代謝所需的氮源和碳源，被微生物消耗、代謝、降解、吸收，促進有效成分的釋放(參見 Sati SC et al,Utilization of various carbon sources for the growth ofwaterborne conidial fungi，Mycologia，2006S印-Oct，98(5) :678681)。(2)用固體發酵技術提取中藥可以使某些在體內不能直接被利用的藥物有效活 性組分，在體外消解得以完成而被直接利用，并能除去大分子雜質，迅速發揮應有效能。如 中藥大多含有苷類化合物，所含苷類多數為藥物前體，發揮藥效的主體物質一般都是苷元， 其含糖部分被切掉后進入血液循環，才能更好的發揮藥理作用。藥物發酵后，苷元連接的 糖基會在體外被眾多微生物及其代謝產生的酶所利用而被消解掉，只剩下目標物質苷元， 即利用代謝酶的作用使促進苷鍵的斷裂從而使提取率得到提高(參見Fujita R et al, Anti-androgenic activities of Ganoderma lucidum. J Ethnopharmaco1,2005 Oct 31, 102(1) 107-112)。(3)用固體發酵技術提取方藥時選擇具有協同作用的藥用真菌，其本身就具有補 充或增強方劑中藥物的功能，能增強中藥復方的臨床療效，這充分體現出中藥方劑的配伍 思想與理論。有益微生物還能利用中藥中的成分促進自身的增殖，這比單一使用活菌制劑 或向提取液中加酶，或將二者簡單的結合在一起使用，可能會取得明顯的增效作用。作為優選，根據本發明所述的當歸苦參提取工藝，其中，所述的步驟(1)中的 當歸和苦參按重量比1 1配料。中藥原料配比，參考中藥部頒標準21冊當歸苦參丸 (WS3-B-0537-91)。作為優選，根據本發明所述的當歸苦參提取工藝，其中，所述的步驟(1)中的當歸 和苦參的粒度要求為粉碎成20目粗粉。藥材粉碎20目的要求是本領域一般提取均用粗粉 的規格。作為優選，根據本發明所述的當歸苦參提取工藝，其中，所述的步驟(1)中的雞腿 菇的接種量為0. 5-1. Owt%，以當歸和苦參重量計。固體發酵接種量一般不會過大，過小會 延長培養時間，降低發酵罐的生產率；過大會引起溶氧不足，影響產物合成，而且會過多移 入代謝廢物，也不經濟。作為優選，根據本發明所述的當歸苦參提取工藝，其中，所述的步驟(1)中的滅菌 處理為壓力0. 1-0. 15MPa、時間1_2小時。對于本領域來說，結合常用經驗值和本發明的 研究探索，滅菌處理的工藝條件控制在這些合理范圍內就能夠徹底滅菌。作為優選，根據本發明所述的當歸苦參提取工藝，其中，所述的步驟(2)中的煎提 處理做3次以上，煎煮時間共需3個小時以上。更有選的是，煎提處理做3次，一共煎煮3 個小時，這一工藝條件的探索研究可參見發明人此前的一篇文獻報道，即(王英姿等，均勻 設計優選當歸苦參丸方藥的半仿生提取工藝條件[J]，中草藥，2005，36 (2) :212-214.)。作為優選，根據本發明所述的當歸苦參提取工藝，其中，所述的步驟(2)中的煎 提處理的溫度為90-100°C。預實驗表明，對于本發明來說，水煎提取藥材，其溫度控制在 90-100°C，其提取效果并無顯著性差異。根據本發明選用藥材的特點，將阿魏酸、苦參堿、苦參總堿、干浸膏得率、HPLC總面 積和分子量< 1000的提取物得率作為指標成分，測定指標成分含量即可得知本發明產物 的提取效果。多指標綜合評判提取方法的結果，更為合理、全面和科學，也更能體現中醫復
8方治病多成分綜合作用的特點。其中，將分子量< 1000的提取物得率作為指標成分的原因 (參見孫秀梅等，用均勻設計優選香附SFE-CO2萃取后藥渣的半仿生法工藝條件[J]，中國 中藥雜志，2009，34 (22) 2880-2883.)，該文獻指出，天然藥物和中藥中，已知單體化合物絕 大多數分子量< 1000。與現有技術相比，本發明具有以下優點本發明是利用生物技術提出的一種新型提取方法，既保留中藥作為多組分，多靶 點協同作用制劑的物質基礎，又滿足開發新型現代制劑的要求。與液體發酵相比，固體發酵培養基單純，前處理簡單，發酵條件易于操作，適合絲 狀真菌生長，可以多菌種同時放在一起發酵。其發酵產品性能較好，工業化生產時環境污染 比較小，且利于生物循環等。與現有當歸苦參水提取相比，本發明產品的抗炎作用更強，并且安全無毒。通常中藥提取是以粗提物為最終產物，而本研究最終產物是分離制得“分子量 ^ IOOODa的提取物”。分子量< IOOODa的提取物既能體現中藥整體、綜合、客觀、模糊的特 點，又可縮小服用劑量，為選用軟膠囊、滴丸等現代藥物劑型提供了可能，同時提高了技術 含量。因此，本發明是中藥藥效物質提取研究設計的一種新思路。


圖1是本發明菌種發酵照片，圖Ia是雞腿菇菌種發酵照片，可見菌絲覆蓋全部藥 材；圖Ib是靈芝菌種發酵照片，可見菌絲沒有生長；圖Ic是雞腿菇與靈芝混合發酵照片， 可見菌絲部分生長。圖2是本發明生理鹽水對照組、實施例1提取液組、比較例1提取液組和陽性對照 組對兔耳實驗性角化模型的影響的光鏡檢查圖片(HE染色X40)，圖2A 生理鹽水組，病變 無明顯改善，表皮層仍增厚，毛囊有大量角化物；圖2B 維胺脂膠囊陽性藥組，表皮層變薄， 毛囊角化物少且疏松或無角化物；圖2C 實施例1發酵藥材提取液組，表皮變薄，毛囊無角 化物；圖2D 比較例1未發酵藥材水提取液組，表皮層也變薄，毛囊有中等量角化物且較疏 松。
具體實施例方式下面結合實施例，更具體地說明本發明的內容。應當理解，本發明的實施并不局 限于下面的實施例，對本發明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發明保護范圍。在本發明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設備和原料等均 可從市場購得或是本行業常用的。主要原料和設備的說明當歸和苦參購自北京同仁堂藥店，經閆玉凝教授鑒定，當歸為傘形科植物當 歸AngelicasinensiS(01iV.)DielS的干燥根經加工制成的飲片，苦參為豆科植物苦參 Sophoraflavescena Ait.的干燥根經加工制成的飲片，均符合《中國藥典》2005年版(一 部)該藥材項下的有關規定。雞腿菇菌種購自山東省農科院。阿魏酸、苦參堿對照品(中 國藥品生物制品檢定所，批號依次為110773200611，110805200507，供含量測定用)。
精密pH計(pHS-3C型，上海雷磁儀器廠)；高效液相色譜儀(HP1100系列，美國 Agilent公司)，電子天平(YP601N型，上海精密科學儀器有限公司)，離心沉淀機(LXJ-II 型，上海醫療器械三廠)，超聲波清洗器(KQ-100B型，昆山市超聲儀器有限公司)。實施例1取200g當歸(過20目篩)、200g苦參(過20目篩)，麥麩IOg及氧化鈣2g，攪拌 均勻，加入20g(即20ml)的水潤濕藥材，充分攪勻后的藥材裝入發酵培養袋，密封。將發酵 培養袋放入高壓蒸汽滅菌鍋內滅菌，使滅菌壓力升至0. IMPa，保持壓力在0. 1-0. 15MPa之 間，時間1.5h。放涼后取出培養袋。接種雞腿菇，接種量為0.5wt% 取雞腿菇母種試管， 接種針在試管口放涼片刻，然后將母種表面老化的菌種部分除去，取一部分放入貼標簽的 培養袋中，迅速密封放好。然后將培養袋放入27°C恒溫箱中培養31天。將固體發酵以后 的藥材用“雙提法”在常壓下90-92°C加熱回流提取3次，加水量分別為藥材重量的10倍、 6倍、6倍，提取時間依次為2h、0. 5h、0. 5h，合并煎液，濾過，濾液濃縮成相對密度為1. 30 1.35(20°C)的清膏(每ImL樣品液相當于原處方藥材0.4g)。揮發油另器保存。測定指標成分(阿魏酸、苦參堿、苦參總堿、干浸膏得率、HPLC總面積、分子量 ^ 1000的提取物量)含量。將各指標成分所得數據進行標準化處理，以消除各指標的單位 和量綱不同，以及各指標變量范圍相差懸殊所造成的影響。同時考慮各指標在提取中的主 次，給予不同的加權系數，計算出提取液的綜合評判參數Y值。結果見表4。干浸膏量的測定，按照《中國藥典》2005年版一部附錄X · A浸出物測定法。實施例2取250g當歸(過20目篩)、250g苦參(過20目篩)，麥麩12g及氧化鈣2g，攪拌 均勻，加入30g(即30ml)水潤濕藥材，充分攪勻后的藥料裝入發酵培養袋，密封。將發酵培 養袋放入高壓蒸汽滅菌鍋內滅菌，使滅菌壓力升至0. IMPa，保持壓力在0. 1-0. 15MPa之間， 時間2h。放涼后取出培養袋。接種雞腿菇，接種量為0.7wt% 取雞腿菇母種試管，接種針 在試管口放涼片刻，然后將母種表面老化的菌種部分除去，取一部分放入貼標簽的培養袋 中，迅速密封放好。然后將培養袋放入25°C恒溫箱中培養28天。將固體發酵以后的藥材 用“雙提法”在常壓95-98°C下加熱回流提取3次，加水量分別為藥材重量的10、6、6倍，提 取時間依次為2h、0. 5h、0. 5h，合并煎液，濾過，濾液濃縮成相對密度為1. 30 1. 35 (200C ) 的清膏(每ImL樣品液相當于原處方藥材0.4g)。揮發油另器保存。測定指標成分(阿魏酸、苦參堿、苦參總堿、干浸膏得率、HPLC總面積、分子量 ^ 1000的提取物量)含量。將各指標成分所得數據進行標準化處理，以消除各指標的單位 和量綱不同，以及各指標變量范圍相差懸殊所造成的影響。同時考慮各指標在提取中的主 次，給予不同的加權系數，計算出提取液的綜合評判參數Y值。結果見表4。干浸膏量的測定，按照《中國藥典》2005年版一部附錄X · A浸出物測定法。實施例3取300g當歸(過20目篩)、300g苦參(過20目篩)，麥麩20g及氧化鈣6g，攪拌 均勻，加入40g(即40ml)水潤濕藥材，充分攪勻后的藥料裝入發酵培養袋，密封。將發酵培 養袋放入高壓蒸汽滅菌鍋內滅菌，使滅菌壓力升至0. IMPa，保持壓力在0. 1-0. 15MPa之間， 時間2h。放涼后取出培養袋。接種雞腿菇，接種量為1. 0襯％:取雞腿菇母種試管，接種針在 試管口放涼片刻，然后將母種表面老化的菌種部分除去，取一部分放入貼標簽的培養袋中，
10迅速密封放好。然后將培養袋放入29°C恒溫箱中培養25天。將固體發酵以后的藥材用“雙 提法”在常壓90-93°C下加熱回流提取3次，加水量分別為藥材重量的10倍、6倍、6倍，提 取時間依次為2h、0. 5h、0. 5h，合并煎液，濾過，濾液濃縮成相對密度為1. 30 1. 35 (200C ) 的清膏(每ImL樣品液相當于原處方藥材0. 4g)。揮發油另器保存。測定指標成分(阿魏酸、苦參堿、苦參總堿、干浸膏得率、HPLC總面積、分子量 ^ 1000的提取物量)含量。將各指標成分所得數據進行標準化處理，以消除各指標的單位 和量綱不同，以及各指標變量范圍相差懸殊所造成的影響。同時考慮各指標在提取中的主 次，給予不同的加權系數，計算出提取液的綜合評判參數Y值。結果見表4。干浸膏量的測定，按照《中國藥典》2005年版一部附錄X · A浸出物測定法。實施例4 (根據權利要求補充麥麩為0的情況，請補充檢測數據)取200g當歸(過20目篩)、200g苦參(過20目篩)及氧化鈣lg，攪拌均勻，加 入20g(即20ml)的水潤濕藥材，充分攪勻后的藥材裝入發酵培養袋，密封。將發酵培養袋 放入高壓蒸汽滅菌鍋內滅菌，使滅菌壓力升至0. IMPa，保持壓力在0. 1-0. 15MPa之間，時間 1.5h。放涼后取出培養袋。接種雞腿菇，接種量為0. 取雞腿菇母種試管，接種針在試 管口放涼片刻，然后將母種表面老化的菌種部分除去，取一部分放入貼標簽的培養袋中，迅 速密封放好。然后將培養袋放入27°C恒溫箱中培養31天。將固體發酵以后的藥材用“雙 提法”在常壓下90-92°C加熱回流提取3次，加水量分別為藥材重量的10倍、6倍、6倍，提 取時間依次為2h、0. 5h、0. 5h，合并煎液，濾過，濾液濃縮成相對密度為1. 30 1. 35 (200C ) 的清膏(每ImL樣品液相當于原處方藥材0.4g)。揮發油另器保存。測定指標成分(阿魏酸、苦參堿、苦參總堿、干浸膏得率、HPLC總面積、分子量 ^ 1000的提取物量)含量。將各指標成分所得數據進行標準化處理，以消除各指標的單位 和量綱不同，以及各指標變量范圍相差懸殊所造成的影響。同時考慮各指標在提取中的主 次，給予不同的加權系數，計算出提取液的綜合評判參數Y值。結果見表4。干浸膏量的測定，按照《中國藥典》2005年版一部附錄X · A浸出物測定法。比較例1當歸200g、苦參200g粉碎成粗粉(20目)，混勻，用“雙提法”在常壓95_98°C下 加熱回流提取3次，加水量分別為藥材重量的10倍、6倍、6倍，提取時間依次為2h、0. 5h、 0.5h，合并煎液，濾過，濾液濃縮成相對密度為1.30 1.35(20°C)的清膏(每ImL樣品液 相當于原處方藥材0.4g)。揮發油另器保存。測定指標成分(阿魏酸、苦參堿、苦參總堿、 干浸膏得率、HPLC總面積、分子量< 1000的提取物量)含量。將各指標成分所得數據進行 標準化處理，以消除各指標的單位和量綱不同，以及各指標變量范圍相差懸殊所造成的影 響。同時考慮各指標在提取中的主次，給予不同的加權系數，計算出提取液的綜合評判參數 Y值。結果見表4。表4實施例1-4及比較例1提取液中各指標成分的含量測定值及標準化處理結果
11 注1· Y =[(阿魏酸+苦參堿+苦參總堿)+3] X5+(干浸膏+HPLC總面 積)+2]X3+1000D 提取物 X2。2.括號內的數值為標準化處理的結果；*P < 0. 05，< 0. 01。本實驗加權系數的確定是按照各指標在提取工藝選擇中的主次地位，給予不同的 加權系數，以標準化后的值加權后求和，即得綜合評價值。因為單體成分、有效部位、HPLC 總峰面積、1000D提取物得率的各真值相差較大，單體成分可能僅僅為HPLC總峰面積或者 1000D提取物得率的百分之一或千分之一。假若采用將各個指標的真值“以同等對待進行 加合作為綜合評分指標”，則HPLC總峰面積或者1000D提取物得率等真值較大的指標數值 稍有變化，往往就會掩蓋單體成分、有效部位等真值較小指標的數值。而且單體成分、有效 部位等真值較小的指標，在質量標準制訂中具有重要作用。因此，在該提取工藝選擇中單 體成分、有效部位等真值較小的指標占主要地位，給予的加權系數大。本實驗各指標綜合 評判Y值的關系式為Y =[(阿魏酸+苦參堿+苦參總堿)+3] X 5+(干浸膏+HPLC總面 積)+2]X3+1000D 提取物 X2。在多指標實驗中，通常采用“綜合評分法”或“綜合平衡法”進行數據分析。本實 驗對各單個指標數據進行標準化處理，求得數據的相對值，再對標準化后的數值作加權求 和處理，得到一個綜合評判Y值。這樣做可以消除各指標之間的單位和量綱的不同，以及指 標變量范圍相差懸殊所造成的“拉平效應”影響，提高了組間綜合評判數據的相關性和可比 性，更科學、合理。根據表4的結果，可以看出，綜合評價Y值的順序為Y發酵> Y未發酵，表明當歸
12苦參丸方藥經固體發酵后有利于藥物成分的提取。實驗部分取實施例1和比較例1的提取液做如下實驗1、實施例1和比較例1的提取液的主要藥效比較1. 1煤焦油致兔耳角化模型實驗用煤焦油外涂于雄性白色家兔(體重1.5 2. 5kg)右耳管開口處，左耳涂以橄欖 油，1次.(T1,連續14d，造成兔耳實驗痤瘡動物模型。雄性白色家兔24只隨機均分4組，即 模型組(只造模不給藥)，陽性藥組(維胺脂膠囊)，實施例1發酵藥材提取液組和比較例 1未發酵藥材水提取液組。灌胃給藥，(XSg^mLil次*(1-1，連續14d。用肉眼觀察耳根厚 度，有無粉刺，進行評分無粉刺(0)；毛囊漏斗部見少量致密角化物(+)；毛囊漏斗部見中 等量致密角化物，并向皮脂腺延伸(++)；擴張的毛囊內有廣泛的角化物質，與人類的開放 性粉刺相似(+++)。組織學觀察(角化過度，表皮和毛囊上皮的顆粒層增厚，棘層肥厚；相 鄰擴張的毛囊互相融合，毛囊口及漏斗部都充滿角化物質，并向皮脂腺延伸；毛囊口角栓堵 塞，毛囊漏斗部充滿角化物質并擴大呈壺狀；真皮上層毛細血管擴張明顯，毛囊周圍彌漫散 在炎性細胞浸潤，以小圓形細胞為主，還有少量中性粒細胞)HE染色光鏡檢查，4組實驗結 果見附圖2A、附圖2B、附圖2C和附圖2D。生理鹽水組，病變無明顯改善，表皮層仍增厚，毛囊 有大量角化物(圖2A)；陽性藥組表皮層變薄，毛囊角化物少且疏松或無角化物(圖2B)；發 酵藥材提取液組表皮變薄，毛囊無角化物(圖2C)；未發酵藥材水提取液組表皮層也變薄， 毛囊有中等量角化物且較疏松(圖2D)。結果表明發酵藥材提取液組可顯著減輕兔皮膚毛 囊皮脂腺導管的過度角化和表皮角質層的增厚。1. 2抗炎試驗①對角叉菜膠所致大鼠足跖腫脹的影響將40只大鼠(180_220g)隨機分為4組 (對照組、地塞米松組、實施例1發酵藥材提取液組，比較例1未發酵藥材水提取液組)，除 對照組灌胃給與飲用水Irnl · IOOg-1外，其他各給藥組灌胃給與相應藥物Iml · lOOg—1體重， 1次· cf1，連續5d。末次給藥后lh，在大鼠右后腳足跖部皮內注射角叉菜膠0. 1ml，于 致炎后lh，2h，3h，4h，5h，6h用軟皮尺測量足跖周長，并測量左腳相應部位的周長。計算腫 脹率，并與對照組進行t檢驗，見表5。發酵提取液組、未發酵提取液組與對照組比較，對角 叉菜膠所致大鼠足腫脹均具有顯著的抑制作用(P <0.01，P <0.05)，發酵提取液組抗炎 作用明顯強于未發酵提取液組(P < 0. 05)。表5 2種方法提取液對角叉菜膠所致大鼠足跖腫脹的影響 與對照組比較*P< 0. 05**P < 0. 01②對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響將40只小鼠(18_22g)隨機分為4組(對照組、地塞米松組、實施例1發酵藥材提取液組，比較例1未發酵藥材水提取液組)，除對照組 灌胃給與飲用水Iml · IOOg-1外，其他各給藥組灌胃給與相應藥物Iml · lOOg—1，1次· cf1， 連續5d。末次給藥后lh，在小鼠右耳部皮內外側均勻涂予二甲苯溶液，于致炎后lh，取左 右兩耳相應部位的耳片，精確稱重。計算腫脹率，并與對照組進行t檢驗，見表6。結果表 明，發酵提取液組、未發酵提取液組與對照組比較，對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹均有顯著的 抑制作用，其腫脹抑制率分別為18. 27%和12. 97% (P < 0. 01，P < 0. 05)，發酵提取液組 抗炎作用明顯強于未發酵提取液組(P < 0. 05)。提示藥材發酵后抗炎作用明顯增強。表6 2種方法提取液對小鼠二甲苯性耳腫脹的影響 ③對棉球肉芽腫的影響將40只大鼠(180_220g)隨機分為4組(對照組、地塞米 松組、實施例1發酵藥材提取液組，比較例1未發酵藥材水提取液組)，除對照組灌胃給予飲 用水Iml · IOOg"1外，其他各給藥組灌胃給與相應藥物Iml · lOOg—1，1次· cf1，連續5d。造模動物用水合氯醛(SSOmg^kg-1)麻醉，于腹部正中作一開口，用止血鉗剝離皮 膚至腹股溝處，將預先高壓滅菌并加入慶大霉素0. Iml的50mg棉球植入腹股溝處，縫合皮 膚，待動物清醒后開始給藥。取材末次給藥后lh，斷椎處死大鼠，打開腹部皮膚，仔細剝離棉球，置于電子天 平上稱重，即為棉球濕重，將棉球置于110°c烘箱中，干燥48h，取出稱量即為干重。分別用 棉球濕重、干重減去棉球重作為肉芽多少的指標，各組計算均值和SD，并與對照組進行t檢 驗，見表7。結果表明，發酵提取液組、未發酵提取液組的抑制率分別為20. 34%、7. 91% (P <0.01, P <0. 05)，發酵提取液組能顯著抑制小鼠棉球肉芽增生腫脹，抗炎作用明顯強于 未發酵提取液組(P < 0.01)，提示具有明顯的抗腫消炎作用。表7 2種方法提取液對棉球肉芽腫的影響 與對照組比較*P < 0. 05**P < 0. 01通過觀察發酵前后兩種提取液對角叉菜膠所致大鼠足跖腫脹、對二甲苯所致小鼠 耳廓腫脹、對小鼠棉球肉芽腫等實驗性炎癥的影響，證實了發酵后提取液具有顯著的抗炎 和改善機體炎性反應的作用。實驗結果提示，藥材發酵后提取不僅可以抑制毛細管擴張、通 透性增加、滲出性水腫為主的炎癥早期反應，而且對炎癥后期肉芽組織的增生也具有抑制 作用。2.實施例1和比較例1的提取液的急性毒性實驗方法將30只體重20士2g小鼠，隨機分成3組(比較例1、實施例1、空白)，每組 10只，實驗前12h禁食不禁水，第二日于8:00、12:00，16:00時，將實施例1、比較例1的方 藥提取液(質量濃度為0. 75g · mL-1)分別灌胃給藥，每只0. SmL 次_1，對照組灌胃等容量 蒸餾水，連續觀察7天，小鼠體重、行為活動無異常變化，無1例死亡。表明該方藥經固體發 酵后的水提取液尚未發現毒性反應。結論為考察該方藥經固體發酵后的安全性，對方藥發酵前后的水提取液作小鼠 急性毒性實驗，一天的最大給藥量(gog+g-1)相當于成人(60kg)每天用藥量(0. 3g .kg-1) 的300倍，在觀察期內，小鼠的體重及行為活動無異常變化，無1例死亡。表明該方藥經固 體發酵后與發酵前一樣，均未顯示有毒性反應，在規定劑量范圍內使用安全。盡管發明人已經對本發明的技術方案做了較為詳細的闡述和列舉，應當理解，對 于本領域一個熟練的技術人員來說，對上述實施例作出修改和/或變通或者采用等同的替 代方案是顯然的，都不能脫離本發明精神的實質，本發明中出現的術語用于對本發明技術 方案的闡述和理解，并不能構成對本發明的限制。
權利要求
一種當歸苦參提取工藝，其特征在于，所述的提取工藝包括下述步驟(1)固體發酵處理按重量份稱取當歸和苦參400 600份、麥麩0 20份，氧化鈣1 6份及水20 40份，混勻，混合物經滅菌處理后接種雞腿菇，然后于溫度25 29℃下發酵培養25 31天，(2)水提取處理步驟(1)得到的發酵產物加入其重量6 10倍的水，煎提處理得到提取液。
2.根據權利要求1所述的提取工藝，其特征在于，所述的步驟(1)中的當歸和苦參按重 量比1 1配料。
3.根據權利要求1所述的提取工藝，其特征在于，所述的步驟(1)中的當歸和苦參的粒 度要求為可通過20目篩。
4.根據權利要求1所述的提取工藝，其特征在于，所述的步驟(1)中的雞腿菇的接種量 為0. 5-1. Owt%，以當歸和苦參重量計。
5.根據權利要求1所述的提取工藝，其特征在于，所述的步驟(1)中的滅菌處理為壓 力 0. 1-0. 15MPa、時間 1-2 小時。
6.根據權利要求1所述的提取工藝，其特征在于，所述的步驟(2)中的煎提處理做3次 以上，煎煮時間共需3小時以上。
7.根據權利要求1所述的提取工藝，其特征在于，所述的步驟(2)中的煎提處理的溫度 為 90-100°C。
全文摘要
本發明屬于中藥領域，公開一種當歸苦參提取工藝，所述的提取工藝包括將按比例配備的當歸苦參依次經過(1)固體發酵處理和(2)水提取處理，其中固體發酵處理選用雞腿菇作為發酵菌種。本發明得到的當歸苦參提取物，與普通水提取處理得到的提取物相比，具有抗炎作用更強的特點，并通過了毒理驗證，安全可靠。
文檔編號A61K36/489GK101912439SQ20101030140
公開日2010年12月15日 申請日期2010年2月9日 優先權日2010年2月9日
發明者孫秀梅, 張超, 王英姿, 韓春超 申請人:王英姿