專利名稱：甲型、乙型肝炎聯合疫苗及其制備方法
技術領域：
本發明涉及肝炎疫苗領域，尤其涉及一種甲型、乙型肝炎聯合疫苗及其制備方法。
背景技術：
病毒性肝炎是由多種肝炎病毒引起的以肝臟損害為主的全身性急性或持續性傳染病，在世界各地均有發病流行。在肝炎患者中30-50%屬于甲型肝炎(簡稱甲肝)。甲肝是一種自限性疾病，但極易引起爆發流行，與當地社會、經濟狀況和衛生水平密切相關。全世界每年報道甲肝病例約140萬，事實上，這個數值可能還要高 出3-10倍；而乙型肝炎(簡稱乙肝)已有超過1/3的世界人口被感染。乙肝是乙肝病毒引起的疾病，在世界各國均有流行，我國屬高流行區。WHO估計全世界約有36億乙肝攜帶者，每年約有100萬死于與之有關的慢性復雜性疾病和急性爆發死亡[1]。盡管甲肝和乙肝的傳播途徑不一樣，但大量報道，住院的肝炎患者有相當一部分同時感染甲肝和乙肝。由于甲肝和乙肝疫苗的使用，這兩種肝炎的感染和流行得到了有效的控制。然而，隨著國家擴大免疫計劃，疫苗種類越來越多，免疫次數不斷增多，免疫程序復雜，免疫成本也不斷提高，也增加了漏種的機會。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種甲型、乙型肝炎聯合疫苗，該疫苗可減少頻繁的接種次數和漏種的機會，提高接種成功率，降低接種成本，為控制這兩種肝炎的感染和流行提供了更為有效的途徑，且具有良好的安全性、免疫原性和穩定性。本發明進一步所要解決的技術問題是提供一種甲型、乙型肝炎聯合疫苗的制備方法，該方法穩定可行，制備的聯合疫苗具有良好的安全性、免疫原性和穩定性。為解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案—種甲型、乙型肝炎聯合疫苗，包括有甲型肝炎病毒抗原和乙型肝炎病毒表面抗原蛋白，其中，所述甲型肝炎病毒抗原為甲型肝炎病毒經人胚肺二倍體細胞培養收獲并純化的甲型肝炎病毒抗原，其含量為630 660EU/ml，所述乙型肝炎病毒表面抗原蛋白含量為重組釀酒酵母發酵表達并純化的乙型肝炎病毒表面抗原蛋白，其含量為15 30 μ g/ml。優選地，還包括有免疫鋁佐劑，其含量為O. 35 O. 62mg/ml。優選地，所述甲型肝炎病毒抗原含量為640EU/ml。優選地，所述乙型肝炎病毒表面抗原蛋白含量為20yg/ml。 優選地，所述的甲型肝炎病毒毒株為自分離的SH株。優選地，所述的重組釀酒酵母菌種為美國默克公司以DNA重組技術構建的表達HBsAg的重組釀酒酵母。相應地，本發明還公開了一種甲型、乙型肝炎聯合疫苗的制備方法，該方法包括以下步驟甲型肝炎病毒抗原制備步驟，將甲型肝炎病毒經人胚肺二倍體細胞培養收獲并純化，得到甲型肝炎病毒抗原；乙型肝炎病毒表面抗原蛋白制備步驟，將重組釀酒酵母發酵表達并純化，乙型肝炎病毒表面抗原蛋白；混合步驟，將所述甲型肝炎病毒抗原和乙型肝炎病毒表面抗原蛋白混合，調節pH值至6. O 7. O之間，制成甲型、乙型肝炎聯合疫苗。優選地，所述甲型肝炎病毒抗原制備步驟具體包括甲肝病毒原液制備步驟，將甲型肝炎病毒毒株SH與人胚肺二倍體細胞混合吸附后接種至細胞工廠，于34-35°C下培養，至病毒增殖高峰期后，用胰酶消化含甲肝病毒的細胞，收獲細胞病毒液，經超聲破碎，氯仿抽提，超濾膜超濾，去除細胞雜蛋白，再經凝膠層析純化，按抗原含量用磷酸鹽緩沖液稀釋至抗原含量不低于3200EU/ml后，過濾除菌，甲醛滅 活，即得甲肝病毒原液；甲型肝炎病毒抗原鋁吸附產物制備步驟，將滅活后的甲肝病毒原液加入硫酸鉀鋁溶液吸附18-24小時后，用無菌生理鹽水洗滌，去上清液后，用生理鹽水稀釋至抗原含量不低于3200EU/ml，制成甲肝病毒抗原鋁吸附產物；優選地，所述乙型肝炎病毒表面抗原蛋白制備步驟具體包括乙肝病毒表面抗原蛋白原液制備步驟，將美國默克公司以DNA重組技術構建的表達HBsAg的重組釀酒酵母工作種子批菌種經錐形瓶、種子罐、生產罐進行發酵培養，收獲酵母菌，經高壓勻漿器破碎酵母菌，濾膜過濾除去酵母菌碎片，以硅膠吸附法粗提HBsAg，疏水色譜法純化HBsAg，用硫氰酸鹽處理，按蛋白濃度用磷酸鹽緩沖液稀釋至抗原蛋白濃度為600-800EU/ml，除菌過濾后即為原液；原液中加入終濃度為100 μ g/ml甲醒，在34_38°C保溫72_96小時滅活，滅活后蛋白質和鋁劑按I μ g蛋白質加入3. 86mg的比例混合，置2-8°C吸附沉降18-24小時，用無菌生理鹽水洗滌,去上清液后再恢復至原體積,制成HBsAg吸附產物；優選地，所述混合步驟具體包括將甲肝病毒抗原鋁吸附產物與HBsAg吸附產物等比例混合后，用O. lmol/L的HCl調節PH值至6. O 7. O之間，制成甲型、乙型肝炎聯合疫苗，其中含甲肝病毒抗原640EU/ml，HBsAg 為 20 μ g/ml。本發明的有益效果是本發明的實施例通過將以甲型肝炎病毒毒株SH株經人胚肺二倍體細胞培養得到的甲型肝炎病毒抗原和以重組釀酒酵母發酵表達的乙型肝炎病毒表面抗原蛋白混合，制成甲型、乙型肝炎聯合疫苗，從而減少了頻繁的接種次數和漏種的機會，提高了接種成功率，降低了接種成本，為控制這兩種肝炎的感染和流行提供了更為有效的途徑，且具有良好的安全性、免疫原性和穩定性。
具體實施例方式下面詳細描述本發明提供的甲型、乙型肝炎聯合疫苗的實施例。實施例1本實施例主要包括有甲型肝炎病毒抗原和乙型肝炎病毒表面抗原蛋白，其中，所述甲型肝炎病毒抗原為甲型肝炎病毒經人胚肺二倍體細胞培養收獲并純化的甲型肝炎病毒抗原，其含量為630 660EU/ml，所述乙型肝炎病毒表面抗原蛋白含量為重組釀酒酵母發酵表達并純化的乙型肝炎病毒表面抗原蛋白，其含量為15 30 μ g/ml。另外，本實施例還可包括有免疫鋁佐劑，免疫鋁佐劑的含量為O. 35 O. 62mg/ml。實施例2本實施例主要包括有甲型肝炎病毒抗原和乙型肝炎病毒表面抗原蛋白，其中，所述甲型肝炎病毒抗原為甲型肝炎病毒經人胚肺二倍體細胞培養收獲并純化的甲型肝炎病毒抗原，其含量為640EU/ml，所述乙型肝炎病毒表面抗原蛋白含量為重組釀酒酵母發酵表達并純化的乙型肝炎病毒表面抗原蛋白，其含量為20 μ g/ml，免疫鋁佐劑的含量為O. 35 O. 62mg/ml。
具體實現時，本實施例采用的甲型肝炎病毒毒株SH株，為本公司新分離的產毒量高、培養周期短、人胚肺二倍體細胞適應良好的毒株，可有效提高病毒產率，且安全性更好；采用細胞-病毒混合吸附技術以大大提高了病毒產量，縮短病毒培養周期，以及細胞工廠培養細胞技術，有效利用空間，節省廠房面積，提高疫苗生產能力。本實施例采用的菌種為美國默克公司以DNA重組技術構建的表達HBsAg的重組釀酒酵母。重組乙型肝炎疫苗的整套生產工藝為深圳康泰生物制品股份有限公司從國際著名制藥公司默克(默沙東)公司引進，自1994年投產以來，累計銷售2億多人份，安全性和有效性得到了極高的評價，這為甲型、乙型肝炎聯合疫苗的研制提供了有力的技術支持與可靠的單價疫苗保障供應。下面詳細描述本發明提供的甲型、乙型肝炎聯合疫苗的實施例。實施例3本實施例主要包括以下步驟甲型肝炎病毒抗原制備步驟，將甲型肝炎病毒經人胚肺二倍體細胞培養收獲并純化，得到甲型肝炎病毒抗原；乙型肝炎病毒表面抗原蛋白制備步驟，將重組釀酒酵母發酵表達并純化，乙型肝炎病毒表面抗原蛋白；混合步驟，將所述甲型肝炎病毒抗原和乙型肝炎病毒表面抗原蛋白混合，調節pH值至6. O 7. O之間，制成甲型、乙型肝炎聯合疫苗。實施例4本實施例主要包括甲型肝炎病毒抗原制備步驟，具體包括甲肝病毒原液制備步驟，將甲型肝炎病毒毒株SH與人胚肺二倍體細胞混合吸附后接種至細胞工廠，于34-35°C下培養，至病毒增殖高峰期后，用胰酶消化含甲肝病毒的細胞，收獲細胞病毒液，經超聲破碎，氯仿抽提，超濾膜超濾，去除細胞雜蛋白，再經凝膠層析純化，按抗原含量用磷酸鹽緩沖液稀釋至抗原含量不低于3200EU/ml后，過濾除菌，甲醛滅活，即得甲肝病毒原液；甲型肝炎病毒抗原鋁吸附產物制備步驟，將滅活后的甲肝病毒原液加入硫酸鉀鋁溶液吸附18-24小時后，用無菌生理鹽水洗滌，去上清液后，用生理鹽水稀釋至抗原含量不低于3200EU/ml，制成甲肝病毒抗原鋁吸附產物。乙型肝炎病毒表面抗原蛋白制備步驟，具體包括
乙肝病毒表面抗原蛋白將美國默克公司以DNA重組技術構建的表達HBsAg的重組釀酒酵母工作種子批菌種經錐形瓶、種子罐、生產罐進行發酵培養，收獲酵母菌，經高壓勻漿器破碎酵母菌，濾膜過濾除去酵母菌碎片，以硅膠吸附法粗提HBsAg，疏水色譜法純化HBsAg，用硫氰酸鹽處理，按蛋白濃度用磷酸鹽緩沖液稀釋至抗原蛋白濃度為600-800EU/ml,除菌過濾后即為原液；HBsAg吸附產物制備步驟，在原液中加入終濃度為100 μ g/ml甲醒，在34_38°C保溫72-96小時滅活，滅活后蛋白質和鋁劑按I μ g蛋白質加入3. 86mg的比例混合，置2_8°C吸附沉降18-24小時，用無菌生理鹽水洗滌，去上清液后再恢復至原體積，制成HBsAg吸附產物。混合步驟，具體包括將甲肝病毒抗原鋁吸附產物與HBsAg吸附產物等比例混合后，用O. lmol/L的HCl調節PH值至6. O 7. O之間，制成甲型、乙型肝炎聯合疫苗，其中含甲肝病毒抗原640EU/ml，HBsAg 為 20 μ g/ml。具體實現時，本實施例采用的甲型肝炎病毒毒株SH株，為本公司新分離的產毒量高、培養周期短、人胚肺二倍體細胞適應良好的毒株，可有效提高病毒產率，且安全性更好；采用細胞-病毒混合吸附技術以大大提高了病毒產量，縮短病毒培養周期，以及細胞工廠培養細胞技術，有效利用空間，節省廠房面積，提高疫苗生產能力。本實施例采用的菌種為美國默克公司以DNA重組技術構建的表達HBsAg的重組釀酒酵母。重組乙型肝炎疫苗的整套生產工藝為深圳康泰生物制品股份有限公司從國際著名制藥公司默克(默沙東)公司引進，自1994年投產以來，累計銷售2億多人份，安全性和有效性得到了極高的評價，這為甲型、乙型肝炎聯合疫苗的研制提供了有力的技術支持與可靠的單價疫苗保障供應。實施例5本實施例主要包括以下步驟按常規方法培養人胚肺二倍體細胞，長成單層后用O. 125%胰酶消化分散，加入含10%小牛血清的MEM培養液得細胞懸液，按O. 05-0.1MOL加入甲肝病毒，在20_30°C混合吸附30-90分鐘后，將混合吸附的細胞病毒混合液用含10%小牛血清的MEM培養液稀釋10倍后按O. 5M0I接種于2-40層細胞工廠，34_35°C培養21-24天。至病毒增殖高峰期，用O. 125%胰酶消化含甲肝病毒的細胞，收獲細胞病毒液，超聲破碎得混合液，取上清加入氯仿抽提，離心后取上清水相得到粗制的甲肝病毒液。超濾膜超濾濃縮，去除細胞雜蛋白。再經凝膠層析純化，得病毒層析液。按抗原含量用磷酸鹽緩沖液稀釋至抗原含量不低于3200EU/ml后，經O. 2 μ m濾膜過濾除菌，加入終濃度為80 μ g/ml的甲醛37°C滅活12天滅活，即得甲肝病毒原液。將滅活后的原液加入硫酸鉀鋁溶液吸附18-24小時，用無菌生理鹽水洗滌，去上清液后再用生理鹽水稀釋至終抗原含量為1280EU/ml，制成甲肝病毒抗原鋁吸附產物。取美國默克公司以DNA重組技術構建的表達HBsAg的重組釀酒酵母工作種子批菌種經O. 25L錐形瓶27-29°C藥瓶培養17-19小時 、2L錐形瓶27_29°C藥瓶培養17-19小時、70L種子罐27-29°C發酵培養16-22小時、800L生產罐27-29°C發酵培養44-48小時，收獲酵母菌。經高壓勻漿器破碎酵母菌后，加入加入等體積含Triton X-100的磷酸鹽緩沖液，在加入的過程中邊用濾膜過濾除去酵母菌碎片，抽提HBsAg。按每克蛋白質加入1. 43g硅膠比例加入硅膠吸附，離心棄去上清，硅膠沉淀用磷酸鹽緩沖液懸浮，粗提得HBsAg，疏水色譜法純化HBsAg，用硫氰酸鹽處理，用磷酸鹽緩沖液稀釋，除菌過濾后即為原液。原液中按一定比例加入終濃度為lOOyg/ml甲醛，34_38°C保溫72-96小時滅活。滅活后蛋白質液中加入硫酸鉀鋁溶液吸附18-24小時，用無菌生理鹽水洗滌，去上清液后再恢復至原體積，制成HBsAg吸附產物。將甲肝病毒抗原鋁吸附產物與HBsAg吸附產物等比例混合后，用O. lmol/L的HCl調節PH值至6. O 7. O之間，制成甲型、乙型肝炎聯合疫苗，其中含甲肝病毒抗原640EU/ml，HBsAg 為 20 μ g/ml。與現有技術相比，本發明具有以下優點聯合疫苗以及用于制備此疫苗的甲肝病毒抗原鋁吸附產物和HBsAg吸附產物，理化性質穩定，且兩種吸附產物幾乎完全吸附，它們之間未發生干擾，體外效力與單價疫苗相當。結果見表1，2，3，4。表I甲肝病毒抗原鋁吸附產物檢定結果
權利要求
1.一種甲型、乙型肝炎聯合疫苗，其特征在于包括有甲型肝炎病毒抗原和乙型肝炎病毒表面抗原蛋白，其中，所述甲型肝炎病毒抗原為甲型肝炎病毒經人胚肺二倍體細胞培養收獲并純化的甲型肝炎病毒抗原，其含量為630 660EU/ml，所述乙型肝炎病毒表面抗原蛋白含量為重組釀酒酵母發酵表達并純化的乙型肝炎病毒表面抗原蛋白，其含量為15 30 μ g/ml。
2.如權利要求1所述的甲型、乙型肝炎聯合疫苗，其特征在于還包括有免疫鋁佐劑，其含量為O. 35 O. 62mg/ml。
3.如權利要求1所述的甲型、乙型肝炎聯合疫苗，其特征在于所述甲型肝炎病毒抗原含量為640EU/ml。
4.如權利要求1所述的甲型、乙型肝炎聯合疫苗，其特征在于所述乙型肝炎病毒表面抗原蛋白含量為20 μ g/ml。
5.如權利要求1-4中任一項所述的甲型、乙型肝炎聯合疫苗，其特征在于所述的甲型肝炎病毒毒株為自分尚的SH株。
6.如權利要求5所述的甲型、乙型肝炎聯合疫苗，其特征在于所述的重組釀酒酵母菌種為美國默克公司以DNA重組技術構建的表達HBsAg的重組釀酒酵母。
7.一種甲型、乙型肝炎聯合疫苗的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟甲型肝炎病毒抗原制備步驟，將甲型肝炎病毒經人胚肺二倍體細胞培養收獲并純化，得到甲型肝炎病毒抗原；乙型肝炎病毒表面抗原蛋白制備步驟，將重組釀酒酵母發酵表達并純化，乙型肝炎病毒表面抗原蛋白；混合步驟，將所述甲型肝炎病毒抗原和乙型肝炎病毒表面抗原蛋白混合，調節pH值至6.O 7. O之間，制成甲型、乙型肝炎聯合疫苗。
8.如權利要求7所述的甲型、乙型肝炎聯合疫苗的制備方法，其特征在于，所述甲型肝炎病毒抗原制備步驟具體包括甲肝病毒原液制備步驟，將甲型肝炎病毒毒株SH與人胚肺二倍體細胞混合吸附后接種至細胞工廠，于34-35°C下培養，至病毒增殖高峰期后，用胰酶消化含甲肝病毒的細胞，收獲細胞病毒液，經超聲破碎，氯仿抽提，超濾膜超濾，去除細胞雜蛋白，再經凝膠層析純化，按抗原含量用磷酸鹽緩沖液稀釋至抗原含量不低于3200EU/ml后，過濾除菌，甲醛滅活，即得甲肝病毒原液；甲型肝炎病毒抗原鋁吸附產物制備步驟，將滅活后的甲肝病毒原液加入硫酸鉀鋁溶液吸附18-24小時后，用無菌生理鹽水洗滌，去上清液后，用生理鹽水稀釋至抗原含量不低于3200EU/ml，制成甲肝病毒抗原鋁吸附產物。
9.如權利要求8所述的甲型、乙型肝炎聯合疫苗的制備方法，其特征在于，所述乙型肝炎病毒表面抗原蛋白制備步驟具體包括乙肝病毒表面抗原蛋白原液制備步驟，將美國默克公司以DNA重組技術構建的表達HBsAg的重組釀酒酵母工作種子批菌種經錐形瓶、種子罐、生產罐進行發酵培養，收獲酵母菌，經高壓勻漿器破碎酵母菌，濾膜過濾除去酵母菌碎片，以硅膠吸附法粗提HBsAg，疏水色譜法純化HBsAg，用硫氰酸鹽處理，按蛋白濃度用磷酸鹽緩沖液稀釋至抗原蛋白濃度為600-800EU/ml，除菌過濾后即為原液；HBsAg吸附產物制備步驟，在原液中加入終濃度為100 μ g/ml甲醛，在34_38°C保溫72-96小時滅活，滅活后蛋白質和鋁劑按I μ g蛋白質加入3. 86mg的比例混合，置2_8°C吸附沉降18-24小時，用無菌生理鹽水洗滌，去上清液后再恢復至原體積，制成HBsAg吸附產物。
10.如權利要求9所述的甲型、乙型肝炎聯合疫苗的制備方法，其特征在于，所述混合步驟具體包括將甲肝病毒抗原鋁吸附產物與HBsAg吸附產物等比例混合后，用O.1m01/L的HCl調節pH值至6. O 7. O之間，制成甲型、乙型肝炎聯合疫苗，其中含甲肝病毒抗原640EU/ml，HBsAg 為 20 μ g/ml。
全文摘要
本發明公開一種甲型、乙型肝炎聯合疫苗，包括有甲型肝炎病毒抗原和乙型肝炎病毒表面抗原蛋白，其中，所述甲型肝炎病毒抗原為甲型肝炎病毒經人胚肺二倍體細胞培養收獲并純化的甲型肝炎病毒抗原，其含量為630～660EU/ml，所述乙型肝炎病毒表面抗原蛋白含量為重組釀酒酵母發酵表達并純化的乙型肝炎病毒表面抗原蛋白，其含量為15～30μg/ml。本發明可減少頻繁的接種次數和漏種的機會，提高接種成功率，降低接種成本，為控制這兩種肝炎的感染和流行提供了更為有效的途徑，且具有良好的安全性、免疫原性和穩定性。
文檔編號A61K39/29GK102988975SQ20121050448
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月30日 優先權日2012年11月30日
發明者黃秋香, 張現臣, 魏文進, 曾瀅, 甘建輝, 李思勤, 劉雨, 王春雨, 鐘漢斌, 孟紅彥, 黎武軍 申請人:深圳康泰生物制品股份有限公司