專利名稱：一種基于凝血酶活性的雙靶向作用的嵌合多肽及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質多肽的制備及其用途，更具體地講，本發明涉及一種包含 HMGBl (高遷移率族蛋白1) N端氨基酸序列和Exendin-4氨基酸序列的基于凝血酶活性的雙靶向作用的嵌合多肽及其應用。
背景技術：
高遷移率族蛋白l(High mobility group box 1，HMGB1)廣泛分布于淋巴組織以及腦、肝、肺、心、脾、腎等組織的有核細胞中。在肝、腦組織的細胞中，HMGBl主要存在于胞漿，但在大多數其它組織細胞中則主要存在于細胞核，在進化過程中其氨基酸序列高度保守。人類HMGBl基因位于13ql2染色體上，包括5個外顯子和4個內含子，編碼215個氨基酸序列(SEQ ID No :1，見基因庫CAG33144. 1)。HMGBl蛋白由三個獨特的結構域組成 (圖1)。其中，“A-box”位于N-末端，進化高度保守；“C-tail”在羧基末端，包含30個重復的天冬氨酸和谷氨酸殘基，可參與調節HMGBl與DNA結合的親和力；“B-box”位于二者之間。A-box和B-box均由3個α螺旋組成，并帶有強烈的正電荷，構成HMGBl的非特異性 DNA結合區。在生理條件下，HMGBl的表達穩定在一定的基礎水平上，其主要功能是作為核因子在細胞核內調節相關基因的活性，例如促進白介素-6(IL-6)基因的轉錄。在組織損傷或發生炎癥反應時，細胞(尤其是白細胞)內HMGBl表達顯著增加，除在細胞核內發揮作用外， HMGBl還被釋放至細胞外，它的B-box是引起炎癥反應的功能結構域，作用緩慢而持久，因此HMGBl又被稱為“慢性炎癥因子”。細胞釋放的HMGBl促進組織晚期炎癥反應的機理之一， 是通過與細胞膜上的晚期糖基化終產物(AGEs)受體RAGE結合，激活細胞內NF-ΙΛ通路，從而刺激細胞因子的產生，包括TNF-、IL-I、IL-、IL-8、MIP-I以及粘附分子VCAM和ICAM的表達增加，進一步促進炎癥反應。已有的研究發現， HMGBl與RAGE作用引發的這些反應可能與糖尿病患者的并發癥發生和發展有關。但是，研究還發現，正常衰老或凋亡的細胞不能釋放出HMGB1，因此，目前認為HMGBl只能在組織發生炎癥或損傷后，由破裂的細胞釋放到細胞外，是組織慢性炎癥反應的主要因素之一。有趣的是，HMGBl中的A_box對B_box的促炎癥活性具有很強的拮抗作用。A_box 的這種作用是通過與B-box競爭與受體結合(如RAGE、TLR2、TLR4)、從而減少B-box與細胞膜上受體的作用而減輕組織的炎癥反應。最近的研究發現，當A-box與C-tail融合后， 它的抗炎活性明顯增強，其作用機制不清楚，可能是由于C-tail的存在能促進A-box與受體結合從而增加后者對B-box的競爭性抑制作用。Exendin-4是從一種美洲大毒蜥蜴Gila monster lizard(Heloderma Suspectum) 的唾液腺毒素中分離出來的由39個氨基酸組成的多肽(SEQ ID No 2) 0它與GLP-I具有大約53%的結構同源性，能夠與GLP-I的受體結合。進一步的研究表明，該多肽與GLP-I有同樣的促進胰島素分泌的功能，但穩定性卻明顯高于GLP-1。由美國Amylin和Lilly制藥公司共同開發、人工合成的Exendin-4 (Exenatide，商品名為Byetta)于2005年4月獲美國 FDA批準，成為首個獲準上市的GLP-I擬似物，主要用于改善二甲雙胍和磺酰脲類藥物治療不理想的2型糖尿病患者的血糖控制。臨床應用表明，Exenatide注射后，空腹及餐后血糖均顯著下降，且降糖作用與血糖水平有關。當血糖高于正常時，其促進β細胞釋放胰島素， 當血糖低于正常時，Exenatide不再顯示進一步降糖作用。由此可見，Exenatide優于目前所用的磺脲類降糖藥，不易發生低血糖反應。Exendin-4與二甲雙胍、磺酰脲類藥物、或噻唑烷二酮類藥物聯合應用時，能有效地控制2型糖尿病患者的血糖，而且對體重還有減輕作用。大量資料表明，Exendin-4在治療糖尿病上具有顯著降血糖、促進胰島素分泌和保護胰島細胞等作用，且副作用很小，是一種新型的生物制品。由于Exendin-4能增加胰島素的分泌及提高β細胞質量的特性，(^hofaili等研究了 11名進行了胰島移植的1型糖尿病患者在使用Exendin-4后的效果。結果表明，Exendin-4能刺激胰島移植受者的胰島素分泌，在一些患者可減少外源性胰島素的用量，在其他患者則延緩再次需要使用胰島素的時間，提示Exendin-4未來的適應癥可擴展到1型糖尿病患者胰島移植后的輔助治療。更有研究認為其對神經系統有保護作用，隨著研究的不斷深入，其臨床適應癥可能進一步擴大。多肽藥物是近年來生物醫藥研究的成果之一，多肽藥物的生產主要有化學合成法和基因工程生產法?；瘜W合成法主要是固相或液相合成法。固相合成技術目前已較為成熟，但成本較高，隨著基因工程技術的成熟，國內外都嘗試用基因工程技術生產多肽以提高產量，降低成本。用基因工程方法生產中等長度O0-60個氨基酸殘基)多肽時，由于表達水平低，且容易降解，因此常與其它載體蛋白融合表達。但由于目的多肽在融合蛋白中所占比例很小，裂解后分離純化困難，影響了基因工程生產多肽藥物的發展。另一解決途經就是把目的多肽的基因串聯，可以提高產量。但串聯體切割時需要大量的酶，間接增加了生產成本。近年來，隨著基因工程技術的發展，構建各種融合蛋白或單體、串聯體多肽的報道迅速增加。同時，鑒于很多疾病對于單一藥物的治療效果不佳，國際上已開始研究利用不同藥物或單抗進行“雞尾酒”療法，這種給藥方法目前已成為一種新的發展趨勢。然而，利用人體自身存在的酶，在體內對多肽藥物進行裂解并連續釋放其有效成分，使之成為可在體內產生兩種(或多種)多肽而發揮不同效應并達到治療同一種疾病的多肽藥物，即所謂“多靶向” 治療藥物尚未見報道。凝血酶是體內存在的一種促進血液凝固的重要凝血因子，正常情況下凝血酶主要以酶原形式存在，少量被激活的凝血酶對于維持血管的正常狀態具有重要的生理意義。因此，血液中凝血與抗凝血因子必須達到一定的平衡，以維持正常的血液循環。若凝血活性太低則導致毛細血管脆性增加和皮下出血等癥狀；若凝血活性太高，則容易導致血流淤滯甚至發生血管內凝塞。當組織或血管發生損傷或炎癥時，大量的凝血酶原被激活，局部的血液凝固活性增加，有利于減少出血和促進組織修復。然而，某些疾病如糖尿病和腫瘤，因某些不明機制造成患者體內的凝血酶活性顯著升高，這種病理變化可能直接與這些疾病的并發癥發生和發展有關。已有研究表明，糖尿病患者體內的凝血酶活性比正常人的高3-10倍， 而實驗糖尿病大鼠的凝血酶活性則比正常大鼠的高達30倍之多！這種病理變化對于原發疾病有何意義尚不清楚。綜上所述，HMGBl的Α-box多肽通過競爭性抑制B_box序列與受體結合，能有效地發揮抗炎作用，減少細胞的炎癥因子產生和減輕炎癥對組織造成的損傷和癥狀，從而可以減緩原發疾病(如糖尿病)并發癥的發生與發展。Exendin-4是一種此GLP-I更有效、作用時間更長的降糖物質，主要通過促進胰島素合成和分泌以及促進β細胞增殖等機制而改善高血糖問題，具有治療糖尿病的功效。這些具有藥用功能的蛋白質多肽可以通過人工合成，也可以通過基因工程技術，用原核或真核表達的辦法大量生產。相比之下，人工合成技術成本較高，而基因工程技術生產多肽的成本較低，且能大規模生產。因此，將A-box和 Exendin-4兩種多肽以一種含有凝血酶切割位點的序列連接成為嵌合多肽，使之能在凝血酶活性增高的患者體內迅速被分解成A-box和Exendin-4兩種多肽，分別發揮抗炎和降低血糖的功能，達到雙靶向治療效果，這種嵌合多肽在國內外尚未見報道。

發明內容
針對現有技術的不足，本發明的目的是提供一種既能抗炎又能改善高血糖或對高血糖引起的疾病具有防治作用的一種雙靶向作用的嵌合多肽及其應用。為了實現本發明的發明目的，本發明提供了一種具有雙靶向作用的嵌合多肽，該嵌合多肽包括三段片段片段1、片段2和片段3，其中，片段1是HMGBl從N端計起的前 20-90個氨基酸序列，也即從人HMGBl多肽的N端第一個氨基酸殘基算起的20-90個氨基酸序列；片段2是Exendin-4的氨基酸序列；片段3是片段1和片段2的連接片段，其包含凝血酶酶切位點和二肽基肽酶的酶切位點。優選地，在本發明的嵌合多肽中，片段1是HMGBl從N端計起的前50_90個氨基酸序列；更優選地，在本發明的嵌合多肽中，片段1是HMGBl從N端計起的前60-88個氨基酸序列。在本發明的嵌合多肽中，所采用的HMGBl蛋白的氨基酸序列可以使已發表的各種人源性HMGBl肽鏈的氨基酸序列，例如，HMGBl蛋白的氨基酸序列優選為SEQ ID No:l所示的序列。如圖1所示，HMGBl蛋白的A-box氨基酸片段優選為SEQ ID No 1的N端1_88序列所示的片段。在本發明的嵌合多肽中，片段3是一種連接片段，只要其包括凝血酶酶切位點和二肽基肽酶、以便水解出具有生理活性的片段1和片段2即可，其本身長度本發明嵌合多肽的生理活性基本沒有影響，所以，連接片段的長度是可以沒有限制的；但從制備方便等角度考慮，優選地，片段3是是包括凝血酶酶切位點和二肽基肽酶的酶切位點的、長度為5-50個氨基酸的片段；更優選地，片段3是是包括凝血酶酶切位點和二肽基肽酶的酶切位點的、長度為5-25個氨基酸的片段。優選地，在本發明的嵌合多肽中，片段3中的二肽基肽酶的酶切位點位于與 Exendin-4蛋白的氨基酸序列相接的一側。在本發明的嵌合多肽中，片段2的Exendin-4蛋白的氨基酸序列已在NCBI網站登記，序列號為AAB22006，具體序列如SEQ ID No 2所示。作為本發明的某些具體實施方式
，在本發明的嵌合多肽中，片段1可以具有如SEQ ID No :9-SEQ ID No 12之一所示的序列，相應地，本發明的嵌合多肽可以具有如SEQ ID No :3-SEQ ID No :8之一所示的序列。本發明的嵌合多肽的結構示意圖見圖2。另一方面，為了實現本發明的發明目的，本發明還提供了制備上述具有雙靶向作
5用的嵌合多肽的方法，該嵌合多肽可以通過本領域公知多肽合成技術合成；或者通過公知的基因工程技術來實現，具體包括包含編碼該嵌合多肽的核苷酸序列(此序列可通過PCR 和或人工合成的技術得到)的表達載體，在基因工程菌株中表達并純化得到。上述方法中還可包括任何本領域公知的對多肽進行化學修飾的步驟。通過對本發明嵌合多肽進行體內和體外的活性實驗，證明其具有顯著的抗炎和降血糖的活性，完全可以應用于制備抗炎和/或降低高血糖的藥物。本發明的基本原理如下由于這種嵌合多肽含有凝血酶的切點和二肽基肽酶 (DPP-4)的切點，當這種嵌合多肽直接用于人體后，在血液中的凝血酶和DPP-4作用下，將其裂解并產生兩種具有藥用活性的多肽，即人HMGBl的N端序列(A-box)和Exendin-4，發揮不同的治療效果。所產生的人HMGBl的N端序列的多肽發揮其競爭性抑制HMGBl與受體結合，從而減輕細胞的炎癥反應，包括抑制1順-、11^-1、11^-、11^-8、10 -1以及粘附分子VCAM 和ICAM的產生，達到防治由于慢性炎癥而產生的并發癥，例如糖尿病的并發癥等；而所產生的Exendin-4則發揮調節血糖的功能，達到改善高血糖的問題，可防治由于高血糖而產生的疾病，包括1型和2型糖尿病等。因此，這種嵌合多肽在體內能夠被凝血酶切割而釋放出HMGBl的N端序列(或A-box)和Exendin-4兩種各具藥效功用的多肽，因而具有抗炎和降血糖的雙靶向作用。本發明的嵌合多肽在體內和體外實驗具有圖3所示的作用機制。相此于現有技術，本發明的嵌合多肽具有以下的有益效果1、在應用基因工程技術生產本發明的嵌合多肽時，將不存在生產其他融合蛋白所需的裂解純化的缺點，同時又可提高該多肽的表達量。2、這種嵌合蛋白在患者體內的連續性水解能延長該兩種多肽藥物的半衰期，從而減少用藥次數。3、這種嵌合蛋白在體內產生的HMGBl蛋白N端序列和Exendin-4多肽分別發揮兩種不同的作用，形成一種雙靶向疊加效應，具有“雞尾酒”設計效果。4、由于糖尿病患者血中的凝血酶活性比正常人高3-10倍，本發明的嵌合多肽尤其適用于糖尿病及其并發癥，因而針對性強。


圖1為HMGBl的分子結構，顯示A_box、C_tail和B_box三個結構域。圖2為本發明的雙靶向作用嵌合多肽的結構示意圖，包括HMGBl的N端序列、連接片段和Exendiin-4序列。圖3為本發明的雙靶向作用嵌合多肽在體內的作用機制示意圖。本示意圖列出的本發明的雙靶向嵌合多肽在體內的作用機制所涉及的酶包括DPP-4、凝血酶、凝血因子X。 在酶的作用下，該嵌合蛋白釋放出HMGBl的N端序列和Exendin-4兩種多肽，分別具有抗炎和刺激胰島素分泌的作用。圖4為嵌合多肽(SEQ ID No 3)的凝血酶水解產物對胰島細胞株NIT-I細胞的活性影響。NIT-I細胞與不同濃度(0，5，10，20，40微克/毫升)的嵌合多肽水解產物(含 HMGBl的N端序列和Exendin-4)共同保溫72小時后，用MTT法測定的細胞活性隨水解產物濃度而增加，提示水解產物對NIT-I細胞的增值具有促進作用。
圖5為化學發光法測定嵌合多肽(SEQ ID No 3)的凝血酶水解物對NIT-I細胞的胰島素分泌的影響?！皩φ战M”為未加水解產物，“未水解組”為未經凝血酶水解的嵌合多肽 (20微克/毫升)，“水解組”為經過凝血酶水解的嵌合多肽水解產物(20微克/毫升)，與 NIT-I細胞保溫72小時后測定上清液的胰島素含量(毫微克/毫升)。本圖顯示只有經過凝血酶水解的嵌合多肽才能刺激NIT-I細胞分泌胰島素。圖6為RT-PCR法測定嵌合多肽(SEQ ID No 3)的凝血酶水解物對K562細胞株 IL-6的mRNA表達水平的影響。M為DNA長度梯度，從下至上的條帶為100，200，300，400， 500，600bp ；1為對照組，2為重組人HMGBl(rhHMGBl) +嵌合多肽水解產物，3為rhHMGBl。本圖顯示rhHMGBl能顯著刺激K562細胞表達炎癥因子IL-6的mRNA (3)，而當嵌合多肽水解物和rhHMGBl同時存在時，IL-6的mRNA表達顯著降低O)，提示嵌合多肽水解物對rhHMGBl 的活性具有拮抗作用。
具體實施例方式實施例11、本發明嵌合多肽的制備按照圖2的排列設計，采用基因工程技術生成由人HMGBl的N端83個氨基酸、5個氨基酸連接片段、Exendin-4組成的嵌合肽序列，序列如下MGK⑶PKKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKA RYEREMKTYIPPKGVPRGPHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(SEQ ID No 3)上述序列中，下劃線所示的部分為連接片段，連接片段中G后面的P還可以是A、 S、V、L0具體制備上述序列的步驟如下(1)利用PCR方法或化學合成法得到人HMGBl的N端83個氨基酸和含凝血酶和二肽肽酶酶切位點5個氨基酸的DNA序列；(2)利用PCR方法或化學合成法得到含凝血酶和二肽肽酶酶切位點的連接片段和 Exendin-4 的 DNA 序列；(3)將上述兩段序列混合，94°C變性，52°C退火，互為模板延伸，得到嵌合肽的全 DNA序列；(4)用上述嵌合肽的全DNA序列構建表達質粒，轉導受體菌，通過篩選獲得陽性工程菌。以發酵罐擴大培養得到嵌合肽的基因工程表達產物，按常規方法純化和制備適用于人體的本嵌合多肽。2、生理活性實驗部分在PBS溶液中，將凝血酶、二肽基肽酶與本發明的嵌合多肽共同保溫，37°C，1小時模擬體內水解該嵌合肽，所獲得的酶水解產物進行初步的活性測定或經過凝膠層析分離得到HMGBl的N端肽段和Exenden-4多肽，分別開展活性實驗。(1)用MTT法測定嵌合多肽產生的Exenden-4對胰島-細胞株NIT-I細胞的增值活性影響。取對數生長期的NIT-I細胞與最終濃度為0，5，10，20，40 μ g/ml的嵌合肽水解產物共同保溫72小時，除去上清，用MTT測定細胞活性，可以觀察到NIT-I細胞的活性(A 值)隨嵌合肽水解產物的濃度增加而明顯提高，顯示Exenden-4多肽對NIT-I細胞的增值具有顯著的促進作用(如圖4所示)。(2)用化學發光法測定嵌合多肽產生的Exenden-4對胰島-細胞株NIT-I細胞的胰島素分泌的影響。取對數生長期的NIT-I細胞，分三組，對照組加生理鹽水，實驗1組(未水解組)加最終濃度為20 μ g/ml嵌合肽，實驗2組(水解組)加最終濃度為20 μ g/ml嵌合肽水解產物，在37°C保溫72小時，取上清液用化學發光法測定胰島素含量，可以觀察到實驗1組對NIT-I細胞分泌胰島素無明顯的影響，但實驗2組的胰島素含量明顯升高，顯示嵌合肽水解產物中的Exenden-4能顯著增加NIT-I細胞的胰島素分泌(如圖5所示)。(3)用RT-PCR法測定嵌合多肽產生的HMGBl的N端序列對K562細胞內IL-6的 mRNA表達水平的影響。取對數生長期的K562細胞，分三組，對照組加生理鹽水，實驗1組同時加嵌合肽水解物(20 μ g/ml)和 hrHMGBl (10 μ g/ml)，實驗 2 組加 hrHMGBl (10 μ g/ml)，在 37°C保溫72小時，收集細胞并提取總RNA，用逆轉錄酶制備cDNA。用IL-6引物(forward AAAGAGGCACTGGCAGAAAA, reverse :AACAACAATCTGAGGTGCCC， size :416bp)和-actin 弓丨物 (forward TGGGTCAGAAGGATTCCTATGT, reverse CAGCCTGGATAGCAACGTACA, size :276bp)分析IL-6的mRNA表達水平?？梢杂^察到對照組的IL-6表達水平較低，而實驗2組顯示IL-6 的mRNA水平顯著增高，表明細胞受hrHMGBl刺激而增加IL-6的合成，而實驗1組的IL-6 的mRNA水平比實驗2組顯著降低，顯示嵌合肽水解產物中的HMGBl的N端序列能顯著抑制 hrHMGBl對K562細胞的刺激作用(如圖6所示)。(4)體內法鑒定嵌合多肽的降血糖和抗炎作用利用鏈脲佐菌素制備糖尿病大鼠模型，隨機分為不同濃度給藥組和對照組，每組10只，分別于腹腔給藥(對照組注射生理鹽水)，于30min后取尾靜脈血用血糖儀測定血糖，Ih后用尿糖試紙測定尿糖，觀察嵌合多肽對糖尿病大鼠的降血糖效果。另外，采用 ELISA法定量測定尾靜脈血漿中TNF-、IL-1和IL-6的水平，分析大鼠炎癥因子的產生情況。 該實驗將可觀察到糖尿病大鼠的血糖和尿糖下降，炎癥細胞因子水平下降。下述實施例2-6是本發明實現的另外幾種實現方式，其制備方法均為現有基因工程及核苷酸或氨基酸化學合成的公知技術，它們得到的嵌合多肽在與實施例1中所述的生理活性實驗中均體現了不同程度的抗炎活性以及降低血糖的作用。實施例2按照圖2的排列設計，用化學合成的方法合成由人HMGBl的N端60個氨基酸、6個氨基酸連接片段、Exendin-4組成的嵌合多肽，再按常規方法純化和制備適用于人體的本嵌合多肽藥物成分。本例嵌合多肽的序列為MGK⑶PKKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFLVPRGPHGE GTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(SEQ ID No 4)上述序列中，下劃線所示的部分為連接片段，連接片段中的L、V還可以是A、I、M、 F、P、W等，連接片段中G后一位的P還可以是A、S、V、L0實施例3按照圖2的排列設計，用化學合成的方法合成由人HMGBl的N端40個氨基酸、12 個氨基酸連接片段、Exendin-4組成的嵌合多肽，再按常規方法純化和制備適用于人體的本嵌合多肽藥物成分。
本例嵌合多肽的序列為MGK⑶PKKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSELVPRGPGVPRGPHGEGTFTSDLSKQMEEE AVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(SEQ ID No 5)上述序列中，下劃線所示的部分為連接片段，連接片段中的L、V還可以是A、I、M、 F、P、W等，連接片段中G后一位的P還可以是A、S、V、L0實施例4按照圖2的排列設計，用化學合成的方法合成由人HMGBl的N端20個氨基酸、18 個氨基酸連接片段、Exendin-4組成的嵌合多肽，再按常規方法純化和制備適用于人體的本嵌合多肽藥物成分。本例嵌合多肽的序列為MGK⑶PKKPRGKMSSYAFFVLVPRGPGVPRGPGVPRGPHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGP SSGAPPPS(SEQ ID No 6)上述序列中，下劃線所示的部分為連接片段，連接片段中的L、V還可以是A、I、M、 F、P、W等，連接片段中G后一位的P還可以是A、S、V、L0實施例5按照圖2的排列設計，用化學合成的方法合成由人HMGBl的N端20個氨基酸、M 個氨基酸連接片段、Exendin-4組成的嵌合多肽，再按常規方法純化和制備適用于人體的本嵌合多肽藥物成分。本例嵌合多肽的序列為MGK⑶PKKPRGKMSSYAFFVLVPRGPGVPRGPGVPRGPGVPRGPHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEW LKNGGPSSGAPPPS(SEQ ID No 7)上述序列中，下劃線所示的部分為連接片段，連接片段中的L、V還可以是A、I、M、 F、P、W等，連接片段中G后一位的P還可以是A、S、V、L0實施例6按照圖2的排列設計，用化學合成的方法合成由人HMGBl的N端20個氨基酸、6個氨基酸連接片段、Exendin-4組成的嵌合多肽，再按常規方法純化和制備適用于人體的本嵌合多肽藥物成分。MGK⑶PKKPRGKMSSYAFFVLVPRGPHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(SEQ ID No 8)上述序列中，下劃線所示的部分為連接片段，連接片段中的L、V還可以是A、I、M、 F、P、W等，連接片段中G后一位的P還可以是A、S、V、L0實施例7按照圖2的排列設計，用化學合成的方法合成人HMGBl的N端20_90個氨基酸序列、由3-M個氨基酸組成的連接片段、Exendin-4序列組成的嵌合多肽，再按常規方法純化和制備適用于人體的本嵌合多肽藥物成分。實施例8利用常規工藝制成含本發明的嵌合多肽(SEQ ID No :3)250微克/毫升、500微克 /毫升、750微克/毫升、1000微克/毫升、1500微克/毫升和2000微克/毫升的皮下注射藥物。該藥物在臨床實驗中均體現了拮抗HMGBl和降血糖的功能。
實施例9利用常規工藝制成含本發明的嵌合多肽(SEQ ID No :3)0. 1微克/毫升、0. 2微克 /毫升、0. 5微克/毫升、1微克/毫升和2微克/毫升的靜脈注射藥物。該藥物臨床實驗中均體現了拮抗HMGBl和降血糖的功能。
權利要求
1.一種具有雙靶向作用的嵌合多肽，該嵌合多肽由三段片段構成片段1、片段2和片段3 ；其中，片段1是HMGBl從N端計起的前20-90個氨基酸序列；片段2是Exendin-4的氨基酸序列；片段3是片段1和片段2的連接片段，其包含凝血酶酶切位點和二肽基肽酶的酶切位點。
2.如權利要求1所述的嵌合多肽，其中，所述的二肽基肽酶的酶切位點位于與 Exendin-4蛋白的氨基酸序列相接的一側。
3.如權利要求1所述的嵌合多肽，其中，所述的片段1是來自如SEQID No:l所示的 HMGBl蛋白的從N端計起的前20-90個氨基酸序列，所述的片段3是來自如SEQ ID No:2所示的Exendin-4蛋白的氨基酸序列。
4.如權利要求1所述的嵌合多肽，其中，所述的嵌合多肽具有如SEQID No:3-SEQ ID No :8之一所示的序列。
5.如權利要求1所述的嵌合多肽，其中，所述的片段1具有如SEQID No :9_SEQ ID No 12之一所示的序列。
6.一種制備如權利要求1-5之一所述的嵌合多肽的方法，其中，所述的嵌合多肽是通過多肽合成技術合成的。
7.一種制備如權利要求1-5之一所述的嵌合多肽的方法，其中，所述的嵌合多肽是通過構建包含編碼所述嵌合多肽的核苷酸序列的表達載體，在基因工程菌株中表達并純化得到。
8.如權利要求7所述的制備嵌合多肽的方法，其中，所述的核苷酸序列通過PCR和/或人工合成的手段得到。
9.如權利要求6或7所述的制備嵌合多肽的方法，其進一步包括對多肽進行化學修飾。
10.如權利要求1-5之一所述的嵌合多肽在制備抗炎和/或降低高血糖的藥物方面的用途。
全文摘要
本發明提供了一種基于凝血酶活性的雙靶向作用的嵌合多肽及其制備方法和應用。本發明的嵌合多肽包括三段片段片段1是HMGB1蛋白從N端計起的20-90個氨基酸序列；片段2是Exendin-4蛋白的氨基酸序列；片段3是片段1和片段2的連接片段，包含凝血酶酶切位點和二肽基肽酶的酶切位點。本發明的制備方法可以是通過多肽合成技術合成或者通過構建包含編碼所述嵌合多肽的核苷酸序列的表達載體，在基因工程菌株中表達并純化得到。本發明的嵌合多肽具有抑制炎癥反應和降低血糖的雙靶向作用，可以應用于制備抗炎和/或降低高血糖的藥物。
文檔編號A61P29/00GK102443064SQ20111034275
公開日2012年5月9日 申請日期2011年11月3日 優先權日2011年11月3日
發明者劉譽 申請人:劉譽