專利名稱：針對sars冠狀病毒基因的反義核酸序列及其藥物用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種針對SARS冠狀病毒基因的反義核酸序列及含有該反義核酸序列的藥物及其用途。
背景技術：
嚴重急性呼吸系統綜合癥(以下簡稱SARS)，又稱非典型性肺炎，是由一種新的冠狀病毒引起的一種傳染病，最先爆發于中國廣東，隨后向周邊國家和地區蔓延，截止到2003年5月17日，已經擴散到32個國家和地區，共報道了超出7000例的SARS病例。其發病特征為高燒、全身不適、頭疼、干咳、呼吸困難、血氧過少、肺部出現空洞，能夠發現全身性間隙浸潤液，嚴重的需要采用插管法或呼吸機幫助病人進行呼吸，死亡率高達15％左右(Kanchan Anand，JohnZiebuhr，Parvesh Wadhwani and et al.，Science，2003，Science 3001763-1767；)。SARS臨床診斷表現為淋巴細胞減少、白細胞減少、天冬氨酸轉氨酶和乳酸脫氫酶水平升高。
世界衛生組織負責傳染病的執行干事戴維·海曼于2003年4月16日宣布，經過全球科研人員的通力合作，正式確認冠狀病毒的一個變種是引起非典型肺炎的病原體，科學家將其命名為“SARS病毒”。SARS冠狀病毒是一種正義、單鏈RNA病毒，是RNA病毒中基因組最大的病毒，它本身沒有細胞結構，不能自主復制，但一旦進入人體細胞，就能利用細胞中的各種資源在宿主細胞中不斷進行復制(QIN E’de，ZHU Qingyu，YU Man and et al.，A complete sequenceand comparative analysis of a SARS-associated virus(Isolate BT01)，Chinese Science Bulletin，2003，48(10)941-948；Marco A.Marra，StevenJ.M.Jones，Carol ine R.Astell and et al.，The Genome Sequence of theSARS-Associated Coronavirus，2003，Science 3001399-1404；ChristianDrosten，Stephan Gunther，Wolfgang Preiser and et al.，Identificationof a novel coronaviral in patients with severe acute respiratory syndrome，the New England Journal of Medicine，April 10，2003)。SARS冠狀病毒主要通過呼吸道傳播，由于病毒的寄生特性，很難找到合適的藥物，因為藥物在殺死病毒的同時，往往也會誤傷健康細胞(Paul A.Rota，M.Steven Oberste，Stephan S.Monroe and et al.，Characterization of a Novel CoronavirusAssociated with Severe Acute Respiratory Syndrome，2003，Science 3001394-1399；)。
反義核酸是在原核細胞和真核細胞內天然存在的一種基因表達的抑制物(Mizuno，T.Chou，M-Y.and Inouye M.，1984，PNAS，81，1966-1970；HeywoodS.M.，1986，Nucleic Acids Research，14，6771-6772)，這些核酸片段的功能是結合到互補的mRNA序列上，阻止mRNA翻譯蛋白質分子的過程(PatersonB.M.，Roberts B.E.and Kuff E.L.，1977，PNAS，74，4370-4374)。反義寡聚核苷酸是一小段人工合成的核苷酸片段，它的堿基順序與人們選擇作為阻斷目標基因的某一段，依照堿基配對法則可以與存在于細胞質中的特定基因的mRNA結合，阻斷其復制或翻譯成蛋白質分子。
在細胞內部，一個拷貝的基因會產生200-300條mRNA，翻譯出10萬個具有生物學功能的蛋白質分子。傳統藥物一般是作用于具有生物學功能的蛋白質分子空間構型上的一兩個位點，由于蛋白質立體結構非常復雜，藥物可作用的靶位點又很少，因而特異性不會非常高。而反義核酸是通過堿基配對的原理來識別所作用的靶基因，從理論上說，一條長度為17個堿基的反義核酸分子，其堿基排列順序在人體全部基因中是唯一的。所以，長度超過17個堿基的反義核酸分子在人體全部基因中的結合位點即是唯一的，這就使反義核酸具有高度的特異性。毒理學研究也證明，反義核酸在體內具有很低的毒性。所以與傳統藥物相比，反義核酸藥物具有高選擇性、高效性以及低副作用等優點，特別是在抑制腫瘤生長和抗病毒繁殖等方面，已經有一個藥物進入美國和歐洲市場(1998年)，還有30多個反義核酸藥物在完成臨床前期的研究和開發后分別進入了臨床I、II、III期實驗(Stein C.A.and et al.，1994，Curr.Opin.Onco.，6，587-594；Crook S.T.，1995，Hematologic Pathology，9(2)，59-72，NewsRelease，ISIS pharmaceutical Co.2000.)。

發明內容
本發明的目的之一是提供一些反義核酸序列，該序列為一段人工合成的核苷酸序列，它與導致SARS的冠狀病毒基因的特定位點的序列是互補的。因此，給有效劑量藥后，該藥物與冠狀病毒基因的特定位點相結合，從而抑制該病毒在人體內的復制，以達到有效治療SARS的目的。
本發明的目的之二是提供一些治療SARS的反義核酸藥物，該藥物是由上面提到的反義核酸序列及可藥用載體或賦形劑組成的。
本發明的目的之三是提供上述的反義核酸序列用于制備抗嚴重急性呼吸系統綜合癥(SARS)藥物的用途。
本發明的目的之四是提供該反義核酸序列在制備治療其它由于要SARS冠狀病毒引起的疾病的藥物方面的用途。
以嚴重急性呼吸系統綜合癥(SARS)病毒基因的全部序列為攻擊位點，設計了一系列反義核酸序列，其特征在于可特異性地與導致SARS的冠狀病毒基因的不同區域相結合，所述的核酸序列選自SA15’AGGTTCATAGTTGTACTTCA 3’SA25’TTTGCCTGACGGGAATGCCA 3’SA35’TGCGAATGAGCAGATCTTCA 3’SA45’ATAGTTGTACTTCATTGCCA 3’SA55’GGTTCATAGTTGTACTTCAT 3’SA65’TTCCTGTTTGAGCAGAAAGA 3’SA75’CGGATGATGTTCCACCTGGT 3’SA85’AAGTGTTATGTTTGCGAGCA 3’SA95’ACCGGATGATGTTCCACCTG 3’SA105’GCATAAGCAGTTGTAGCATC 3’SA115’GAAGTGCATTTACATTGGCT 3’SA125’GCCTGTGTTGTAGATTGCGG 3’SA135’AGTTTACATCCTGATTATGTACGACTCCTA 3’SA145’GTCCTTTAGTAAGGTCAGTCTCAGTCCAAC 3’SA155’CTAATATTCTTGATGGATCTGGGTAAGGCA 3’SA165’CTGCGCCTAATATTCTTGATGGATCTGGGT 3’SA175’CCTGCGCCTAATATTCTTGATGGATCTGGG 3’SA185’AGCATCAATAGCCAGTGACACGAACCTTTC 3’SA195’TCCTGATTATGTACGACTCC 3’
SA205’ATCCCAACCCATAAGGTGTG 3’SA215’GGTAAGCATCAATAGCCAGT 3’采用亞磷酰胺固相合成法合成了相應的核酸分子，其長度均為20個或30個核苷酸殘基。將合成后經純化的寡核苷酸用碘處理，將磷酸硫酯鍵轉化為磷酸二酯鍵，然后用常規的DNA測序方法對所有反義核酸序列進行序列測定，與設計序列一致，以毛細管電泳法測定所有反義核酸序列的分子量，發現與理論分子量近似相等。
將上述SA系列反義核酸序列樣品用PBS(500ml溶液中含有9.566克十二水Na2HPO4，0.977克二水NaH2PO4和2.2克NaCl)溶解，Beckman DU640分光光度計定量，根據實驗所需樣品量分別取樣。
對上述藥物組合物送P3實驗室，進行驗證。采用經SARS冠狀病毒BJ-01感染的非洲綠猴腎細胞(Vero-E6)細胞株作為靶受體。另外采用正常Vero-E6細胞設定脂質體-組、脂質體+組作為陰性對照實驗組，脂質體-組只加轉染培養基、不加脂質體及SA系列反義核酸序列；脂質體+組加入一定量的脂質體、不加SA系列反義核酸序列。對合成的反義核酸進行篩選，結果顯示，其中21個反義核苷酸序列或其組合均具有不同程度的抑制SARS冠狀病毒損傷(大于25％)的特性，將它們分別定名為SA(1+3+5)組合、SA(2+4+6)組合、SA2、SA(7+8+12)組合、SA8、SA12、SA(9+10+11)組合、SA(13+14+16)組合、SA(15+17+18)組合、SA15、SA(19+20+21)組合，其中SA15、SA(2+4+6)組合、SA(15+17+18)組合和SA(7+8+12)組合具有較高的抑制SARS冠狀病毒生長(大于50％)的活性。
SARS系列反義寡聚核苷酸均是長為20個或30個核苷酸殘基并經過硫代修飾的寡聚核苷酸，攻擊目標為整個SARS冠狀病毒基因，它們可以在細胞質中與SARS冠狀病毒基因發生特異性的結合，阻斷SARS冠狀病毒基因的復制和蛋白的產生，從而抑制了SARS冠狀病毒的增殖。從核酸雜交的特性看，RNA與mRNA雜交的親和力比DNA與mRNA雜交的親和力要高，從而在藥用方面具有更大的價值，但是由于目前合成RNA的成本遠遠高于合成DNA的成本，考慮到臨床應用的成本要求，目前作為臨床應用試驗的反義核酸藥物均為硫代寡聚脫氧核糖(DNA)，但是將來合成RNA成本有可能降低，可能會在臨床上采用反義寡聚核糖(RNA)取代反義寡聚脫氧核糖(DNA)作為藥用。
反義核酸的生物學活性是序列特異性的，互補于某一基因特定位點的反義核酸，互補的長度不同，生物學活性高低也不同。一般說來，反義核酸與目標基因互補長一些，生物學活性會高，但是較長的反義核酸其合成的成本會高很多，所以作為藥用目的的反義核酸，研究者均會同時考慮成本核藥用活性選取一個合適的長度。本發明中反義核酸長度均為20個或30個堿基。當然，延長或縮短一至數個堿基而互補于同一基因位點的反義核酸也會具有程度不同的相同生物學活性。同時，互補于相同基因位點附近的反義核酸若結合部位有不同程度的重疊，被認為具有程度不同的序列同源性，也會具有不同程度的相同生物學活性。
在人體內存在大量的核酸外切酶，反義寡核苷酸若不經過化學修飾，會很快被降解，從而失去活性。反義寡核苷酸的化學修飾有很多種方法，常見的有硫代修飾反義核酸和2‘-甲氧基修飾反義核酸等。但是目前硫代反義核酸的藥理學、藥代動力學和毒理學等臨床前研究是各種化學修飾中研究得最為全面的，硫代反義核酸在體內可以有效地抵御核酸酶的降解，并且可以激發核糖核酸酶eH的活性，降解與之雜交的mRNA鏈，所以目前臨床實驗應用的反義核酸均為硫代反義核酸。同時人們也在進行其他化學修飾的反義核酸臨床前藥物研究，以便進行臨床應用。其他的修飾方式主要為磷酸骨架修飾和糖環修飾，磷酸骨架修飾包括巰基代磷酸、二巰基代磷酸、甲基化磷酸等；糖環修飾包括2’位甲基化、甲氧基化等DNA與RNA修飾，此外還包括肽核酸等核酸類似物。所以某一特定序列的反義核酸可以通過不同的化學修飾作為化學組份不同的化合物，在臨床上都具有藥物活性。
毋庸諱言，本發明提供的SA系列反義核酸序列可與藥用載體或賦形劑的組成藥物組合物。通過對感染SARS冠狀病毒的動物或人體進行各種方式的給藥，以達到治療SARS或其他由SARS冠狀病毒導致的疾病。
綜上所述，本發明所述的互補于SARS冠狀病毒基因不同部位的反義核酸具有抑制SARS冠狀病毒增殖的特性，在SARS的治療方面顯示出誘人的前景。可以通過不同的化學修飾，采用不同的長度和不同程度同源性的序列發展為具有臨床應用價值的抗SARS冠狀病毒的藥物。


圖1 加入SA系列反義核酸序列后，感染了SARS冠狀病毒的非洲綠猴腎細胞的存活率具體實施方式
在下面的具體實施方式
將進一步說明本發明，但并不限制本發明范圍。
實施例1SA系列反義核酸序列攻擊靶位目標的確定及反義核酸序列的合成。
在整個SARS冠狀病毒基因圖譜(約30Kb)的各個基因區段上選定反義核酸攻擊的位點。
使用美國PE公司應用生物系統部(APPLIEDBIOSYSTEMS)制造的392型DNA-RNA合成儀及其配套試劑，以亞磷酰胺固相合成法合成所設計的反義核酸，并對其進行硫代修飾。合成原料均由合成儀生產廠商提供，主要原料有四種二異丙基β-氰乙基亞磷酰胺單體腺苷(A)、鳥苷(G)、胸腺嘧啶苷(T)、胞嘧啶苷(C)；四種控制孔徑玻璃粉(Control Pore Glass)固相合成載體(A，G，C，T)；活化試劑四唑/乙腈蓋帽物試劑乙酸酐/二甲基嘧啶/四氫呋喃，1-甲基嘧啶/四氫呋喃；硫代反應試劑H-1，2-苯二硫醇-3-酮1，1二氧化物(Beaucage)/乙腈；脫三苯甲基試劑三氯乙酸/二氯甲烷；液體試劑乙腈/三氯甲烷；合成規模為0.2μM，固相載體量為50μM，堿基載體溶于無水乙晴中，濃度為100μM，其他試劑濃度及用量均按照儀器手冊進行。合成過程完全由電腦自動控制。
合成產物由濃氨水(28％)切割收集在密封耐壓的玻璃瓶中，于55℃、18小時進行脫保護處理。脫保護結束后用旋轉蒸發儀在40℃、0.1Mpa負壓下脫去粗產品中的氨，用Pharmacia的MonoQHP5/5進行純化脫鹽，去除短片段。純化產物凍干后得到白色粉末狀物質，儲存于-20℃，進行產品分析。
1.用質譜(MALDI-TOF-MS)測定分子量；2.用毛細管凝膠電泳測定其純度；3.DNA測序法測定序列；4.P31 NMR(核磁共振)確定硫代程度。
MALDI-TOF-MS測定的分子量與寡核苷酸的理論分子量相符。
毛細管凝膠電泳純度分析結果顯示本發明中的SARS系列反義核酸純品的純度大于95％。
序列測定證明本發明中的SARS系列反義核酸序列與設計序列相同。
P31 NMR分析顯示SARS系列反義核酸的硫代率大于98.5％。
實施例2SA系列反義核酸序列的化學組成結構將合成后經純化的寡核苷酸用碘處理，將磷酸硫酯鍵轉化為磷酸二酯鍵，然后用常規的DNA測序方法對所有反義核酸序列進行序列測定，結果顯示得到的反義核酸序列與設計序列一致；以毛細管電泳法測定所有反義核酸序列的分子量，發現與理論分子量近似相等。
實施例3SA系列反義核酸序列對于感染了SARS的非洲綠猴腎細胞的抑制1.將實施例3中所述在培養的非洲綠猴腎細胞(Vero-E6)上用SARS病毒-BJ-01株進行驗證。在P3實驗室操作。
2.SARS冠狀病毒劑量為10-3(病毒半數感染劑量TCID50＝10-7，本實驗所使用的病毒劑量高于病毒半數感染劑量四個數量級)，通常是2-3天病變。
3.藥物的劑量為1μM4.評判指標(用CPE法測定藥效)細胞無病變 -細胞病變在25％以下 +細胞病變在26-50％ ++細胞病變在51-75％ +++細胞病變在76-100％ ++++細胞存活率的計算按上述的觀察等級估算。細胞病變在+至+++之間則按細胞病變等級范圍的中位數計算。例如當計數在-時，細胞病變等級為0。當計數為25％以下時，病變按12.5％計算。當計數在25-50％時，病變按38％計算。當計數在50-75％時，病變按63％計算。細胞病變在76-100％時，病變按100％計算。
5.實驗程序第一天鋪板消化和收集VERO-E6細胞，用完全培養液配成2.5×105/ml的細胞懸液，接種于96孔細胞培養板中，每孔100μl。37℃，5％CO2條件下培養18-24小時。
第二天鏡檢觀察細胞布滿孔底面積80-90％成片，狀態良好即可開始正式實驗，將原來的細胞培養液全部吸棄，每孔加入100μl待篩選的藥物于96孔細胞培養板中(含一定量的脂質體)，每個待檢樣品做3個復孔。1hr后，加入100μl/孔SARS BJ-01病毒(10-3)，2-3小時后吸棄100μl/孔，加入完全培養基100μl/孔，放入37℃，5％CO2培養箱繼續培養。另外設定脂質體-、脂質體+組，脂質體組只加轉染培養基，不加脂質體及寡核苷酸；脂質體+組加入一定量的脂質體，不加脂質體。
第三天-第四天當病毒對照孔全部病變時，觀察藥物對細胞的保護效應。
6.實驗初步結果實驗設正常細胞對照和病毒對照。
正常細胞對照為不加病毒亦不加藥物；在實驗全過程應當無病變。
病毒對照為加病毒但不加藥物；在實驗終點應當全部病變。
藥物對照為加藥物不加病毒，在實驗全過程應當無病變。實驗初步結果

未加藥物和未加SARS冠狀病毒的正常細胞對照在實驗全過程中未見病變。

加入SARS冠狀病毒的病毒對照在實驗終點全部病變，顯示重度損傷或100％死亡。

藥物本身對VERO-E6細胞未顯示毒性。篩選結果如表2所示表2

與未加藥物但加入SARS冠狀病毒的嚴重損傷或100％死亡的細胞相比，藥物序列SA15、SA(2+4+6)組合、SA(15+17+18)組合和SA(7+8+12)組合對感染SARS冠狀病毒的VERO-E6細胞均顯示具有明顯的保護作用(＞50％)；藥物序列SA(1+3+5)組合、SA2、SA8、SA12、SA(9+10+11)組合、SA(13+14+16)組合、SA(19+20+21)組合顯示有一定程度的保護作用(25～50％)。
勿需贅言，本發明的SARS反義序列具有很大的可能通過不同的化學修飾、采用不同的長度和不同程度同源性的序列發展為具有臨床應用價值的抗SARS冠狀病毒的藥物。單獨使用或與其他藥物聯合使用進行SARS的治療，這對在本領域的普通技術人員看來是顯而易見的。
序列表<110>北京金賽獅反義核酸技術開發有限責任公司<120>針對SARS冠狀病毒基因的反義核酸序列及其藥物用途<160>21<170>PatentIn Version 2.1<210>SA1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<220>
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權利要求
1.一種反義核酸序列，其特征在于可特異性地與導致嚴重急性呼吸系統綜合癥(SARS)的冠狀病毒的特定基因的不同區域相合，所述的核酸序列選自下列序列之一或其組合SA15’AGGTTCATAGTTGTACTTCA 3’SA25’TTTGCCTGACGGGAATGCCA 3’SA35’TGCGAATGAGCAGATCTTCA 3’SA45’ATAGTTGTACTTCATTGCCA 3’SA55’GGTTCATAGTTGTACTTCAT 3’SA65’TTCCTGTTTGAGCAGAAAGA 3’SA75’CGGATGATGTTCCACCTGGT 3’SA85’AAGTGTTATGTTTGCGAGCA 3’SA95’ACCGGATGATGTTCCACCTG 3’SA105’GCATAAGCAGTTGTAGCATC 3’SA115’GAAGTGCATTTACATTGGCT 3’SA125’GCCTGTGTTGTAGATTGCGG 3’SA135’AGTTTACATCCTGATTATGTACGACTCCTA 3’SA145’GTCCTTTAGTAAGGTCAGTCTCAGTCCAAC 3’SA155’CTAATATTCTTGATGGATCTGGGTAAGGCA 3’SA165’CTGCGCCTAATATTCTTGATGGATCTGGGT 3’SA175’CCTGCGCCTAATATTCTTGATGGATCTGGG 3’SA185’AGCATCAATAGCCAGTGACACGAACCTTTC 3’SA195’TCCTGATTATGTACGACTCC 3’SA205’ATCCCAACCCATAAGGTGTG 3’SA215’GGTAAGCATCAATAGCCAGT 3’
2.如權利要求1所述的反義核酸序列，其中優選的為SA15。
3.如權利要求1所述的反義核酸序列，其中優選的為SA(2+4+6)組合。
4.如權利要求1所述的反義核酸序列，其中優選的為SA(15+17+18)組合。
5.如權利要求1所述的反義核酸序列，其中優選的為SA(7+8+12)組合。
6.含有權利要求1-5之一所述的反義核酸序列及可藥用載體或賦形劑的藥物組合物。
7.如權利要求1-5之一所述的反義核酸序列用于制備抗SARS藥物的用途。
8.如權利要求1-5之一所述的反義核酸序列用于制備其它由于SARS冠狀病毒引起的疾病的藥物的用途。
全文摘要
本發明涉及一種針對嚴重急性呼吸系統綜合癥(SARS)冠狀病毒基因的人工合成的反義核酸序列，該序列與SARS冠狀病毒基因的特定位點上的核苷酸序列互補，根據堿基互補原理，該反義核酸序列在人體或動物體內與SARS－冠狀病毒的特定位點相結合，從而阻斷該基因在人體或動物體內的復制或表達，以達到治療該疾病的目的。本發明還涉及含有該反義核酸序列的藥物組合物，及其藥物用途。
文檔編號A61K31/7088GK1569873SQ03146798
公開日2005年1月26日 申請日期2003年7月11日 優先權日2003年7月11日
發明者王君, 劉健平 申請人:北京金賽獅反義核酸技術開發有限公司