專利名稱：一種肝癌細(xì)胞的抑制劑及其在抑制腫瘤生長方面的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腫瘤細(xì)胞的抑制劑，特別一種肝癌細(xì)胞抑制劑及其在抑制腫瘤生長方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝癌(HCC)是世界范圍內(nèi)排列第五位的最常見的惡性腫瘤，而由于其對化療的耐受以及手術(shù)后極高的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移特性使其成為致死率第三的惡性腫瘤。近年來越來越多的研究證明，HCC的發(fā)生可能起源于一群具有干性的細(xì)胞亞群，這群細(xì)胞被稱為腫瘤起始細(xì)胞(tumor-initiating cells, TICs)或是腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells)。這群細(xì)胞表達(dá)特定的表面標(biāo)記，具有自我更新、分化、形成腫瘤以及化療耐受的特性。雖然，目前索拉菲尼(sorafenib)已經(jīng)用于靶向治療HCC，但是其對腫瘤的抑制作用以及肝癌病人的存活率并不是很好。因此，如果采用能夠抑制TICs的治療策略可能是靶向治療HCC的有效手段。 過氧化物酶體增殖物激活受體Y (peroxisome proliferator-activatedreceptor y，PPAR y )即PPARy激動(dòng)劑是核受體超家族中的一類配體依賴性的核轉(zhuǎn)錄因子。PPARy激動(dòng)劑主要包括內(nèi)源性的配體15d_PGJ2以及人工合成的抗糖尿病藥物噻唑燒二酮類家族成員，如羅格列酮(rosiglitazone)、曲格列酮(troglitazone)、環(huán)格列酮(ciglitazone)、卩比格列酮(pioglitazone)以及恩格列酮(englitazone)。配體活化 PPAR Y后，誘導(dǎo)靶基因的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控一系列的生理學(xué)進(jìn)程，例如代謝、細(xì)胞分化、凋亡以及組織
炎癥等。PPARy激動(dòng)劑在不同的腫瘤細(xì)胞中也被報(bào)道能夠抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡及分化。更有研究表明，在HCC的腫瘤組織中，尤其是在低分化的腫瘤組織中PPAR γ的表達(dá)明顯受到抑制，而且PPAR Y激動(dòng)劑可抑制HCC的形成、侵襲及轉(zhuǎn)移。AKT是維持正常生命活動(dòng)的重要信號(hào)傳導(dǎo)分子，其持續(xù)活化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是一重要的癌基因。同時(shí)，AKT的異?；罨歉伟?fù)發(fā)和預(yù)后不良的一種危險(xiǎn)因素。抑制AKT的活性可抑制腫瘤細(xì)胞的生長。然而，迄今為止，聯(lián)合PPAR Y激動(dòng)劑與AKT抑制劑能否有效地靶向肝腫瘤起始細(xì)胞從而抑制腫瘤生長仍然不是很清楚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了研究上述的PPAR Y激動(dòng)劑與AKT抑制劑聯(lián)合能否有效地靶向肝腫瘤起始細(xì)胞從而抑制腫瘤生長等技術(shù)問題，最終提供一種肝癌細(xì)胞的抑制劑及其在抑制腫瘤生長方面的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)原理
在人肝癌細(xì)胞系中PPAR Y激動(dòng)劑通過N0X2誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygenspecies, ROS)有效地抑制HCC細(xì)胞的干性表型；然而，ROS的上調(diào)引起AKT的高度活化，活化的AKT又以負(fù)反饋的形式調(diào)控ROS的水平，進(jìn)而影響PPAR Y激動(dòng)劑對HCC細(xì)胞的干性表型的調(diào)節(jié)。因此，PPARy激動(dòng)劑羅格列酮及AKT抑制劑曲西立濱(triciribine)聯(lián)合在體內(nèi)呈現(xiàn)出對腫瘤生長抑制的協(xié)同作用，并能抑制腫瘤組織中細(xì)胞的干性表型。由PPARy激動(dòng)劑與AKT抑制劑組成的一種新的肝癌細(xì)胞抑制劑的治療策略有望用于臨床治療肝癌。本發(fā)明的技術(shù)方案
一種肝癌細(xì)胞的抑制劑，包括PPAR Y激動(dòng)劑和AKT抑制劑；
所述的PPARy激動(dòng)劑優(yōu)選為羅格列酮或15d-PGJ2 ；
所述的AKT抑制劑優(yōu)選為曲西立濱；
通過針對皮下接種GFP+ Huh7細(xì)胞的BALB/C雄性裸鼠的試驗(yàn)表明，所述的肝癌細(xì)胞 的抑制劑中，按質(zhì)量比計(jì)算，PPARY激動(dòng)劑羅格列酮AKT抑制劑曲西立濱為100 1 ；
通過對肝癌細(xì)胞Huh7的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所述的肝癌細(xì)胞的抑制劑中，按質(zhì)量摩爾比計(jì)算，PPAR Y激動(dòng)劑15d-PGJ2 :AKT抑制劑曲西立濱為Ig :20-100 μ mol。上述的一種肝癌細(xì)胞的抑制劑在抑制肝癌細(xì)胞生長方面的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明的一種肝癌細(xì)胞的抑制劑，由于含有PPAR Y激動(dòng)劑羅格列酮或15d-PGJ2和AKT抑制劑曲西立濱，針對人肝癌細(xì)胞系特別是Huh7的實(shí)驗(yàn)研究表明，PPAR Y激動(dòng)劑羅格列酮和AKT抑制劑曲西立濱或PPAR Y激動(dòng)劑15d-PGJ2和AKT抑制劑曲西立濱組成的肝癌細(xì)胞的抑制劑均可以協(xié)同抑制HCC細(xì)胞的干性表型，從而抑制肝癌細(xì)胞的生長。進(jìn)一步，通過針對皮下接種GFP+ Huh7細(xì)胞的BALB/C雄性裸鼠試驗(yàn)，可以得出PPARy激動(dòng)劑羅格列酮和AKT抑制劑曲西立濱序貫聯(lián)合給藥達(dá)到了協(xié)同抑制腫瘤生長的作用，并且比單獨(dú)PPAR γ激動(dòng)劑在抑制腫瘤生長方面的抑制率增加42%、比單獨(dú)AKT抑制劑在抑制腫瘤生長方面的抑制率增加30. 5%。


圖1A、PPAR Y激動(dòng)劑15d_PGJ2和自由基清除劑NAC分別處理Huh7及SK-Ifepl細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的ROS含量變化統(tǒng)計(jì)圖(*，/X0. 05;#，/X0. Olvs對照組)；
圖1B、PPAR Y激動(dòng)劑15d-PGJ2分別處理Huh7和SK-H印I細(xì)胞后，N0X2表達(dá)量的示意
圖1C1、添加自由基清除劑NAC后，PPAR Y激動(dòng)劑15d_PGJ2處理Huh7細(xì)胞后，AKT及磷酸化AKT表達(dá)量示意 圖1C2、添加自由基清除劑NAC后，PPAR Y激動(dòng)劑羅格列酮處理Huh7細(xì)胞后，AKT及磷酸化AKT表達(dá)量示意 圖ID、AKT抑制劑曲西立濱處理Huh7細(xì)胞后，N0X2、AKT及磷酸化AKT表達(dá)量的示意
圖IE、PPAR Y激動(dòng)劑15d-PGJ2與AKT抑制劑曲西立濱聯(lián)合處理Huh7細(xì)胞后，ROS表達(dá)量變化的統(tǒng)計(jì)圖(*,/^<0. 05;**，7X0. 01)；
圖2A1、PPAR Y激動(dòng)劑15d-PGJ2與AKT抑制劑曲西立濱聯(lián)合處理Huh7細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡情況的統(tǒng)計(jì)圖(七/XO. 05)；
圖2A2、PPAR Y激動(dòng)劑羅格列酮與AKT抑制劑曲西立濱聯(lián)合處理Huh7細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡情況的統(tǒng)計(jì) 圖2B、PPAR Y激動(dòng)劑15d-PGJ2與AKT抑制劑曲西立濱聯(lián)合處理Huh7細(xì)胞后，細(xì)胞成球能力的統(tǒng)計(jì)圖，圖中· >=100 μ m表示腫瘤細(xì)胞球的直徑大于等于ΙΟΟμπι，^ 50-100μπι表示腫瘤細(xì)胞球的直徑大于50 μ m而小于100 μ m ;
圖2C、PPAR Y激動(dòng)劑15d-PGJ2與AKT抑制劑曲西立濱聯(lián)合處理Huh7細(xì)胞后，⑶133+細(xì)胞數(shù)的統(tǒng)計(jì)圖(*，P < 0.05; **，P < 0.01)；
圖2D、PPARy激動(dòng)劑羅格列酮與AKT抑制劑曲西立濱聯(lián)合處理Huh7細(xì)胞后，⑶133+細(xì)胞數(shù)的統(tǒng)計(jì)圖(*，P < O. 05)； 圖3A、實(shí)施例3中的羅格列酮處理組、曲西立濱處理組以及序貫聯(lián)合給藥方案示意圖； 圖3B、隨時(shí)間變化，不同給藥方式對小鼠皮下荷瘤體積大小的影響；
圖3C、不同給藥方式對小鼠皮下荷瘤所形成的腫瘤的重量的影響；
圖3D、不同給藥方式對小鼠皮下荷瘤所形成的腫瘤組織中CD133+細(xì)胞所占比例的統(tǒng)計(jì)圖(*,7X0· 05;**,^. 01)。
具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施例并結(jié)合附圖對本發(fā)明進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明。本發(fā)明所用的材料 細(xì)胞系及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
人肝癌細(xì)胞系Huh7細(xì)胞購自日本Riken Cell Bank, SK-Hepl細(xì)胞購自American TypeCulture Collection (ATCC)。6 8周齡雄性BALB/C裸鼠，購自上海必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，飼養(yǎng)于華東師范大學(xué)動(dòng)物房。小鼠置于恒溫(25-27° C)、恒濕(45-50%)、無特殊病原菌(SPF級(jí))環(huán)境下飼養(yǎng)，滅菌處理的水和飼料供動(dòng)物自由攝入。主要試劑
I公司
DMEM/F121:1 培養(yǎng)液_GIBCO_
面糖DMEM培養(yǎng)液GIBCO
~25% 胰酶 +0. 02% 乙二胺四乙酸(EDTA) GIBCO
15d-PGJ2Sigma 和 CaymanChemical
7-AADSigma
FITC-AnnexinVBD
B27GIBCQ
BCA蛋白定量試齊盒_Thermo_
bFGFR&D
DHEInvitrogen
ECL發(fā)光試齊盒_Thermo_
EGFR&D
MTTSigma
NACCalbiochem
Penstrep 雙抗GIBCO
RNAisoPlusTaKaRa
siRNASigma
SYBRPremixExTaq TaKaRa
DNaseIRoche
權(quán)利要求
1.一種肝癌細(xì)胞的抑制劑，包括PPAR Y激動(dòng)劑，其特征在于所述的肝癌細(xì)胞抑制劑還包括AKT抑制劑。
2.如權(quán)利要求I所述的一種肝癌細(xì)胞的抑制劑，其特征在于所述的PPARY激動(dòng)劑為羅格列酮或15d-PGJ2。
3.如權(quán)利要求2所述的一種肝癌細(xì)胞的抑制劑，其特征在于所述的AKT抑制劑為曲西兄浜。
4.如權(quán)利要求3所述的一種肝癌細(xì)胞的抑制劑，其特征在于按質(zhì)量比計(jì)算，即PPARy激動(dòng)劑羅格列酮=AKT抑制劑曲西立濱為100 :1。
5.如權(quán)利要求3所述的一種肝癌細(xì)胞的抑制劑，其特征在于按質(zhì)量摩爾比計(jì)算，SPPPARy激動(dòng)劑15d-PGJ2 :AKT抑制劑曲西立濱為Ig :20-100 μ mol。
6.如權(quán)利要求1、2、3、4或5所述的一種肝癌細(xì)胞的抑制劑在抑制肝癌細(xì)胞生長中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種肝癌細(xì)胞的抑制劑。所述的一種肝癌細(xì)胞的抑制劑包括PPARγ激動(dòng)劑與AKT抑制劑曲西立濱，所述的PPARγ激動(dòng)劑為羅格列酮或15d-PGJ2，其中PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮AKT抑制劑曲西立濱按質(zhì)量比計(jì)算為100∶1；PPARγ激動(dòng)劑15d-PGJ2AKT抑制劑曲西立濱按質(zhì)量摩爾比計(jì)算為1g∶20-100μmol。本發(fā)明的一種肝癌細(xì)胞抑制劑，能有效地抑制HCC腫瘤起始細(xì)胞亞群以及有效地抑制腫瘤生長，為臨床治療HCC提供了可能的有效治療策略。
文檔編號(hào)A61K31/7064GK102940884SQ20121046498
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月19日
發(fā)明者劉永忠, 劉蘭蘭, 楊兆娟 申請人:上海市腫瘤研究所